殼聚糖人工淚液治療干眼病實(shí)驗(yàn)研究

王斌 朱婉萍

殼聚糖人工淚液治療干眼病實(shí)驗(yàn)研究

王斌 朱婉萍

目的 探討殼聚糖人工淚液（LCH）治療干眼病的療效、量效及時(shí)效。方法將42只家兔隨機(jī)分為7組，每組6只（12眼），分別為陰性對(duì)照組：滴用0．9%氯化鈉溶液28d；陽(yáng)性對(duì)照組：滴用羧甲基纖維素鈉滴眼液28d；LCH低濃度組：滴用0．15%LCH 28d；LCH中濃度短時(shí)效組：滴用0．3%LCH 14d；LCH中濃度中時(shí)效組：滴用0．3%LCH 21d；LCH中濃度長(zhǎng)時(shí)效組：滴用0．3%LCH 28d；LCH高濃度組：滴用0．6%LCH 28d。用藥結(jié)束后以熒光素及琥紅染色并計(jì)分比較，同時(shí)光鏡及投射電鏡觀察角結(jié)膜的損傷及恢復(fù)情況。結(jié)果與陰性對(duì)照組比較，其他各組用藥后各時(shí)點(diǎn)熒光染色及琥紅染色評(píng)分（除陽(yáng)性對(duì)照組用藥后14d）均發(fā)生明顯變化，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05或0．01）；與用藥前比較，陽(yáng)性對(duì)照組及LCH低、中、高濃度組用藥后各時(shí)點(diǎn)熒光染色及琥紅染色評(píng)分（除陽(yáng)性對(duì)照組用藥后14d）均發(fā)生明顯變化，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05或0．01）。LCH終濃度短時(shí)效、中時(shí)效、長(zhǎng)時(shí)效組用藥后熒光素染色和琥紅染色評(píng)分均明顯低于用藥前，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0．05），但3組間用藥后的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。結(jié)論LCH是一種安全、有效的人工淚液，不僅可以改善干眼癥狀且可以修復(fù)角膜上皮損。

殼聚糖 人工淚液 家兔 干眼 療效

干眼病是一種眼科常見(jiàn)疾病，是一組因淚液分泌低下或其它不明原因引起的淚液異常而導(dǎo)致眼表上皮干變的疾病，主要包括干性角、結(jié)膜炎和Sjogren綜合征兩種類(lèi)型。由于干眼病患者的紅細(xì)胞免疫與淋巴細(xì)胞免疫功能低下呈一致關(guān)系[1]，因此其病因可能與免疫反應(yīng)有關(guān)，但確切病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全明了。目前，干眼病最主要的治療藥物是人工淚液[2]。本研究通過(guò)制作家兔干眼病模型，觀察相同人工淚液不同濃度組及相同濃度人工淚液不同時(shí)效組的治療情況，探討人工淚液的療效、量效及時(shí)效。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康家兔42只（由浙江省中醫(yī)藥研究院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供），雌雄各半，體重1 538～3 142（1781±0.272）g。隨機(jī)分為7組，每組6只（12眼），分別為陰性對(duì)照組：滴用0.9%氯化鈉溶液28d；陽(yáng)性對(duì)照組：滴用羧甲基纖維素鈉滴眼液（商品名：瑞新滴眼液）28d；殼聚糖人工淚液（LCH）低濃度組：滴用0.15% LCH 28d；LCH中濃度短時(shí)效組：滴用0.3%LCH 14d；LCH中濃度中時(shí)效組：滴用0.3%LCH 21d；LCH中濃度長(zhǎng)時(shí)效組：滴用0.3%LCH 28d；LCH高濃度組：滴用0.6%LCH 28d。

1.2 試劑及器材 試劑：3%戊巴比妥，劑量30mg/kg，華東制藥廠生產(chǎn)；50%三氯醋酸，如皋市金陵試劑廠生產(chǎn)；0.9%氯化鈉溶液，杭州民生藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；1%虎紅液，山西晉中開(kāi)發(fā)區(qū)中資化工技術(shù)有限公司生產(chǎn)；1%熒光素鈉，上海三愛(ài)思試劑有限公司生產(chǎn)；瑞新滴眼液，劑量0.5ml/支，美國(guó)眼力健公司生產(chǎn)；LCH由浙江南洋藥業(yè)提供。器材：YZ-5CSⅡ型裂隙燈角膜顯微鏡（蘇州醫(yī)療器械廠生產(chǎn)），日本Olympus C-35AD型數(shù)碼相機(jī)，日本Olympus顯微鏡，日本JEM-200CX透射電鏡，日本JSM-6301掃描電鏡。

1.3 干眼病模型制作 麻醉：以3%戊巴比妥1ml/kg耳緣靜脈注射，用藥量1.468～2.976（1.835±0.517）ml。麻醉后參照賈光學(xué)等[3]介紹的方法并作修改，手術(shù)摘除家兔眼瞬膜和Harder腺、淚腺后，用大頭針端蘸50%三氯醋酸涂抹角膜緣3mm以外的球結(jié)膜，待球結(jié)膜顏色變白時(shí)，即用0.9%氯化鈉溶液緩慢沖洗，陰性對(duì)照組僅作右眼，左眼對(duì)照，其余各治療組則雙眼均作干眼模型。

1.4 檢測(cè)方法 實(shí)驗(yàn)前后均在裂隙燈下檢查角結(jié)膜熒光素和琥紅染色，而后0.9%氯化鈉溶液沖洗。從治療后第2周開(kāi)始每周檢查1次，以數(shù)碼相機(jī)拍攝輸入電腦記錄，直至角結(jié)膜上皮染色完全轉(zhuǎn)陰，為了獲得良好對(duì)照，必要時(shí)用濾玻片（Wratten 12月）遮住物鏡提高清晰度。

1.4.1 熒光素染色評(píng)分 1%熒光素鈉10μl滴入結(jié)膜囊內(nèi)，翻兔眼皮數(shù)次后，裂隙燈鈷藍(lán)光下觀察，全角膜熒光素著染情況，其計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)為：0示無(wú)著染，1分示散在點(diǎn)染，2分示點(diǎn)片染色，3分示密集斑片染色，4分全角膜斑狀染色。最后以各組眼計(jì)分均數(shù)統(tǒng)計(jì)，評(píng)分越高表明角結(jié)膜損傷越重。

1.4.2 琥紅染色 1%琥紅10μl滴入結(jié)膜囊內(nèi)，翻兔眼皮數(shù)次，裂隙燈綠光觀察球結(jié)膜、角膜評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)是：0示無(wú)著染；1分示散在點(diǎn)染；2分示點(diǎn)片著染；3分示斑片密集染；4分示全角膜斑狀染。最后取各組眼計(jì)分均數(shù)統(tǒng)計(jì)，評(píng)分越高表明角結(jié)膜損傷越重。

1.4.3 標(biāo)本制作及光鏡觀察 取角膜及以6mmΦ鞏膜咬切器取下穹隆部瞼結(jié)膜標(biāo)本PAS染色脫水后置于載玻片中自然干燥，采用二甲苯使其透明置于普通光鏡下觀察模型眼及對(duì)照眼角膜上皮細(xì)胞間的連接；胞核、胞質(zhì)的顏色；核、漿比（N/C）上皮細(xì)胞角化；炎性細(xì)胞及杯狀細(xì)胞的計(jì)數(shù)，然后進(jìn)行分析。原則上按NELSON'S分級(jí)：0級(jí)：結(jié)膜上皮細(xì)胞形態(tài)正常，層狀大小一致，胞質(zhì)藍(lán)綠色N/C為1∶2，杯狀細(xì)胞密集分布。目鏡及物鏡10倍下觀察5個(gè)視野分別計(jì)杯狀細(xì)胞數(shù)，取其均值，平均每個(gè)低倍視野下見(jiàn)12個(gè)以上的杯狀細(xì)胞。1級(jí)：結(jié)膜上皮細(xì)胞輕度擴(kuò)大，胞漿藍(lán)綠色，N/C為1∶3，無(wú)角化。杯狀細(xì)胞開(kāi)始減少，密度下降，平均1個(gè)低倍視野下見(jiàn)7.5個(gè)杯狀細(xì)胞。2級(jí)：所有結(jié)膜上皮細(xì)胞均擴(kuò)大，變扁平，胞漿藍(lán)綠或粉紅色，N/C為1∶4～1∶5，輕度角化，杯狀細(xì)胞明顯減少，平均1個(gè)低倍視野下見(jiàn)2.5～3個(gè)杯狀細(xì)胞。3級(jí)：結(jié)膜上皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)顆粒狀物，核固縮崩解，上皮細(xì)胞胞漿呈粉紅色，N/C為1∶6～1∶8，出現(xiàn)不同程度的角化，杯狀細(xì)胞完全喪失，視野下不見(jiàn)杯狀細(xì)胞。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，所得數(shù)據(jù)均以表示，組間比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度組染色檢查結(jié)果 見(jiàn)表1。

由表1可見(jiàn)，與陰性對(duì)照組比較，其他各組用藥后各時(shí)點(diǎn)熒光染色及琥紅染色評(píng)分（除陽(yáng)性對(duì)照組用藥后14d）均發(fā)生明顯變化，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或0.01）；與用藥前比較，陽(yáng)性對(duì)照組及LCH低、中、高濃度組用藥后各時(shí)點(diǎn)熒光染色及琥紅染色評(píng)分（除陽(yáng)性對(duì)照組用藥后14d）均發(fā)生明顯變化，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或0.01）。

2.2 LCH中濃度不同時(shí)效組染色檢查結(jié)果 見(jiàn)表2。

由表2可見(jiàn)，3組用藥后熒光素染色和琥紅染色評(píng)分均明顯低于用藥前，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），3組間用藥后差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

2.3 結(jié)膜上皮光鏡檢查情況 正常情況下結(jié)膜上皮形態(tài)正常，上皮間常見(jiàn)有杯狀細(xì)胞（圖1-2）；陰性對(duì)照組：結(jié)膜上皮層數(shù)增多，角化，杯狀細(xì)胞明顯減少或者消失（圖3）；陽(yáng)性對(duì)照組及LCH組：結(jié)膜上皮形態(tài)正常，上皮間常見(jiàn)有杯狀細(xì)胞（圖4）。結(jié)膜鋪片：正常情況下可見(jiàn)中等數(shù)量的杯狀細(xì)胞，呈蘭色，密度中等（圖5）；陰性對(duì)照組：杯狀細(xì)胞密度明顯減少接近消失；陽(yáng)性對(duì)照組及LCH組：可見(jiàn)呈蘭色的密度中等的杯狀細(xì)胞分布（圖6）。

2.4 角膜掃描電鏡檢查情況 正常情況下角膜上皮細(xì)胞表面的微絨毛和微皺裂排列整齊，可見(jiàn)明亮、中等亮度及深暗三種細(xì)胞（圖7）；陰性對(duì)照組：表層上皮細(xì)胞不規(guī)則，卷曲樣剝脫，分布出三種亮度的細(xì)胞，表層上皮細(xì)胞的微絨毛和微皺裂腫脹和融合，排列紊亂（圖8）；陽(yáng)性對(duì)照組及LCH組：角膜上皮細(xì)胞排列規(guī)則，可見(jiàn)三種亮度的細(xì)胞（圖9）。角膜透射電鏡觀察：空白對(duì)照組，上皮細(xì)胞表面微絨毛和微皺裂形態(tài)正常排列整齊，鄰近細(xì)胞有橋粒連接，可見(jiàn)細(xì)胞核和線立體等（圖10）；模型組，微絨毛腫脹明顯，呈氣球樣變，橋粒解體，線立體腫脹，嵴變短或消失，呈空泡狀（圖11）；陽(yáng)性對(duì)照組，各用藥組，上皮表面微絨毛和微皺裂形態(tài)正常排列整齊，可見(jiàn)橋粒連接（圖12）。

表1 不同濃度組染色檢查結(jié)果

表2 LCH中濃度不同時(shí)效組染色檢查結(jié)果

圖1 結(jié)膜上皮形態(tài)正常，其間可見(jiàn)杯狀細(xì)胞（HE染色，×100）

圖2 杯狀細(xì)胞數(shù)量中等，呈空泡狀（HE染色，×400）

圖3 結(jié)膜上皮層數(shù)增多，杯狀細(xì)胞明顯減少或消失（HE染色，×100）

圖4 結(jié)膜上皮形態(tài)基本正常，其間可見(jiàn)杯狀細(xì)胞（HE染色，×100）

圖5 可見(jiàn)中等數(shù)量的呈蘭色的杯狀細(xì)胞（甲苯胺藍(lán)染色，×200）

圖6 蘭色的杯狀細(xì)胞數(shù)量基本正常（甲苯胺藍(lán)染色，×200）

3 討論

殼聚糖是一種新型天然生物材料，其生物學(xué)特性優(yōu)良，具有良好的生物相容性、生物可降解性，無(wú)毒、無(wú)刺激性，無(wú)致炎性、無(wú)抗原性、無(wú)有害降解產(chǎn)物，且有止血和抑菌作用。目前，殼聚糖在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已被廣泛應(yīng)用，在眼科已被用作藥物轉(zhuǎn)運(yùn)的載體。它是一類(lèi)由2氨基-2脫氧-葡萄糖通過(guò)β-1，4糖甙鍵連接的帶正電荷的直鏈多糖，是甲殼素（自然界中產(chǎn)量?jī)H次于纖維素的天然多糖）的脫乙酰衍生物。其廣泛存在于節(jié)肢動(dòng)物類(lèi)的翅膀和外殼中，也存在于真菌和藻類(lèi)的細(xì)胞壁中，另外還可來(lái)源于有機(jī)酸類(lèi)、抗生素類(lèi)和酶的釀造產(chǎn)物[4]。殼聚糖具有生物可降解性，在生物體內(nèi)可被生物酶如溶菌酶催化緩慢水解解聚，降解產(chǎn)物為對(duì)人體無(wú)毒的N-乙酰氨基葡萄糖和氨基葡萄糖[5]。而且降解過(guò)程中產(chǎn)生的低分子量甲殼胺或其寡聚糖在體內(nèi)不積累，無(wú)免疫原性。

圖7 三種不同亮度的細(xì)胞：明、暗及中等亮（SEM，×1 000）

圖8 表面上皮不規(guī)則，卷曲樣剝脫，分不出三種亮度的細(xì)胞（SEM，×1 000）

圖9 三種不同亮度的細(xì)胞：明、暗及中等亮，基本可見(jiàn)（SEM，×1 000）

圖10 上皮細(xì)胞內(nèi)各種正常的細(xì)胞器可見(jiàn)，相鄰細(xì)胞間有橋粒連接（TEM，×10 000）

圖11 微絨毛腫脹明顯，呈氣球樣變，橋粒解體（TEM，× 15 000）

圖12 相鄰細(xì)胞間的橋粒結(jié)構(gòu)可見(jiàn)，小線粒體出現(xiàn)（TEM，× 15 000）

目前，多項(xiàng)研究證明了殼聚糖在眼部的生物相容性很好，對(duì)眼組織無(wú)毒性，用于眼部是安全的。Felt等[6]將殼聚糖溶液滴于角膜表面，角膜熒光素染色后采用激光掃描儀觀察，角膜對(duì)殼聚糖的耐受性良好。Genta等[7]在滴眼液中加入殼聚糖，用于兔眼，未見(jiàn)任何刺激癥狀及不適。Di Colo等[8]對(duì)含殼聚糖的植入物在眼部的作用進(jìn)行研究，未發(fā)現(xiàn)結(jié)膜充血、角膜水腫等眼部刺激癥狀，對(duì)角膜內(nèi)皮細(xì)胞活性、晶狀體上皮、視網(wǎng)膜組織學(xué)形態(tài)均無(wú)明顯影響，對(duì)參與晶狀體及視網(wǎng)膜代謝的酶如乳酸脫氫酶、琥珀酸脫氫酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶活性均無(wú)明顯影響，說(shuō)明殼聚糖不會(huì)造成眼部組織缺氧、損傷，對(duì)眼部無(wú)毒性。而且，殼聚糖具有親水性、黏彈性、黏滯性等獨(dú)特物理特性，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，與角膜和房水具有相同的滲透壓，并有良好的光學(xué)性能，不妨礙視力。因此，醫(yī)用殼聚糖在眼科的應(yīng)用前景廣闊。

殼聚糖是自然界唯一的一種表面帶有多價(jià)陽(yáng)離子的天然高分子材料，其生物學(xué)特性優(yōu)良，具有抗微生物活性、止血、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能及抗腫瘤、調(diào)節(jié)膽固醇代謝、降血壓及降血糖、促進(jìn)傷口愈合、抑制瘢痕形成等作用[9]，已廣泛用于制造人工皮膚、可吸收縫線、止血材料、抗粘連劑、藥物載體等[10]。其所特有的理化性質(zhì)已成為醫(yī)藥界及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[11]。作為陽(yáng)離子性的生物高聚物，殼聚糖分子中含有許多極性基團(tuán)，具有良好的吸水性和成膜性，溶于水中形成具有黏滯性的大分子膠體溶液，而且本身又具有消炎、抑菌、止血及良好的生物相容性。因此，殼聚糖可被用作人工淚液。Felt等[12]發(fā)現(xiàn)，采用殼聚糖作為人工淚液，與常用的人工淚液作用時(shí)間相同，但黏滯性為后者的1/5；同時(shí)發(fā)現(xiàn)低分子量的殼聚糖對(duì)大腸桿菌的最小抑菌濃度為0.375mg/ml，對(duì)葡萄球菌的最小抑菌濃度0.15mg/ml?？梢?jiàn)以殼聚糖作為淚液替代品，不僅可改善干眼癥患者的癥狀，而且具有良好的抑菌功能。用殼聚糖、聚乙烯山梨醇、油酸脂加防腐劑氯代丁醇配制的等滲溶液作為人工淚液，用于無(wú)淚液患者和干燥性角膜結(jié)膜炎，效果明顯優(yōu)于甲基纖維素制成的人工淚液。另外，殼聚糖具有良好的生物相容性、可降解性、生物活性，可以加工成用于細(xì)胞移植和組織再生的多孔結(jié)構(gòu)支架，提供細(xì)胞生長(zhǎng)所需的三維生長(zhǎng)支架，創(chuàng)造類(lèi)似細(xì)胞基質(zhì)的環(huán)境，維持細(xì)胞表型及功能[13]。還可以促進(jìn)組織修復(fù)及傷口愈合、抑制瘢痕形成，因此殼聚糖除了可用于眼外傷外，還可用于眼部整形。由于殼聚糖是天然產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)和部分理化性質(zhì)仍不完全清楚。

研究表明，分子量和脫乙?；潭葘?duì)殼聚糖的性質(zhì)影響較大，而現(xiàn)有的生產(chǎn)技術(shù)尚無(wú)法獲得均一脫乙?；潭群头肿恿康漠a(chǎn)物，使其大規(guī)模生產(chǎn)受到限制。而殼聚糖的降解屬酶解過(guò)程以及體內(nèi)降解機(jī)制尚未完全清楚，使其降解時(shí)間也難以精確控制。本研究結(jié)果表明，殼聚糖人工淚液是一種安全、有效的人工淚液，不僅可以改善干眼癥狀且可以修復(fù)角膜上皮損，而且效果優(yōu)于甲基纖維素制成的人工淚液。目前的大多數(shù)研究還處于體外和動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)階段，要想成為臨床常用劑型，還需要大量的臨床試驗(yàn)和深入研究。相信隨著對(duì)殼聚糖藥學(xué)、藥理、毒理和臨床應(yīng)用研究的深入，殼聚糖在生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用會(huì)更廣泛，在眼科的應(yīng)用也會(huì)得到進(jìn)一步開(kāi)發(fā)。

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Experimental treatment of rabbit dry eye with chitosan artificial tears

Objective To assess the efficacy of chitosan artificial tears (LCH)in treatment of dry eye in rabbits．MethodsForty two rabbits were randomly divided into 7 groups with 6 (12 eyes)in each．In negative control group 0．9%saline drops were given for 28 d,in positive control group carboxymethyl cellulose sodium eye drops for 28 d;in low dose chitosan artificial tears (LCH)group 0．15%LCH for 28 d;in short-term LCH group 0．3%LCH for 14 d;in medium-term medium-dose LCH group 0．3% LCH for 21 d,in long-term medium-dose LCH group 0．3%LCH drop for 28 d,in high-dose long-term LCH group:0．6%LCH drop for 28 d．After the medication the eyes were stained with fluorescein and Hu red staining and scored;the optical and electron microscope were applied to observe the projection angle of conjunctival injury and recovery．ResultsCompared with negative control group,the fluorescence staining and Hu red staining scores (except the positive control group after 14d)were changed significantly after treatment(P＜0．05 or 0．01)．Compared with before medication,the fluorescence staining and Hu red staining scores(except the positive control group after 14 d)in positive control group and LCH low,medium and high concentration groups were changed significantly(P＜0．05 or 0．01)．The fluorescein staining and Hu red staining scores in short-,mediumand long-term group after treatment were significantly lower than before treatment(all P＜0．05),and there was no significant difference among three groups (P＞0．05)．ConclusionChitosan artificial tears is safe and effective in improvement of symptoms and repair of corneal epithelia for dry eye．

Chitosan Artificial tear mytear Rabbit Dry eye Curative effect

2013-10-23）

（本文編輯：歐陽(yáng)卿）

310012 杭州，浙江省立同德醫(yī)院眼科（王斌），中醫(yī)臨床研究所（朱婉萍）