與腎小管上皮轉分化相關的miRNA的初步篩選

邵駕宇 章慧娣 潘嘉林 尤小寒 薛向陽 黃朝興

●論 著

與腎小管上皮轉分化相關的miRNA的初步篩選

邵駕宇 章慧娣 潘嘉林 尤小寒 薛向陽 黃朝興

目的 觀察miRNA在大鼠腎小管上皮細胞（NRK-52E）發(fā)生上皮-肌成纖維細胞轉分化（EMT）過程中的變化，篩選與腎小管上皮細胞轉分化相關的miRNA。方法體外培養(yǎng)NRK-52E，用5 ng/ml轉化生長因子-β1（TGF-β1）分別作用0、3、6、12、24、48 h，以0 h為空白組（BC組），余為TGF-β1組。倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)學變化；real-time PCR法檢測細胞內α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、E鈣蛋白（E-cad）、1型膠原（ColⅠ）和纖連蛋白（FN）的mRNA表達水平；Western blot法檢測細胞內α-SMA的表達水平；ELISA法檢測上清液中FN的含量；莖環(huán)實時熒光定量PCR法檢測6條miRNA在細胞內的表達水平。結果與BC組比較，TGF-β1組部分細胞失去原有的鵝卵石形態(tài)，轉變成成纖維細胞特有的梭形；細胞內α-SMA、ColⅠ和FN的mRNA表達上調，E-cad的mRNA表達下調，細胞內α-SMA表達量增多，細胞上清液中FN含量升高（均P＜0.05）；miR-30d、miR-132和miR-21的表達上調，miR-200b、miR-192和miR-10b的表達下調（均P＜0.05）。結論TGF-β1可誘導NRK-52E發(fā)生EMT。miR-30d、miR-132、miR-21、miR-200b、miR-192和miR-10b可能參與大鼠腎小管上皮細胞EMT，值得進一步研究。

大鼠腎小管上皮細胞 腎小管上皮轉分化 轉化生長因子-β1 microRNA

腎間質纖維化（renal interstitial fibrosis，RIF）的基本病理特征是細胞外基質（extracellular matrix，ECM）在腎間質大量堆積。腎小管上皮細胞-肌成纖維細胞轉分化（epithelial-myofibroblast transdifferentiation，EMT）是造成ECM堆積的主要原因之一。目前已有一些動物實驗顯示部分miRNA參與腎小管上皮細胞EMT。我們在前期的動物體內實驗基礎上，以體外培養(yǎng)的大鼠腎小管上皮細胞（NRK-52E）為研究對象，在轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）作用下，觀察miR-132、miR-21、miR-10b、miR-200b、miR-192和miR-30d這6條miRNA在NRK-52E發(fā)生EMT過程中的改變，以期認識這些miRNA是否參與調控腎小管上皮細胞分泌ECM的過程。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑 NRK-52E（購自中科院上海細胞庫），DMEM高糖培養(yǎng)液、0.25%胰蛋白酶-EDTA和胎牛血清（均購自美國GIBCO公司），人類重組TGF-β1（購自美國R&D公司），Trizol提取液（購自美國Invitrogen公司），逆轉錄試劑盒（購自加拿大MBI Fermentas公司），SYBR GreenⅠMix（購自美國Roche公司），Real time PCR引物（購自上海Invitrogen公司），α-SMA抗體及GAPDH抗體（購自美國Abcam公司），大鼠纖連蛋白ELISA試劑盒（購自上海西塘生物科技公司）。

1.2 NRK-52E的培養(yǎng) 用含8%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液在37℃，5%CO2的孵育箱中培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化，隔天換液，2～3 d傳代。

1.3 TGF-β1誘導轉分化 細胞接種于培養(yǎng)皿后，生長至50%～60%融合狀態(tài)時,換成無血清DMEM高糖培養(yǎng)液同步化處理16h，用含5ng/ml TGF-β1的DMEM高糖培養(yǎng)液分別培養(yǎng)0、3、6、12、24、48h，將TGF-β1作用0h的細胞設為空白對照組（BC組），將TGF-β1作用3、6、12、24、48h的細胞設為TGF-β1組。

1.4 real-time PCR檢測α-SMA、E-cad、Col I、FN的miRNA表達水平 分別于TGF-β1作用細胞0、3、6、12、24h時在培養(yǎng)皿中加入1 ml Trizol裂解細胞，氯仿萃取，異丙醇濃縮過夜，得總RNA，分光光度計測RNA純度，甲醛變性凝膠電泳質檢RNA質量。取1μg總RNA，按照Fermentas Reverse Transcription Kit逆轉錄成cDNA，再用Roche LightCycler 480實時熒光定量PCR儀進行擴增，反應條件：95℃5min預變性，95℃10s變性，58℃10s退火，72℃10s延伸，45個循環(huán)。技術重復3次，生物學重復6次。以GAPDH為內參進行歸一化。樣品目的基因的相對表達率采用△△Ct方法計算，目的基因的相對量=

1.5 Western blot法檢測細胞內α-SMA表達水平 分別于TGF-β1作用細胞0、12、24、48h時裂解細胞提取蛋白，BCA法測蛋白濃度，各組上樣30μg行10%SDSPAGE電泳，轉膜，5%脫脂牛奶封閉2h，一抗（α-SMA抗體1∶500）4℃孵育過夜，TBS-T溶液洗膜3次，每次10min。室溫下加入IgG抗體（1∶4 000）孵育1.5h，洗膜3次，用Odyseyy近紅外雙色激光成像系統(tǒng)選擇800通道進行掃描條帶，以GAPDH為內參標化α-SMA表達，生物學重復6次，技術重復3次，用AlphaEaseFC凝膠成像分析軟件進行半定量分析。

1.6 ELISA法檢測上清液中FN的含量 分別于TGF-β1作用細胞0、12、24、48h時收集細胞上清液，4℃，4 000g×5min離心，吸取上清液，用大鼠FN ELISA試劑盒檢測各濃度點的蛋白分泌量。生物學重復6次，技術重復3次。

1.7 莖環(huán)Real-time PCR檢測miRNA的表達水平 取1μg總RNA，按照Fermentas Reverse Transcription Kit加入逆轉錄莖環(huán)引物逆轉錄成cDNA，再用Roche LightCycler 480實時熒光定量PCR儀進行擴增，反應條件：95℃5min預變性，95℃10s變性，58℃10s退火，72℃10s延伸，45個循環(huán)，技術重復3次，生物學重復6次。以U6 RNA為內參進行歸一化。樣品目的基因的相對表達率采用△△Ct方法計算，方法同上。

1.8 統(tǒng)計學處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件，計量數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 NRK-52E形態(tài)學改變 TGF-β1作用0、3、6、12h，細胞呈腎小管上皮細胞原有的卵圓形“鋪路石”形狀；TGF-β1作用24h，部分細胞拉長呈梭形改變；TGF-β1作用48h，更多細胞呈梭形改變，部分細胞凋亡，見圖1。

2.2 α-SMA、E-cad、Col I和FN的mRNA表達水平的變化 與BC組比較，TGF-β1組各時點細胞內肌成纖維細胞標志物α-SMA的mRNA表達上調而上皮細胞標志物E-cad的mRNA表達均下調（均P＜0.05）；細胞內Col I和FN的mRNA的表達均上調（均P＜0.05），且呈時間依賴性，見表1。

表1 TGF-β1作用不同時間NRK-52E細胞內α-SMA、E-cad、Col I和FN的mRNA的表達水平變化

2.3 細胞內α-SMA表達水平的變化 與BC組比較，TGF-β1組各時點細胞內α-SMA的表達量均明顯升高（均P＜0.05），在TGF-β1作用24 h時達峰值2.24±0.55，見圖2。

圖1 TGF-β1作用不同時間NRK-52E的形態(tài)改變

圖2 TGF-β1作用不同時間NRK-52E內α-SMA的表達水平變化

2.4 上清液FN含量的變化 上清液FN含量0h為1.0±0，12、24、48h分別為1.11±0.03、1.32±0.20、1.55±0.15。與BC組比較，TGF-β1組上清液FN的含量均明顯升高（均P＜0.05），且呈時間依賴性。

2.5 miRNA的表達水平變化 與BC組比較，TGF-β1組6條miRNA的表達均存在差異。TGF-β1作用3、6、12、24h后，miR-30d、miR-132和miR-21的表達上調，其中miR-30d和miR-132表達上調呈時間依賴性（P＜0.05）；miR-200b、miR-192和miR-10b的表達均下調，其中miR-192在TGF-β1作用12h達最低值（P＜0.05），見表2。

3 討論

我們在前期工作中通過大鼠單側輸尿管梗阻（UUO）及5/6腎切除兩種RIF模型，采用real-time PCR法篩選了與RIF相關的部分miRNA，其中比較一致的6條miRNA（miR-30d、miR-132、miR-21、miR-200b、miR-192和miR-10b）被選為本研究篩選對象[1]。

表2 TGF-β1作用不同時間miRNA在NRK-52E細胞內表達水平的比較

本研究中TGF-β1組部分細胞肥大，拉長，失去原有的鵝卵石形態(tài)，向成纖維細胞特有的梭形發(fā)展，細胞內上皮細胞黏附分子E-cad的mRNA表達明顯下降，肌成纖維細胞標志物α-SMA的mRNA表達明顯上調，以及纖維化指標ColⅠ和FN的mRNA表達均上調且呈時間依賴性，細胞內α-SMA表達水平升高和上清液中FN含量升高，以上各點提示本實驗造模成功，證實TGF-β1可誘導體外培養(yǎng)的NRK-52E發(fā)生轉分化，促進合成和分泌ECM。

本研究TGF-β1組有3條miRNA（miR-30d、miR-132、miR-21）表達上調，3條miRNA（miR-200b，miR-192、miR-10b）表達下調，其中miR-30d和miR-132的表達變化，與ColⅠ和FN的mRNA的表達一樣，都具有TGF-β1作用的時間依賴性。提示這些miRNA參與TGF-β1誘導體外培養(yǎng)的NRK-52E轉分化發(fā)生過程，促進ECM的合成和分泌。

miR-132表達受cAMP反應元件結合蛋白（CREB）調控[2]。Kriegel等[3]研究發(fā)現(xiàn)人腎小管上皮細胞經(jīng)TGF-β1刺激后miR-132表達上調；Stachurska等[4]研究顯示在赭曲霉素A作用下，豬腎近曲小管細胞（LLC-PK1）內TGF-β1和TGF-β2的miRNA和miR-132表達均上調，而抑制miR-132表達可抑制TGF-β2 miRNA表達，均提示miR-132促纖維化。我們前期的研究結果顯示，在大鼠UUO和5/6腎切除模型腎組織中miR-132均呈高表達[1]，用TGF-β1作用大鼠腎間質成纖維細胞（NRK-49F）后，miR-132及ColⅠmRNA表達上調，轉染miR-132類似物至NRK-49F可上調ColⅠmRNA的表達，提示miR-132促進RIF[5]。本研究中TGF-β1組miR-132呈高表達，且與ColⅠ和FN的mRNA表達上調一樣，具有TGF-β1作用的時間依賴性，推測miR-132通過作用EMT相關的靶基因參與EMT的調控，其中miR-132與ColⅠ和FN的相關性值得進一步研究。

關于miR-30d的研究則集中于腫瘤領域[6-9]。EMT作為腫瘤細胞發(fā)生和轉移的重要分子機制，在腫瘤細胞的形態(tài)改變、遷移、侵襲等生物學行為中起關鍵作用。Yao等[8]研究發(fā)現(xiàn)miR-30d通過靶向抑制腫瘤抑制基因GNAI2促進肝癌細胞的遷移和侵襲。另有研究發(fā)現(xiàn)發(fā)生淋巴轉移的聲門上型喉鱗癌患者腫瘤組織中miR-30d表達高于無淋巴轉移的同類患者[9]。上述發(fā)現(xiàn)均提示miR-30d可能在腫瘤轉分化中起正向調節(jié)作用。本研究中miR-30d在TGF-β1組呈高表達且與ColⅠ和FN的miRNA表達一樣具有TGF-β1作用的時間依賴性，亦提示miR-30d正向調節(jié)上皮細胞轉分化。通過Targetscan、miRbase和pictar預測miR-30d相關靶基因，提示膠原蛋白可能為其候選靶基因，miR-30d與ColⅠ的關系有待進一步探索。

Xiong等[10]用TGF-β1誘導NRK-52E轉分化的研究顯示TGF-β1通過Smad信號傳導通路上調miR-21的表達；將miR-21類似物轉染至NRK-52E可誘導轉分化，而用miR-21抑制物能夠阻斷TGF-β1誘導的轉分化。而miR-200家族（包括miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141、miR-429）在TGF-β1作用下表達均下調。轉染miR-200類似物至NRK-52E能抑制TGF-β1誘導的轉分化；相反，用miR-200抑制劑降低miR-200的表達能誘導NRK-52E轉分化。本研究中TGF-β1組miR-21呈高表達，而miR-200b呈低表達，與Xiong等的研究結果一致，提示miR-21促進EMT，而miR-200b抑制EMT。

miR-192是腎臟特異表達的miRNA，其與EMT的關系尚存爭議。既往研究顯示，miR-192通過作用ZEB1和Smad-作用蛋白1（SIP1，又稱ZEB2）的miRNA調控膠原的產生，促進TGF-β1誘導的EMT[11]；而近年有研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1使人腎小管上皮細胞miR-192表達下調，而過表達miR-192可拮抗TGF-β1的促轉分化作用[12]。我們在大鼠UUO模型組發(fā)現(xiàn)miR-192呈低表達且與腎小管間質病變負相關[1]，且本研究中miR-192在TGF-β1作用下表達下調，均支持miR-192抑制轉分化的觀點。關于miR-10b的研究主要涉及腫瘤領域[13-16]，其與纖維化的關系未見報道。既往研究顯示miR-10b促進乳腺癌細胞轉分化[13-14]，提示miR-10b參與腫瘤細胞轉分化且起正向調節(jié)作用。但在我們前期大鼠UUO體內模型中，腎組織miR-10b在術后3 d表達下調[1]，且在本研究體外模型中TGF-β1作用下miR-10b表達下調，均提示miR-10b抑制腎小管上皮轉分化，與其在腫瘤細胞轉分化中的作用相反，可能為miR-10b在不同類型的EMT中作用機制不同，其與EMT的關系有待進一步研究與明確。

綜上所述，在TGF-β1誘導的NRK-52E轉分化的模型中，大鼠腎小管上皮細胞內miR-30d、miR-132、miR-21、miR-200b、miR-192和miR-10b存在較為明顯的差異表達，而且伴隨纖連蛋白在細胞內外表達量增加，提示以上microRNA參與大鼠EMT的發(fā)生、發(fā)展過程，影響大鼠腎小管上皮細胞合成和分泌ECM，其具體的作用機制有待進一步探討。

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Screening of microRNA related to epithelial-myofibroblast transdifferentiation of renal tubular cells

Objective To screen microRNA(miRNA)related to epithelial-myofibroblast transdifferentiation(EMT)of renal tubular epithelial cells.MethodsNormal rat kidney tubular epithelial NRK-52E cells were cultured and stimulated with 5 ng/ml TGF-β1 for 0,3,6,12,24 and 48h.Morphological changes of NRK-52E cells were observed with inverted phase contrast microscope at different time points after stimulation.The expression of α-smooth muscle actin(α-SMA)mRNA,E-cadherin (E-cad)mRNA,collagen I(Col I)mRNA and fibronectin(FN)mRNA was detected with real time qPCR.Western blot was performed to analyze the expression of α-SMA and ELISA was used to quantitatively detect the FN in the supernatant．Six selected miRNAs were examined by stem-loop real-time qPCR.ResultsSome NRK-52E cells underwent morphological changes after stimulation of TGF-β1,changed from typical cobblestone shape to spindle-like in appearance.Compared with BC group,the expression of α-SMA mRNA,Col I mRNA and FN mRNA was enhanced after stimulation of TGF-β1(P＜0.05),while the expression of E-cadherin mRNA was decreased(P＜0.05).The α-SMA content in cells and FN content in supernatant was significantly increased(P＜0.05)after the stimulation of TGF-β1.Compared with BC group,miR-30d,miR-132 and miR-21 were up-regulated(P＜0.05),while miR-200b,miR-192 and miR-10b were down-regulated(P＜0.05).ConclusionEMT of NRK-52E cells can be induced by TGF-β1 stimulation.miR-30d,miR-132,miR-21,miR-200b,miR-192 and miR-10b may be related to EMT in renal tubular cells.

NRK-52E Epithelial-myofibroblast transdifferentiation Transforming growth factor-β1 miRNA

2014-01-06）

（本文編輯：沈叔洪）

溫州市科技計劃項目（Y20080116）；浙江省自然科學基金資助項目（Y12H050017）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃項目（NO.2010KYA135）

325000 溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院腎內科（邵駕宇、章慧娣、尤小寒、黃朝興）；溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院心血管內科（潘嘉林）；溫州醫(yī)科大學微生物免疫學教研室（薛向陽）

黃朝興，E-mail：huangzhaoxing@medmail.com.cn