右美托咪定對(duì)犬體外循環(huán)后肺血管通透性的影響

楊小平 王穎 屈獻(xiàn)鋒 徐傳華 鐘橋生 楊禮

右美托咪定對(duì)犬體外循環(huán)后肺血管通透性的影響

楊小平 王穎 屈獻(xiàn)鋒 徐傳華 鐘橋生 楊禮

目的 探討右美托咪定對(duì)犬體外循環(huán)（CPB）后肺血管通透性的影響。方法成年健康雜種犬54只，按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組（C組）、CPB組（CPB組）和右美托咪定組（Dex組），每組18只。制備CPB誘發(fā)肺損傷模型，Dex組于CPB前即刻靜脈泵注右美托咪啶1μg/（kg·min），隨即予以1μg/（kg·h）持續(xù)泵注至實(shí)驗(yàn)結(jié)束；CPB組給予等量0．9%氯化鈉溶液；C組不進(jìn)行CPB，其余操作與CPB組相同。分別于CPB前（T0）、CPB結(jié)束后30min（T1）、60min（T2）時(shí)采集動(dòng)脈血樣，測定呼吸指數(shù)（RI）、支氣管肺泡灌洗液（BALF）中白細(xì)胞計(jì)數(shù)、總蛋白含量及TNF-α、IL-6濃度；測定肺組織伊文思藍(lán)（EB）含量和肺濕/干質(zhì)量比；光鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化。結(jié)果與C組比較，CPB組和Dex組RI升高，BALF白細(xì)胞計(jì)數(shù)、總蛋白含量及TNF-α、IL-6濃度、EB含量和肺濕/干質(zhì)量比升高（P＜0．05）；與CPB組比較，Dex組上述指標(biāo)均降低（P＜0．05）；C組肺組織結(jié)構(gòu)清晰，未見明顯肺損傷；CPB組顯示明顯的肺部炎癥反應(yīng)，肺泡壁明顯充血，肺泡隔增寬，Dex組病理學(xué)損傷程度較CPB組明顯減輕。結(jié)論右美托咪定可明顯降低CPB后肺血管通透性，其機(jī)制與減輕CPB后肺組織炎性反應(yīng)有關(guān)。

右美托咪啶 體外循環(huán) 肺損傷 炎癥

體外循環(huán)（CP月）?？烧T發(fā)肺損傷，重者可發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征[1]，急性肺損傷是心臟外科術(shù)后死亡的重要原因之一[2]。CP月過程中釋放的大量炎癥介質(zhì)、活性氧及蛋白酶，可直接或間接損傷肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，引起肺毛細(xì)血管通透性增高[3]，其與肺泡水腫在急性呼吸窘迫綜合征的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[4]，因此，降低肺毛細(xì)血管通透性是防治CP月后肺損傷的有效手段。右美托咪定是一種高選擇性α2-腎上腺能受體激動(dòng)劑，具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛和抗交感神經(jīng)活性。有研究表明，右美托咪定還具有明顯的抗炎作用[5]，但其是否能通過抑制CP月后肺組織炎性反應(yīng)降低CP月后肺毛細(xì)血管通透性尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究擬探討右美托咪定對(duì)CP月后肺毛細(xì)血管通透性的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 成年健康雜種犬54只，雌雄不限，體重15～16kg，年齡1.5～2.0歲；由浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[動(dòng)物許可證編號(hào)：SYXK（浙2007-0099）]，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)12h，自由飲水。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組（C組）、體外循環(huán)組（CP月組）和右美托咪定組（Dex組），每組18只。

1.2 動(dòng)物麻醉 腹腔注射2%戊巴比妥鈉30mg/kg麻醉，將犬仰臥位固定于恒溫操作臺(tái)，氣管內(nèi)插管，連接AH-Ⅱ型動(dòng)物呼吸機(jī)（北京宏潤達(dá)科技發(fā)展有限公司）行機(jī)械通氣，容量控制通氣，潮氣量（VT）12ml/kg，吸入氧濃度（FiO2）1.0，根據(jù)血?dú)夥治鼋Y(jié)果調(diào)整呼吸頻率（RR），維持PaCO235～40mmHg。股動(dòng)脈和股靜脈分別穿刺置管，接Intellivue MP50型多功能監(jiān)測儀（荷蘭Philips公司）監(jiān)測MAP和CVP，股靜脈持續(xù)輸注芬太尼100μg/（kg·min），間斷注射維庫溴銨（0.1mg/kg）維持麻醉。

1.3 模型制備與處理 參照文獻(xiàn)[6]的方法改良制備犬CP月肺損傷模型。胸骨正中劈開，剪開心包，靜脈注射肝素3mg/kg后，右鎖骨下動(dòng)脈和右心房分別插管，連接TP月20570型CP月機(jī)（瑞典Jostra公司）及HILITE幼兒型膜式氧合器（北京米道斯醫(yī)療機(jī)械有限公司）和動(dòng)脈、靜脈管道，建立CP月，流量125ml/（kg·min），并循環(huán)5min后開始降溫，10 min后鼻溫降至25℃，流量調(diào)至35ml/（kg·min），維持MAP 35～45mmHg，持續(xù)正壓通氣（CPAP）10cmH2O，F(xiàn)iO20.21，維持 60min后復(fù)溫，流量恢復(fù)至125ml/（kg·min），容量控制通氣，VT 12ml/kg，F(xiàn)iO21.0，10 min后鼻溫升至37°C停止CP月。停機(jī)時(shí)所有動(dòng)物予以1∶1 000腎上腺素0.1ml/kg、多巴胺10μg/（kg· min）靜脈泵入，繼續(xù)維持60min后處死動(dòng)物，實(shí)驗(yàn)結(jié)束。Dex組于CP月開始前經(jīng)股靜脈泵注右美托咪定（批號(hào)：12052134，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司），參照文獻(xiàn)[7]采用右美托咪定1μg/kg，泵注10min，隨即予以1μg/（kg·h）持續(xù)泵注至實(shí)驗(yàn)結(jié)束；CP月組給予等容量0.9%氯化鈉溶液；C組不進(jìn)行CP月，其余操作與CP月組相同。

1.4 動(dòng)脈血?dú)夥治?分別于CP月前（T0）、CP月結(jié)束后30min（T1）、CP月結(jié)束后60min（T2）時(shí)股動(dòng)脈采血2ml，采用GEMpremier TM3000型血?dú)夥治鰞x（美國Instrumentation Laboratory公司）進(jìn)行血?dú)夥治?，?jì)算呼吸指數(shù)（RI），RI=P（A-a）DO2/PaO2，P（A-a）DO2=（P月-PH2O）× FiO2-PaCO2-PaO2，其中：P月=760mmHg，PH2O為室溫下飽和水蒸氣壓，PH2O=47mmHg。

1.5 支氣管灌洗液（月ALF）中白細(xì)胞計(jì)數(shù)、總蛋白濃度、TNF-α、IL-6濃度測定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后放血處死實(shí)驗(yàn)犬6只，結(jié)扎左肺門支氣管和血管，取出整個(gè)右肺組織，經(jīng)氣管導(dǎo)管向右肺注入4℃0.9%氯化鈉溶液5ml，反復(fù)肺灌洗5次，回收量＞95%，收集月ALF。（1）送檢驗(yàn)科，采用XT-1800型全自動(dòng)血球儀（日本Sysmex公司）按五分類法行白細(xì)胞計(jì)數(shù)；（2）取1.5ml月ALF，4℃2 500g離心10min取上清液，采用考馬斯亮藍(lán)染色（月radford）法進(jìn)行蛋白定量，嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作；（3）取上清液，采用ELISA法檢測月ALF中TNF-α、IL-6濃度，嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作。

1.6 肺血管通透性測定 測定肺組織伊文思藍(lán)（E月）含量和肺濕/干質(zhì)量比（W/D）評(píng)定肺血管通透性。（1）肺組織E月含量測定：實(shí)驗(yàn)結(jié)束前，各組取6只犬，由肺動(dòng)脈注射2%E月（美國Sigma公司）20mg/kg，注射15min后，剪開左心房，從肺動(dòng)脈穿入注射器針頭，以等滲鹽水灌洗直至左心房流出清亮液體為止，放血處死。取左全肺，剪左下肺組織約3g，稱重后置潔凈小瓶中，按3ml/ 100mg濕肺組織加入純甲酰胺，37℃避光孵育24h，4℃5 000g離心20min，取上清液，采用月eckmanDU800（美國月eckman公司）可見光分析儀在波長620nm處測定甲酰胺溶液的OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)應(yīng)的濃度計(jì)算每克濕肺組織的E月含量。（2）W/D測定：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后放血處死實(shí)驗(yàn)犬，處死后即刻開胸取右肺，用紗布拭去表面血漬，采用電子分析天平稱肺濕質(zhì)量，然后置入60℃恒溫烤箱72h，測量肺干質(zhì)量，計(jì)算出W/D。

1.7 肺組織病理學(xué)觀察 取左肺下葉組織，4%多聚甲醛固定，自動(dòng)脫水機(jī)脫水24h，石蠟包埋、切片、溫箱烘干，HE染色后在DM 1000顯微鏡（德國Leica公司）下觀察并攝片，觀察肺組織病理學(xué)結(jié)構(gòu)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 3組犬肺各時(shí)點(diǎn)RI的比較 見表1。

由表1可見，與T0時(shí)比較，CP月組和Dex組T1、T2時(shí)RI均升高（P＜0.05）；與C組比較，CP月組和Dex組T1、T2時(shí)RI均升高（P＜0.05）；與CP月組比較，Dex組T1、T2時(shí)RI降低（P＜0.05）。

2.2 3組犬月ALF中白細(xì)胞計(jì)數(shù)、總蛋白濃度、TNF-α濃度、IL-6濃度的比較 見表2。

由表2可見，與C組比較，CP月組和Dex組月ALF中白細(xì)胞計(jì)數(shù)、總蛋白濃度、TNF-α、IL-6濃度均升高（均P＜0.05）；與CP月組比較，Dex組月ALF中白細(xì)胞計(jì)數(shù)、總蛋白濃度、TNF-α、IL-6濃度均降低（均P＜0.05）。

2.3 3組犬肺組織W/D、E月含量的比較 見表3。

表1 3組犬肺各時(shí)點(diǎn)RI的比較

表2 3組犬BALF中白細(xì)胞計(jì)數(shù)、總蛋白濃度、TNF-α、IL-6濃度的比較

表3 3組犬肺組織W/D、EB含量的比較

由表3可見，與C組比較，CP月組和Dex組肺組織W/D、E月含量明顯升高（P＜0.05）；與CP月組比較，Dex組肺組織W/D、E月含量明顯降低（P＜0.05）。

2.4 3組肺組織病理學(xué)檢查 見圖1。

由圖1可見，光鏡下C組肺組織未見明顯的病理改變，肺泡間隔正常，肺泡腔無明顯滲出，內(nèi)偶見炎性細(xì)胞及巨噬細(xì)胞；CP月組肺組織結(jié)構(gòu)紊亂、肺泡腔內(nèi)可見水腫液，甚至出現(xiàn)大量紅細(xì)胞，肺泡壁明顯充血，肺泡隔增寬，大量炎性細(xì)胞浸潤；Dex組肺泡壁增厚及局灶性肺間質(zhì)水腫，中性粒細(xì)胞浸潤程度較輕，肺部炎癥明顯減輕。

圖1 3組犬肺組織病理學(xué)檢查所見（A：C組；B：CPB組；C：Dex組；HE染色，×200）

3 討論

本研究參照文獻(xiàn)[6]改良制備犬CP月誘發(fā)肺損傷模型，結(jié)果顯示，犬CP月后RI明顯升高，且肺組織發(fā)生了明顯的病理學(xué)損傷，提示CP月誘發(fā)肺損傷模型制備成功。參照文獻(xiàn)[7]選擇右美托咪定以負(fù)荷劑量1μg/kg，后以1μg/（kg·h）速率靜脈泵注至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，結(jié)果表明，Dex組CP月后RI明顯降低，肺病理學(xué)損傷明顯減輕，提示右美托咪定可減輕CP月后肺損傷。

肺毛細(xì)血管通透性增加，使炎性細(xì)胞、炎癥因子及補(bǔ)體在肺內(nèi)聚集，介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，大量血漿蛋白和活性物質(zhì)從毛細(xì)血管滲漏到肺泡，造成肺泡水腫。肺毛細(xì)血管通透性增加和肺泡水腫可直接導(dǎo)致急性呼吸窘迫綜合征的發(fā)生[8]。E月是小分子指示劑，可通過受損的肺毛細(xì)血管進(jìn)入肺組織，測定肺組織E月含量可反映肺毛細(xì)血管通透性程度，而W/D在一定程度可以評(píng)價(jià)肺損傷的嚴(yán)重程度。本研究結(jié)果表明，犬CP月后肺組織E月含量和肺含水量增加，說明CP月后肺毛細(xì)血管通透性增加，肺水腫嚴(yán)重；給予右美托咪定后，E月含量和肺含水量顯著降低，說明右美托咪定可以明顯降低CP月后肺毛細(xì)血管通透性，減輕CP月后肺損傷程度。

TNF-α是公認(rèn)的炎癥介質(zhì)產(chǎn)生的始動(dòng)因子，在CP月過程中持續(xù)升高，在CP月結(jié)束后2h達(dá)高峰[9]，具有啟動(dòng)和介導(dǎo)炎性反應(yīng)的重要作用[10]，導(dǎo)致CP月后肺血管通透性增加和肺組織水腫。IL-6可通過誘導(dǎo)最初的炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)，增加肺毛細(xì)血管通透性。本研究結(jié)果表明，與CP月組比較，Dex組月ALF中TNF-α、IL-6濃度明顯降低，提示右美托咪定可以明顯減輕CP月后肺組織炎性反應(yīng)。CP月過程中肺泡內(nèi)大量中性粒細(xì)胞扣押，也是CP月后肺損傷發(fā)生、發(fā)展關(guān)鍵的細(xì)胞，本研究結(jié)果表明右美托咪定能夠顯著降低月ALF中白細(xì)胞計(jì)數(shù)，減輕炎癥細(xì)胞對(duì)肺毛細(xì)血管的損傷，從而間接保護(hù)肺毛細(xì)血管通透性。

綜上所述，右美托咪定可有效降低CP月后肺血管通透性，其機(jī)制與抑制CP月后肺組織TNF-α和IL-6等炎癥因子的產(chǎn)生與釋放，降低肺泡中性粒細(xì)胞浸潤有關(guān)。但右美托咪定究竟通過何種炎癥信號(hào)通路減輕CP月肺組織炎性反應(yīng)，筆者將進(jìn)一步研究。

[1]Asimakopoulos G,Smith P L,Ratnatunga C P,et al．Lung injury and acute respiratory distress syndrome after cardiopulmonary bypass[J]．Ann Thorac Surg,1999,68(3):1107-1115．

[2]Canet J,Gallart L,Gomar C,et al．Prediction of postoperative pulmonary complications in a population-based surgical cohort [J]．Anesthesiology,2010,113(6):1338-1350．

[3]Apostolakis E E,Koletsis E N,Baikoussis N G,et al．Strategies to prevent intraoperative lung injury during cardiopulmonary bypass [J]．J Cardiothorac Surg,2010,5(1):1．

[4]Bellingan G J．The pulmonary physician in critical care:The pathogenesis of ALI/ARDS[J]．Thorax,2002,57(6):540-546．

[5]Sezer A,Memis D,Usta U,et al．The effect of dexmedetomidine on liver histopathology in a rat sepsis model:an experimental pilot study[J]．Ulus Travma Acil Cerrahi Derg,2010,16(2):108．

[6]Williams E,Welty S,Geske R,et al．Liquid lung ventilation reduces neutrophil sequestration in a neonatal swine model of cardiopulmonary bypass[J]．AM J Crit Care Med,2001,29(4):789-795．

[7]Villela,Nascimento J R,Carvalhoe COL,et al．Effects of Dexmedetomidine on Renal System and on Vasopressin Plasma Levels Experimental Study in Dogs[J]．Rev Bras Anestesiol,2005, 55(4):429-440．

[8]Raghavendran K,Pryhuber G S,Chess P R,et al．Pharmacotherapy of acute lung injury and acute respiratory distress syndrome [J]．Curr Med Chem,2008,15(19):1911-1924．

[9]Goebel U,Siepe M,Mecklenburg A,et al．Reduced pulmonary inflammatory response during cardiopulmonary bypass:effects of cornbined pulmonary perfusion and carbon monoxide inhalation [J]．Eur J Cardiothorac Surg,2008,34(6):1165-1172．

[10]Chen K B,Uehida K,Nakajima H,et al．Tumornecrosis factor-a antagonist reduce Apoptosis of neurons and digodendrodia in rat spinal cord inury[J]．Spine,2011,36(17):1350-1358．

Effects of dexmedetomidine on pulmonary vascular permeability of lung injury induced by cardiopulmonary bypass in dog

Objective To assess the protective effect of dexmedetomidine on the pulmonary vascular permeability of the lung injury induced by cardiopulmonary bypass(CPB)in dogs．MethodsFifty four adult mongrel dogs weighted 15-16 kg，were divided into 3 groups(n=18 in each)randomly:control group(group C),CPB group(group CPB)and dexmedetomidine group (group Dex)．The lung injury was induced by CPB in groups CPR and Dex;in group Dex 1μg/kg dexmedetomidine was intravenously injected immediately before CPB，followed by intravenous infusion at 1μg/kg·h until the end of the experiment;in group CPB,the same volume of normal saline was injected．Blood samples were taken from the femoral artery before CPB(T0),30 and 60 min after the termination of CPB(T1and T2)．Six animals were sacrificed at each time point．Respiratory index(RI)and the leucocyte count,albumin,TNF-α,IL-6 in bronchoalveolar lavage fluid(BALF)were measured;Evan'S blue(EB)content and the lung W/D weight ratio were determined subsequently．The pathological changes of lung tissues were observed with light microscopy．ResultsThe RI,leucocyte count,albumin,TNF-α,IL-6 levels in BALF,EB content and the lung W/D weight ratio were significantly higher in groups CPB and Dex than those in group C．The above parameters in group Dex were significantly lower than those in group CPB．The pathological examination showed that lung injury was attenuated in group Dex compared with group CPB．ConclusionDexmedetomidine can reduce pulmonary vascular permeability induced by CPB,which may be associated with the attenuation of inflammatory response in the lung tissues．

Dexmedetomidine Cardiopulmonary bypass Lung injury Inflammatory

2013-08-29）

（本文編輯：嚴(yán)瑋雯）

318000 臺(tái)州市立醫(yī)院麻醉科

屈獻(xiàn)鋒，E-mail：dragon761019@163.com