大蒜素及前藥對(duì)人食管癌細(xì)胞 Eca9706 的增殖抑制及其凋亡基因表達(dá)的影響

常全娥， 茍 萍

（新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 新疆 烏魯木齊 830046）

大蒜素及前藥對(duì)人食管癌細(xì)胞 Eca9706 的增殖抑制及其凋亡基因表達(dá)的影響

常全娥， 茍 萍*

（新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 新疆 烏魯木齊 830046）

目的 研究大蒜素和它的前藥 (蒜氨酸 +蒜氨酸酶) 對(duì)食管癌細(xì)胞 Eca 9706 的增殖抑制及對(duì)凋亡基因表達(dá)的影響。 方法 用大蒜素和大蒜素前藥處理食管癌細(xì)胞 Eca 9706, 采用 MTT法檢測(cè)癌細(xì)胞的增殖抑制作用, 實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)凋亡基因的表達(dá)。 結(jié)果 大蒜素及其前藥對(duì)食管癌細(xì)胞增殖抑制呈現(xiàn)時(shí)間和劑量相關(guān)性, 大蒜素前藥的抑制效果優(yōu)于大蒜素。 實(shí)時(shí)定量 RT-PCR表明大 蒜素和它的前藥上 調(diào)了癌細(xì)胞 bax和 caspase-3 mRNA的表 達(dá), 下調(diào)survivin、 突變型 p53 和 bcl-2 mRNA的表達(dá)。 結(jié)論 大蒜素及其前藥抑制食管癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡可能是通過(guò)線粒體通路實(shí)現(xiàn)。

大蒜素；大蒜素前藥；食管癌細(xì)胞；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

近年來(lái)惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率均呈上升趨勢(shì),已成為常見(jiàn)病和多發(fā)病。食管癌是人類(lèi)消化道的常見(jiàn)腫瘤, 我國(guó)每年因食管癌死亡者約15萬(wàn)人,占癌癥患者死亡率近 1/4, 位居第二位。 我國(guó)抗腫瘤藥物近10年來(lái)取得了令人矚目的成就。 現(xiàn)能生產(chǎn)的抗腫瘤藥物 (不含免疫調(diào)節(jié)劑) 包括:烷化劑類(lèi)、抗代謝藥、天然抗腫瘤藥、抗腫瘤抗生素等,但多數(shù)抗腫瘤藥物存在毒副作用較大,療效不穩(wěn)定、復(fù)發(fā)率高等問(wèn)題。因此,尋找一種低毒、療效穩(wěn)定、使用方便且具有廣譜抗腫瘤活性的藥物成為抗腫瘤藥物研究和臨床中亟待解決的問(wèn)題。腫瘤的中藥治療是當(dāng)今臨床治療的重要手段之一,中草藥及其活性成分抗腫瘤藥物的研究和開(kāi)發(fā)已成為人們關(guān)注的熱點(diǎn), 我國(guó)具有 1 000 多年中草藥研究的悠久歷史,有很多的古代偏方和有名中醫(yī)的經(jīng)驗(yàn)方,開(kāi)發(fā)中草藥抗腫瘤藥物具有廣闊的發(fā)展前景。

大蒜 Allium sativum L.是 歷 史 悠久的藥 食 兩 用植物, 早在 4 000 多年前人們就開(kāi)始食用大蒜, 并用大蒜治療疾病。大蒜的多種藥理作用主要源于它所特有的有機(jī)含硫化合物,如蒜氨酸及其分解產(chǎn)物大蒜素［1-3］等, 大蒜組織損傷時(shí)釋放蒜氨酸酶 (Alliinase), 蒜氨酸酶催化蒜氨酸縮合形成具有強(qiáng)烈辛辣味的揮發(fā)性大蒜素 (Allicin, 主要成分是二烯丙基硫代亞磺酸脂)。 大蒜素遇光、 熱容易降解成二烯丙基三硫和二烯丙基二硫化合物 (DADS) 等含硫有機(jī)化 合 物［3］。 近 年 來(lái) 國(guó) 內(nèi) 外 研 究 表 明, 大蒜素對(duì)胃癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、肺癌等癌細(xì)胞有明顯抑制 作 用［4-7］。 發(fā) 現(xiàn) 大 蒜 素 通 過(guò) 抑 制 腫 瘤 細(xì) 胞的增殖,影響細(xì)胞周期,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,對(duì)抗癌 藥 具 有 增 敏 作 用［4-5,7-9］等 抑 制 或 殺 死 腫 瘤 細(xì) 胞 。大蒜素生 物 半衰期短 (t1/2=2.32 h), 理 化 性 質(zhì) 不穩(wěn)定,在常溫下可進(jìn)一步分解,引起分子中二硫鍵斷 裂,降 解 成 各 種 化 合 物,如 阿 藿 烯 類(lèi)(ajoenes) 、 乙 烯 基 二 硫 雜 苯 類(lèi) (vinyldithiins) 和硫醚類(lèi) (sulfides) 等有機(jī)硫化合物, 導(dǎo)致活性大大降低, 影 響其藥理作 用 及 療效［10］。大 蒜 素 前 藥(蒜氨酸和蒜氨酸酶) 較穩(wěn)定, 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較大蒜素及大蒜素前藥對(duì)食管癌 Eca9706 細(xì)胞的增殖抑制作用, 以及檢測(cè) bcl-2、bax、 survivin、caspase-3和 p53 基因在轉(zhuǎn)錄水平的變化, 為探討大蒜素及其前藥誘導(dǎo)食管癌凋亡的分子機(jī)制及抗腫瘤治療提供可靠的依據(jù)。

1 儀器和實(shí)驗(yàn)材料

Real Time PCR檢 測(cè) 系 統(tǒng) (Applied Biosystems 7500 型, 美 國(guó)) ； 凝 膠 成 像 系 統(tǒng) (Alpha Innotech Corporation TM-26 型, 美 國(guó))； 真 空 冷 凍 干 燥 機(jī)(Christ Alpha 1-2 LDplus型, 德 國(guó))； 倒 置 顯 微 鏡( 江 南 XD-101 型, 中 國(guó)) ； 酶 標(biāo) 儀 (Feic Benchmark Plus型, 美 國(guó) )； CO2細(xì) 胞 培 養(yǎng) 箱 (Heal Force HF240 型, 中國(guó))。

新鮮大蒜 (本地購(gòu)買(mǎi)), 人食管癌 Eca9706 株由鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院董子明教授饋贈(zèng),新疆生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

蒜 氨 酸 (Sigma), 二 烯 丙 基 二 硫 化 物(DADS, 純 度 為 80%,Sigma) 。 RPMI1640 培 養(yǎng)基、 0.25%胰酶消化液、 二甲基甲砜 (DMSO)、四甲基硝唑藍(lán) (MTT)、 胰酶和 10%胎牛血清 (鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)； 青霉素和鏈霉素(ICN Biomedicals公 司)、 引 物 ( 上 海 生 工 生 物 技術(shù)有 限 公 司)； Trizol RNA提 取 液 和 SYBR Green Supermix kit(Invitrogen, 上 海 普 飛 生 物 技 術(shù) 有 限公司)； Tag DNA聚合酶、 DnaseⅠ、dNTP、 RNAse抑制劑 、 Oligo(dT)、 Reverse Transcriptase M-mLV (RNase H-) 和 DNA Marker(均為 大 連 TaKaRa公司產(chǎn)品)；其它試劑均為分析純。

2 方法

2.1 大蒜素的制備 大蒜素提取方法參照曾哲靈［11］方法進(jìn) 行, 得 到的大蒜素 冷 凍 干燥, 大 蒜 素干粉得率 為 2.41 g/kg。 大蒜素 測(cè)定參 照 DTNB比色法進(jìn)行［12］, 測(cè)得 大蒜素質(zhì)量 濃 度 為0.3 μg/mL。稱(chēng)取 大 蒜 素 干 粉 45 mg溶 于 5 mL RPMI1640 培 養(yǎng)液, 配 置 質(zhì) 量 濃 度 為 9 mg/mL, 過(guò) 濾 除 菌, 置-20 ℃冰箱 保存。臨用前用 RPMI1640 培 養(yǎng)液分別稀釋至 5、 10、 15、 20、30 μg/mL。

2.2 大 蒜 素前藥的制 備 稱(chēng)取新 鮮 去 皮 蒜 瓣200 g,4 ℃ 預(yù) 冷, 加 入 預(yù) 冷 的 磷 酸 緩 沖 液 200 mL (蒜瓣∶提取液 =1 ∶1,W/V), 勻漿。 勻漿液在4 ℃低溫 下 4 000 r/min 離 心 20 min, 棄 去 殘 渣,在上清液中加入硫酸銨, 使飽和度為20%,4 ℃下靜置 2 h,8 000 r/min 冷 凍 離 心 20 min, 棄 沉 淀 。上清液繼續(xù)加入硫酸銨, 使飽和度達(dá)到 50%, 在4 ℃ 下 靜 置過(guò)夜,4 ℃ 低 溫 下 8 000 r/min 冷凍離心20 min, 沉淀冷凍干燥得到蒜氨酸酶。 蒜氨酸酶活力的測(cè)定采用丙酮酸法［13］。 分離得到的蒜氨酸酶活力單位為 24 720 U/mg,SDS-PAGE檢測(cè)有一 條 主 要的蛋白 帶 (圖 1), 其 分 子質(zhì) 量 大 小約 為54 kDa左右, 與已有的報(bào)道［14］分子質(zhì)量大小一致。

將30 mg蒜 氨 酸 和 15 mg蒜 氨 酸 酶 混 合 溶 于5 mLRPMI1064 培 養(yǎng)液, 配置 成 9 mg/mL, 過(guò) 濾 除菌后置于 -20 ℃冰箱保存。 臨用時(shí), 用 RPMI1640培養(yǎng)液分別稀釋至 5、 10、 15、 20、 30 μg/mL。

圖 1 蒜氨酸酶 SDS-PAGE電泳Fig.1 SDS-PAGE of alliinase

2.3 體外細(xì)胞毒試驗(yàn) （MTT法） 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的食管癌細(xì)胞 Eca9706, 用 0.25%胰蛋白酶消化收集后, 進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù), 用新鮮的 RPMI1640 培養(yǎng)基稀釋 Eca9706 至 2 ×104個(gè)/m L,100 μL/孔接種于96 孔板, 置于 37 ℃,5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 培養(yǎng) 12 h 后, 加入 100 μL制備好的大蒜素、 大蒜素前藥 (5、 10、 15、 20、 30 μg/m L) 和4.8 μg/mL的陽(yáng)性對(duì)照 DADS(DADS 用 DMSO配制成 0.5 mg/mL, 置 于 4 ℃ 保 存 。 臨 用 前 用 新 鮮RPMI1640 培養(yǎng)液稀釋至終質(zhì)量濃度 4.8 μg/mL),陰性對(duì)照加入等體積的細(xì)胞培養(yǎng)液,空白對(duì)照組(無(wú)細(xì)胞) 加入等體積 PBS, 用于調(diào)零, 各組設(shè) 3個(gè)重復(fù)孔。 培養(yǎng) 24、48、 72 h 后, 棄 去 各 孔 培 養(yǎng)基, 每孔加入20 μL 5mg/mLMTT溶液和80 μL培養(yǎng)基, 繼續(xù)培養(yǎng)4 h。 棄去各孔殘液, 每孔加入二甲基亞砜 100 μL, 置 搖 床 上 低 速 振 蕩 30 min, 使結(jié)晶物充分溶解。 用 酶標(biāo)儀檢測(cè) 490 nm波 長(zhǎng)處測(cè)量各孔的吸光值 (A490)。

細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率 (%)=［(陰性對(duì)照組 A490-空白組 A490)-(實(shí)驗(yàn)組 A490-空白組 A490)/(陰性對(duì)照組 A490-空白組 A490)］ ×100%。

IC50的測(cè)定 測(cè)定方法同 MTT實(shí)驗(yàn), 根據(jù)不同質(zhì)量濃度大蒜素及其前藥處理食管癌細(xì)胞不同時(shí)間的增殖抑制率,計(jì)算出達(dá)到最大抑制率一半時(shí)所對(duì)應(yīng)的大蒜素及其前藥的質(zhì)量濃度 (IC50)。

2.4 實(shí)時(shí)定量 RT-PCR檢測(cè) 分別收集經(jīng)高、 中、低質(zhì)量濃度 (10、 20、 40 μg/mL) 大蒜、 大蒜素前藥處理不同時(shí)間 (24、 48、 72 h) 的 Eca9706 細(xì)胞, 并用 PBS 清 洗 3 次, 加 入 1 mL Trizol。用 Trizol法提取 Eca9706 細(xì)胞的總 RNA, 進(jìn)行 cDNA反轉(zhuǎn)錄,按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

實(shí)時(shí)定量 RT-PCR檢測(cè)采用 Sybrgreen 法, 每一個(gè)樣品同時(shí)進(jìn)行 β-actin 和 survivin、 p53、 bcl-2、 bax、 caspase-3 基 因 的 檢 測(cè)。 總 反 應(yīng) 體 系 為25.0 μL, 其 中 SYBR 熒 光 染 料 12.5 μL, 10 μmol/mL上下游引物 ( 表 1) 各 1 μL,cDNA (1 μg/mL) 模板 1.5 μL, 補(bǔ) 充 ddH2O 10 μL, 每一樣本設(shè) 3 個(gè)復(fù)孔。 95 ℃、 3 min 變性后, 共進(jìn)行40 個(gè) 循 環(huán) 擴(kuò) 增, 每 一 個(gè) 循 環(huán) 包 括 95 ℃ 、 10 s, 61 ℃、 50 s。 從 65 ℃ 到 95 ℃, 每隔 0.5 ℃ 保 持5 s, 記錄一次熒光 值, 獲 得 溶 解 曲 線。 所有 樣 品檢測(cè)均設(shè)置陰性對(duì)照 (無(wú)模板) 以排除假陽(yáng)性。

相對(duì)定量的計(jì)算方法:mRNA表達(dá)量變化 = 2-ΔΔCt, 其中 ΔΔCt=(處理樣本目的基因 Ct-處理樣本內(nèi)參基因 Ct)-(對(duì)照樣本目的基因 Ct-對(duì)照樣本內(nèi)參基因 Ct)。

表1 不同基因的引物序列Tab.1 Prim er sequences of the differen t genes

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 每組實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次, 采用 Prism軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行兩因素方差分析和顯著性檢驗(yàn)；多組間參數(shù)采用單因素方差分析和多重比較。

3 結(jié)果與討論

3.1 大蒜素及其前藥對(duì)食管癌細(xì)胞的增殖抑制作用 以 4.8 μg/mL二烯丙基二硫化物 (DADS) 為對(duì)照,用不同質(zhì)量濃度的大蒜素和大蒜素前藥處理Eca9706 細(xì)胞 24、 48 和 72 h,MTT比 色 法 測(cè) 定 細(xì)胞的增殖抑制率 (圖 2A,2B)。 大蒜素及其前藥處理24 和 48 h 均呈現(xiàn)出時(shí)間和劑量依賴(lài)性抑制食管癌細(xì)胞的增殖,而較高質(zhì)量濃度的大蒜素及其前藥 (20、 30 μg/mL) 處 理 72 h 未 表 現(xiàn) 出 劑 量 依賴(lài), 這是由于增殖抑制率已達(dá)到較高水平 (94%以上) 而滯長(zhǎng)。 大蒜素及其前藥抑制 Eca9706 細(xì)胞增殖的最佳作用質(zhì)量濃度為 20 μg/mL, 最佳作用時(shí) 間 為 48 h, 其 抑 制 率 分 別 達(dá) 到 94.5% 和 96.7%。 20 μg/mL大蒜素及其前藥作用食管癌的抑制率 (48 和 72 h) 與 4.8 μg/mL DADS 接 近 。大蒜素前 藥 處 理 Eca9706 細(xì) 胞 24 和 48 h 的 IC50均小于大蒜素 (表 2), 大蒜素前藥處理 24 h 的 IC50比大蒜素降低了 46%。 說(shuō)明大蒜素前藥抑制食管癌細(xì)胞的效果優(yōu)于大蒜素。

圖 2 大蒜素及其前藥對(duì) Eca9706 細(xì)胞的抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of allicin and its prodrug on Eca9706 cells

表 2 大 蒜素及 其 前 藥 作 用 （20 μg/m L） Eca9706 細(xì) 胞 不同時(shí)間的 IC50值Tab.2 IC50of allicin and its prodrug （20 μg/m L） on Eca 9706 cells at different tim es

3.2 大蒜素及其前藥對(duì)食管癌細(xì)胞 p53 基因表達(dá)的影響 p53 基因的突變和高表達(dá)是多種癌癥發(fā)生的重要因素, 突變型的 p53 通過(guò)上調(diào) bcl-2 和下調(diào)bax基因表達(dá), 阻止細(xì)胞色素 c從線粒體中的釋放,最終抑制癌細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,低、中、 高質(zhì)量濃度大蒜素及其前藥處理 Eca9706 細(xì)胞不同時(shí)間后,p53 表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組 (表3)。 與對(duì)照組相比, 低、 中、 高質(zhì)量濃度大蒜素及其前藥處理 72 h 后 p53 基因表 達(dá) 量 分別下降了24.2%、 56.3%、 82.6% 和 43.9%、 65.1%、73.9%, 呈現(xiàn)出劑量依賴(lài)性。大蒜素及其前藥能導(dǎo)致 Eca9706 細(xì)胞中的 p53 基因下調(diào), 進(jìn)而影響凋亡 相關(guān)基因的表達(dá), 最終可引起食管癌細(xì)胞凋亡。

表 3 大蒜素及其前藥處理 Eca9706 細(xì)胞后 p53 基因轉(zhuǎn)錄水平的變化 （）Tab.3 Variety of p53 m RNA expression after Eca9706 cells treated w ith allicin and its prod rug （）

表 3 大蒜素及其前藥處理 Eca9706 細(xì)胞后 p53 基因轉(zhuǎn)錄水平的變化 （）Tab.3 Variety of p53 m RNA expression after Eca9706 cells treated w ith allicin and its prod rug （）

注: 與對(duì)照組比較,*P＜0.05,**P＜0.01

質(zhì)量濃度/ (μg.m L-1) p53 mRNA大蒜素組大蒜素前藥組24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h 0 0.98 ±0.04 0.92 ±0.04 1 1.04 ±0.03 0.99 ±0.03 10 0.50 ±0.18* 0.50 ±0.12* 0.70 ±0.02 0.87 ±0.02 0.80 ±0.01* 0.56 ±0.04*20 0.36 ±0.02** 0.44 ±0.03** 0.40 ±0.03** 0.50 ±0.04* 0.62 ±0.08** 0.35 ±0.05**40 0.31 ±0.11** 0.42 ±0.06** 0.16 ±0.03** 0.55 ±0.06* 0.21 ±0.06** 0.26 ±0.05 1 **

3.3 大蒜素及其前藥對(duì)食管癌細(xì)胞 survivin 基因表達(dá)的影響 Survivin 是一種凋亡抑制基因, 過(guò)度表達(dá)使細(xì)胞失去了正常增生周期中凋亡 “開(kāi)關(guān)”的限制,造成細(xì)胞增殖增加,凋亡減少,導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。不同質(zhì)量濃度的大蒜素及其前藥處理Eca9706 細(xì)胞不同時(shí)間,survivin 的表達(dá)量與對(duì)照組相比均有所下降 (表 4), 說(shuō)明大蒜素及其前藥在轉(zhuǎn)錄水平上抑制了 Eca9706 細(xì)胞 survivin 的 mRNA表達(dá),起到誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的作用。高質(zhì)量濃度的大蒜素及其前藥 處理 72 h,survivin 表達(dá)量顯著降低,誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的作用較強(qiáng),并且大蒜素前藥的效果優(yōu)于大蒜素。

表 4 大蒜素及其前藥處理 Eca9706 細(xì)胞后 survivin基因轉(zhuǎn)錄水平的變化 （）Tab.4 Variety of survivin mRNA expression after Eca9706 cells treated with allicin and its prodrug （）

表 4 大蒜素及其前藥處理 Eca9706 細(xì)胞后 survivin基因轉(zhuǎn)錄水平的變化 （）Tab.4 Variety of survivin mRNA expression after Eca9706 cells treated with allicin and its prodrug （）

注: 與對(duì)照組比較,*P＜0.05,**P＜0.01

質(zhì)量濃度/ (μg.m L-1) survivin mRNA大蒜素組大蒜素前藥組24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h 0 0.85 ±0.06 0.83 ±0.10 1 0.83 ±0.01 0.72 ±0.13 10 0.84 ±0.13 0.75 ±0.09 0.43 ±0.02* 0.91 ±0.07 0.66 ±0.02 0.18 ±0.04**20 0.74 ±0.10 0.58 ±0.06 0.41 ±0.02** 0.64 ±0.05** 0.73 ±0.06 0.10 ±0.01**40 0.72 ±0.08 0.29 ±0.03** 0.18 ±0.02** 0.38 ±0.04** 0.41 ±0.04** 0.02 ±0.00 1 **

3.4 大蒜素及其前藥對(duì)食管癌細(xì)胞 bcl-2 和 bax基因表達(dá)的影響 bcl-2 基因是一種原癌基因, 它具有抑制細(xì)胞凋亡的作用。與對(duì)照組相比,不同質(zhì)量濃度的大蒜素及其前藥處理 Eca9706 細(xì)胞不同時(shí)間,bcl-2 基因表達(dá)均呈現(xiàn)下調(diào) (表 5)。中、 高質(zhì)量濃度的大蒜素及其前藥處理 24 和 72 h,bcl-2 基因表達(dá)下調(diào)較顯著, 說(shuō)明它們能夠通過(guò)下調(diào) bcl-2基因表達(dá)促進(jìn) Eca9706 細(xì)胞凋亡。 bax為誘導(dǎo)凋亡基因,bax基因的高表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。與對(duì)照組相比, 不同質(zhì)量濃度的大蒜素處理 24 h,bax基因上調(diào)表達(dá)極顯著 (表6), 前藥組呈現(xiàn)一定程度的上調(diào), 處 理 48 和 72 h bax基 因 表 達(dá) 上 調(diào) 不 顯 著,有些處理還表現(xiàn)出一定程度的下降。

bcl-2 家族成員的構(gòu)成比例是凋亡調(diào)控的關(guān)鍵因素, 其中 bcl-2/bax比率 是啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的 “ 分子開(kāi)關(guān)”, 當(dāng) bcl-2/bax比率降低可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。與對(duì)照組相比,不同質(zhì)量濃度的大蒜素及其前藥處理 Eca9706 細(xì)胞不同時(shí)間,bcl-2/bax比率均下降(表7)。 低、 中、高質(zhì)量濃度的大蒜素及其前藥處理 Eca9706 細(xì) 胞 24 h,bcl-2/bax比 率 下 降 顯 著,分別 比 對(duì) 照 下 降了 76%、 89%、 93% 和 61%、69%、 78%。 大蒜素及其前藥可能通過(guò)調(diào)控 bcl-2/bax比率誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞凋亡。

表 5 大蒜素及其前藥處理 Eca9706 細(xì)胞后 bcl-2 基因轉(zhuǎn)錄水平的變化）Tab.5 Variety of bcl-2mRNA expression after Eca9706 cells treated with allicin and its prodrug （）

表 5 大蒜素及其前藥處理 Eca9706 細(xì)胞后 bcl-2 基因轉(zhuǎn)錄水平的變化）Tab.5 Variety of bcl-2mRNA expression after Eca9706 cells treated with allicin and its prodrug （）

注: 與對(duì)照組比較,*P＜0.05,**P＜0.01

質(zhì)量濃度/ (μg.m L-1) bcl-2 mRNA大蒜素組大蒜素前藥組24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h 0 0.93 ±0.03 0.92 ±0.06 1 0.87 ±0.22 0.63 ±0.06 10 0.81 ±0.04 0.58 ±0.10 0.62 ±0.14 0.7 ±0.06 0.66 ±0.01 0.32 ±0.15 20 0.42 ±0.02* 0.56 ±0.01 0.26 ±0.07** 0.59 ±0.01* 0.54 ±0.02 0.26 ±0.11*40 0.32 ±0.03** 0.49 ±0.08* 0.07 ±0.01** 0.54 ±0.20* 0.49 ±0.03 0.15 ±0.07 1 *

表 6 大蒜素及其前藥處理 Eca9706 細(xì)胞后 bax 基因轉(zhuǎn)錄水平變化 （）Tab.6 Variety of bax m RNA expression after Eca9706 cells treated w ith allicin and its prod rug （）

表 6 大蒜素及其前藥處理 Eca9706 細(xì)胞后 bax 基因轉(zhuǎn)錄水平變化 （）Tab.6 Variety of bax m RNA expression after Eca9706 cells treated w ith allicin and its prod rug （）

注: 與對(duì)照組比較,*P＜0.05,**P＜0.01

質(zhì)量濃度/ (μg.mL-1) baxmRNA大蒜素組大蒜素前藥組24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h 0 3.58 ±0.50 2.10 ±0.41 1 2.54 ±0.11 1.68 ±0.17 10 3.73 ±0.7** 3.00 ±0.48 2.55 ±0.11 1.88 ±0.19 2.61 ±0.10 1.85 ±0.05 20 4.02 ±0.82** 3.78 ±0.81 2.81 ±0.73 2.26 ±0.52 2.90 ±0.72 1.82 ±0.22 40 4.58 ±0.78**1 2.93 ±0.14 1.77 ±0.30 2.40 ±0.59 3.98 ±0.57 3.13 ±1.14

表 7 大蒜素及其前藥處理 Eca9706 細(xì)胞后 bcl-2/bax 比率的變化 （））Tab.7 Variety of bcl-2/bax rate after Eca9706 cells treated w ith allicin and its prodrug （

表 7 大蒜素及其前藥處理 Eca9706 細(xì)胞后 bcl-2/bax 比率的變化 （））Tab.7 Variety of bcl-2/bax rate after Eca9706 cells treated w ith allicin and its prodrug （

注: 與對(duì)照組比較,*P＜0.05,**P＜0.01

質(zhì)量濃度/ (μg.m L-1) bcl-2/bax大蒜素組大蒜素前藥組24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h 0 0.27 ±0.04 0.46 ±0.06 1 0.34 ±0.08 0.39 ±0.06 10 0.24 ±0.05** 0.21 ±0.06 0.25 ±0.06* 0.38 ±0.06** 0.25 ±0.01 0.17 ±0.08*20 0.11 ±0.01** 0.20 ±0.13 0.09 ±0.03** 0.31 ±0.09** 0.21 ±0.05 0.14 ±0.05*40 0.07 ±0.01** 0.17 ±0.02* 0.04 ±0.00** 0.21 ±0.02** 0.13 ±0.01* 0.05 ±0.01 1 **

3.5 大蒜素前藥對(duì)食管癌細(xì)胞 caspase-3 基因表達(dá)的影響 半胱天冬酶 (caspase) 家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過(guò)程中起著極其重要的作用,caspase-3 是caspase級(jí)聯(lián) “瀑布” 下游凋亡程序的中心, 阻斷caspase-3 的激活是許多藥物發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用的關(guān)鍵機(jī) 制 之 一［15-16］。 不 同 質(zhì) 量 濃 度 的 大 蒜 素 及 其前藥處理 Eca9706 細(xì)胞不同時(shí)間后,caspase-3 表達(dá)均高于對(duì)照組 (表8), 并表現(xiàn)出劑量依賴(lài)性。中、高質(zhì)量濃度的大蒜素及其 前藥處 理 24 和 48 h 時(shí), caspase-3 表達(dá)量升高顯著 (P＜0.05)。 大蒜素及其 前 藥 誘 導(dǎo) caspase-3 高 表 達(dá) 的 質(zhì) 量 濃 度 為40 μg/mL, 最佳時(shí)間為 48 h。 這 些 結(jié)果表明 大 蒜素及其前藥能夠通過(guò)上調(diào) caspase-3 的表達(dá), 激活下游凋亡程序,促進(jìn)食管癌細(xì)胞凋亡。

表 8 大蒜素及其前藥處理 Eca9706 細(xì)胞后 caspase-3 基因轉(zhuǎn)錄水平的變化 （））Tab.8 Variety of caspase-3mRNA exp ression after Eca9706 cells treated with allicin and its prodrug （

表 8 大蒜素及其前藥處理 Eca9706 細(xì)胞后 caspase-3 基因轉(zhuǎn)錄水平的變化 （））Tab.8 Variety of caspase-3mRNA exp ression after Eca9706 cells treated with allicin and its prodrug （

注: 與對(duì)照組比較,*P＜0.05,**P＜0.01

質(zhì)量濃度/ (μg.mL-1) caspase-3 mRNA大蒜素組大蒜素前藥組24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h 0 1.11 ±0.03 1.58 ±0.41 1 1.14 ±0.08 1.25 ±0.07 10 2.50 ±0.02 2.87 ±0.16 3.52 ±0.12** 1.47 ±0.28 2.08 ±0.04 1.80 ±0.43 20 4.66 ±0.04** 5.81 ±0.35** 4.91 ±0.07** 3.36 ±0.10** 4.94 ±0.27** 2.11 ±0.43 40 4.82 ±0.23** 6.78 ±0.09** 4.40 ±0.01** 4.6 ±0.15** 6.00 ±1.40** 3.22 ±0.45 1 *

4 討論

細(xì)胞增殖的失控是腫瘤細(xì)胞的基本生物學(xué)特征之一,大量的研究表明大蒜素能夠抑制多種癌細(xì)胞的增殖,Oommen 等 人［17］的 研 究 表 明, 鼠 纖 維 肉瘤細(xì)胞 L-929、 人結(jié)腸癌細(xì)胞 SW480 和人宮頸癌細(xì)胞 HeLa隨著大蒜素的質(zhì)量濃度增加存活率降低。大蒜素呈劑量依賴(lài)性抑制胃癌 SGC-7901 細(xì)胞, 高質(zhì)量濃度 的 大 蒜 素 (0.1 mg/mL) 處 理 48 h 抑 制率達(dá)到 89%［4］。 本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了大蒜素及其前藥顯著抑制食管癌細(xì)胞增殖,在大蒜素及其前藥質(zhì)量濃度為 20 μg/mL, 處 理 時(shí) 間 為 48 h, 其 抑 制 率 分別達(dá)到 94.5%和 96.7%。 不同時(shí)間和劑量處理食管癌細(xì)胞均呈現(xiàn)出時(shí)間和劑量依賴(lài)型抑制癌細(xì)胞的增殖。 大蒜 素 前 藥 處 理食 管 癌 細(xì)胞 (24 和 48 h)的 IC50小于大蒜 素 ( 表 1), 說(shuō) 明 前 藥抑制食 管 癌細(xì)胞的效果優(yōu)于大蒜素,這可能與前藥相對(duì)于大蒜素較穩(wěn)定有關(guān)。

腫瘤的發(fā)生是多基因參與的復(fù)雜過(guò)程,涉及多個(gè)癌基因和抑癌基因的激活與失活。大蒜素能夠誘導(dǎo)前列 腺 癌 LNCaP細(xì) 胞［18］、 小 鼠 黑 色 素 瘤 細(xì) 胞B16-F1［19］、 人胃 腺 癌 SGC-7901 細(xì) 胞 株［20］等 癌 細(xì)胞的凋亡。大蒜素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡涉及到多種蛋白的作用, 包括 bcl-2 家族、 caspase家族、 p53 和survivin 等。 野生型的 p53 是一種抑癌基因, 在細(xì)胞增殖、 分化、 DNA修復(fù)、 細(xì)胞周期和凋亡中起重要的作用［21］。 p53 基因 突 變 失去 了 對(duì) 細(xì)胞 增 殖的抑制,而且出現(xiàn)類(lèi)似癌基因蛋白類(lèi)的促細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的作用, 在多種腫瘤細(xì)胞中都發(fā)現(xiàn) p53 基因的突變或缺失［22］。 癌 細(xì) 胞 中的突變 型 p53 通 過(guò) 上 調(diào)凋亡抑制基因 bcl-2, 下調(diào)凋亡促進(jìn)基因 bax, 抑制癌細(xì)胞的凋亡。 survivin 基因是一個(gè)被野生型 p53基因抑制的基因, 由于癌細(xì)胞中 p53 基因的突變,喪失了對(duì) survivin 基因轉(zhuǎn)錄的抑制作用, 從而促進(jìn)suvivin 基 因 的 異 常 表 達(dá)［23-24］。 survivin 與 p53 在 喉癌組織中的表達(dá)呈顯著正相關(guān)［25］。 survivin 可 以抑制細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者 caspase-3 的活性, 阻斷各種刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞 凋 亡 過(guò) 程［26］。 已 有 的 研 究 發(fā) 現(xiàn) 在喉癌和肝癌組織中 survivin 與 caspase-3 的表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)［25,27］。許 多 研 究表明大 蒜 素 及大蒜中的有機(jī)硫化合物誘導(dǎo)多種癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制,主要表現(xiàn)在能下調(diào) p53、 bcl-2 表達(dá), 上調(diào) bax和 caspase-3基因表達(dá),bax/bcl-2 基因表達(dá)比率上升, 最終導(dǎo)致癌細(xì) 胞 凋 亡［28-35］。 本 實(shí) 驗(yàn) 結(jié) 果 證 實(shí) 了 大 蒜 素 及其前藥 能 夠 上 調(diào) Eca9706 細(xì) 胞 中 bax和 caspase-3 mRNA表達(dá), 下調(diào) p53、 bcl-2 和 survivin mRNA表達(dá)。 大蒜素及其前藥誘導(dǎo) Eca9706 細(xì)胞凋亡的機(jī)理可能是通過(guò)線粒體途徑實(shí)現(xiàn), 首先突變型 p53 基因表達(dá)下調(diào), 抑制 bcl-2 和促進(jìn) bax基因的表達(dá)； 其次突變型 p53 基因作為 survivin 的負(fù)調(diào)控因子下調(diào)其表達(dá)； 最終由于 survivin 基因表達(dá)的下調(diào), 促進(jìn)了 caspase-3 基因表達(dá), 它們之間的協(xié)同作用導(dǎo)致食管癌細(xì)胞凋亡。

綜上所述,大蒜素及其前藥能通過(guò)調(diào)控凋亡相關(guān)基因,抑制食管癌細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞凋亡。大蒜素前藥比大蒜素穩(wěn)定,有望成為控制腫瘤生長(zhǎng)的天然理想藥物。

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A llicin and its prodrug inhibit proliferation and apoptosis gene expression in human esophageal cancer Eca9706 cells

CHANG Quan-e, GOU Ping*
(College of Life Scienceand Technology,Xinjiang University,Urumuqi830046,China)

AIM To study the inhibitory effect of allicin and its prodrug(alliin+alliinase)on proliferation and apoptosis gene expression of human esophageal cancer Eca 9706 cells.METHODS The proliferation inhibition and apoptotic gene expression of esophageal cancer cells treated with allicin and its prodrug were assayed by MTT and real-time quantitative RT-PCR,respectively.RESULTS Allicin and its prodrug inhibited cancer cells proliferation in a dose-and time-dependentmanner,and the inhibitory effectof the latterwas better than thatof the former.Real-time RT-PCR showed that allicin and its prodrug upregulatedmRNA expression of bax and caspase-3 genes of esophageal cancer cells,and downregulated mRNA expression of survivin,mutant p53,and bcl-2 genes. CONCLUSION The inhibition of cancer cells'proliferation and induction of apoptosis caused by allicin and its prodrug may be related to the mitochondrial pathway.

allicin； allicin prodrug； human esophageal cancer cells；proliferation； apoptosis

R966

:A

:1001-1528(2014)06-1117-08

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.06.002

2013-06-12

新疆自治區(qū)高校科研計(jì)劃 (XJEDU2010I13)

常全娥 (1987—), 女, 碩士, 研究方向: 生物化學(xué)。 E-mail:cqe1987@163.com

*通信作者: 茍 萍 (1955—), 女, 教授, 研究方向: 生物化學(xué)。 E-mail:gou-ping@sina.com.cn