血清GP73和AFP等十項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合診斷HBsAg陽(yáng)性肝癌的研究

董飛波 高國(guó)生 徐曉珍 祝成亮 顏衛(wèi)華

●論 著

血清GP73和AFP等十項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合診斷HBsAg陽(yáng)性肝癌的研究

董飛波 高國(guó)生 徐曉珍 祝成亮 顏衛(wèi)華

目的 探討血清高爾基體蛋白73（GP73）及甲胎蛋白（AFP）、癌胚抗原（CEA）、鐵蛋白（SF）、糖基抗原（CA19-9、CA15-3、CA125）、堿性磷酸酶（ALP）、γ-谷氨酰基轉(zhuǎn)肽酶（GGT）、亮氨酸氨基轉(zhuǎn)肽酶（LAP）等腫瘤標(biāo)志物單項(xiàng)和聯(lián)合檢測(cè)對(duì)乙型肝炎（乙肝）病毒表面抗原（HBsAg）陽(yáng)性肝癌的診斷價(jià)值。方法收集85例慢性乙肝、74例乙肝肝硬化、133例HBsAg陽(yáng)性肝癌患者及46例健康體檢者的血清，對(duì)GP73及AFP、CEA、SF、CA19-9、CA15-3、CA125、ALP、GGT、LAP等腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果Spearman相關(guān)分析表明血清GP73與AFP、CEA、SF、CA19-9、CA15-3、CA125、ALP、GGT、LAP均有一定的相關(guān)性（均P＜0．05），除CA125外，肝癌組的相關(guān)系數(shù)均比非肝癌組?。坏挥蠫P73與AFP、GGT及LAP的相關(guān)性在兩組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0．05）。GP73、AFP、CEA、SF、CA19-9、CA15-3、CA125、ALP、GGT、LAP在慢性乙肝組、乙肝肝硬化組、肝癌組和正常對(duì)照組中的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0．05），肝癌組的GP73、AFP、LAP的血清水平均顯著高于其他組（均P＜0．05）。ROC曲線分析表明，單項(xiàng)指標(biāo)中以GP73的ROC曲線下面積最大（AUC=0．792）,但與AFP和ALP的差異不大（Z=0．127、1．908，P=0．899、0．056）。通過(guò)logistic回歸對(duì)上述指標(biāo)構(gòu)建新的預(yù)測(cè)模型，聯(lián)合預(yù)測(cè)因子（PRE）的AUC顯著高于其它單項(xiàng)指標(biāo)（均P＜0．05）。結(jié)論GP73單項(xiàng)檢測(cè)有較好的診斷作用，GP73聯(lián)合AFP、CEA、SF、CA19-9、CA15-3、CA125、ALP、GGT、LAP檢測(cè)可提高對(duì)HBsAg陽(yáng)性肝癌的診斷效能。

原發(fā)性肝癌 高爾基體蛋白73 甲胎蛋白 ROC曲線

近年來(lái)，高爾基體蛋白73（GP73）被認(rèn)為是最值得期待的血清標(biāo)志物之一，有多篇文獻(xiàn)報(bào)道GP73對(duì)診斷肝癌方面有較好的價(jià)值[1-3]，但GP73聯(lián)合其它血清學(xué)標(biāo)志物對(duì)肝癌，特別是國(guó)內(nèi)以乙型肝炎（乙肝）為基礎(chǔ)的肝癌的診斷研究報(bào)道較少。本研究通過(guò)檢測(cè)血清GP73及甲胎蛋白（AFP）、癌胚抗原（CEA）、鐵蛋白（SF）、糖基抗原（CA19-9、CA15-3、CA125）、堿性磷酸酶（ALP）、γ-谷氨?；D(zhuǎn)肽酶（GGT）、亮氨酸氨基轉(zhuǎn)肽酶（LAP）等常用腫瘤標(biāo)志物在不同類(lèi)型乙肝相關(guān)疾病中的表達(dá)情況，探討其單項(xiàng)和聯(lián)合檢測(cè)對(duì)HBsAg陽(yáng)性肝癌的診斷價(jià)值，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2010-01—2013-05在寧波市第二醫(yī)院住院的患者血清標(biāo)本292例，其中慢性乙肝患者85例，男67例，女18例，年齡20～75歲，平均（38.99± 11.62）歲；乙肝肝硬化患者74例，男49例，女25例，年齡33～81歲，平均（54.88±11.04）歲；肝癌患者133例，男120例，女13例，年齡33～85歲，平均（55.14±10.74）歲。所有患者均有HBV感染的病因?qū)W基礎(chǔ)（HBsAg陽(yáng)性），同時(shí)排除其他肝炎病毒感染。對(duì)肝癌患者進(jìn)行臨床分期，其中Ⅰ期35例，Ⅱ期35例，Ⅲ期63例。所有患者的診斷標(biāo)準(zhǔn)、肝癌臨床分期標(biāo)準(zhǔn)均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)制定的《慢性乙型肝炎防治指南》[4]及第4屆全國(guó)肝癌學(xué)術(shù)大會(huì)討論通過(guò)的原發(fā)性肝癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，且肝癌患者均未行手術(shù)、介入、化療、分子靶向治療。另選取同期健康體檢者46例作為正常對(duì)照組，其中男35例，女11例，年齡18～77歲，平均（33.37±12.92）歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法 受檢者均采集清晨空腹靜脈血5ml，分離后的血清于-20℃冰箱保存待測(cè)。GP73測(cè)定采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（定量）檢測(cè)，試劑盒由北京熱景生物技術(shù)有限公司提供；AFP、CEA、SF、CA19-9、CA15-3、CA125檢測(cè)采用微粒子酶免疫分析技術(shù)，儀器為美國(guó)ABBOTT AXSYM全自動(dòng)免疫分析儀，原裝試劑盒；ALP、GGT采用AU2700全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)，原裝試劑盒；LAP采用AU2700全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)，試劑盒由長(zhǎng)春匯力生物技術(shù)有限公司提供。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件。血清GP73、AFP、CEA、SF、CA19-9、CA15-3、CA125、ALP、GGT、LAP檢測(cè)結(jié)果經(jīng)過(guò)正態(tài)性檢驗(yàn)呈偏態(tài)分布，采用中位數(shù)（四分位數(shù)）表示；多組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，兩兩比較采用Nemenyi法。雙變量間相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析。繪制ROC曲線并采用ROC曲線下面積（AUC）評(píng)價(jià)血清GP73和AFP對(duì)肝癌的診斷價(jià)值。多因素logistic回歸分析的引入標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05，剔除標(biāo)準(zhǔn)為P＞0.10，方法為Backward:wald；logistic回歸構(gòu)建新的預(yù)測(cè)模型參照文獻(xiàn)[6]。AUC和相關(guān)系數(shù)的比較運(yùn)用正態(tài)性Z檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 血清GP73與9種腫瘤標(biāo)志物的相關(guān)性分析 根據(jù)患者是否患肝癌分為非肝癌組和肝癌組，對(duì)血清GP73及AFP、CEA、SF、CA19-9、CA15-3、CA125、ALP、GGT、LAP進(jìn)行Spearman相關(guān)分析，結(jié)果表明兩組中血清GP73與其它腫瘤標(biāo)志物均有相關(guān)性（均P＜0.05）。除CA125外，肝癌組的相關(guān)系數(shù)均比非肝癌組小，但只有GP73與AFP、GGT及LAP的相關(guān)性在兩組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），詳見(jiàn)表1、圖1。

表1 血清GP73與9種腫瘤標(biāo)志物的相關(guān)性分析

2.2 血清GP73與9種腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果的比較 GP73、AFP、CEA、SF、CA19-9、CA15-3、CA125、ALP、 GGT、LAP在慢性乙肝組、乙肝肝硬化組、肝癌組和正常對(duì)照組中的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），其中肝癌組的GP73、AFP、LAP水平均顯著高于其他組（均P＜0.05），詳見(jiàn)表2。

圖1 血清GP73與AFP在非肝癌組和肝癌組中的相關(guān)性

2.3 血清GP73和9種腫瘤標(biāo)志物單項(xiàng)及聯(lián)合檢測(cè)診斷肝癌的ROC曲線分析 以正常人及良性肝病患者作為對(duì)照組，對(duì)GP73和其它9種腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行多因素logistic回歸分析構(gòu)建新的預(yù)測(cè)模型，并得到聯(lián)合預(yù)測(cè)因子（PRE），PRE=CA15-3+0.1447GP73+0.0263AFP+ 0.1447LAP。利用ROC曲線分析各腫瘤標(biāo)志物及聯(lián)合預(yù)測(cè)因子對(duì)肝癌的診斷效能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單項(xiàng)指標(biāo)中，以GP73的ROC曲線下面積最大（AUC=0.792），但與AFP和ALP的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=0.127、1.908，P＞0.05）；而PRE的AUC顯著高于其它所有單項(xiàng)指標(biāo)（均P＜0.05），詳見(jiàn)表3、4、圖2。

表2 血清GP73與9種血清學(xué)標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果的比較

表3 GP73與9種腫瘤標(biāo)志物logistic回歸分析結(jié)果

2.4 血清GP73和其它9種腫瘤標(biāo)志物單項(xiàng)對(duì)良性肝病的ROC曲線分析 （1）以正常人和乙肝肝硬化及肝癌患者作為對(duì)照組，利用ROC曲線分析各腫瘤標(biāo)志物對(duì)慢性乙肝的診斷效能，所有單項(xiàng)指標(biāo)（包括GP73）AUC＜0.600（GP73、AFP、CEA、SF、CA19-9、CA15-3、CA125、ALP、GGT、LAP的AUC分別為0.373、0.347、0.338、0.570、0.472、0.268、0.255、0.374、0.560、0.550）。（2）以正常人和慢性乙肝及肝癌患者作為對(duì)照組，利用ROC曲線分析各腫瘤標(biāo)志物對(duì)乙肝肝硬化的診斷效能，單項(xiàng)指標(biāo)僅CEA和CA125的AUC＞0.700（AUC=0.719、0.734），其余指標(biāo)（包括GP73）的AUC均＜0.600。

表4 GP73與其它9種腫瘤標(biāo)志物及聯(lián)合預(yù)測(cè)因子診斷肝癌的AUC

2.5 血清GP73與9種腫瘤標(biāo)志物與肝癌臨床分期的關(guān)系 所有腫瘤標(biāo)志物的血清水平均隨著肝癌臨床分期的增加而逐步升高；經(jīng)Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，除CEA外的其余指標(biāo)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

圖2 GP73、其它9種腫瘤標(biāo)志物及聯(lián)合預(yù)測(cè)因子診斷肝癌的ROC曲線

3 討論

肝癌的診斷，特別是早期診斷一直是臨床研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。作為目前最有效、最常用的標(biāo)志物，AFP雖應(yīng)用于臨床數(shù)十年，但其敏感性?xún)H40%～65%，特異性?xún)H76%～96%。GP73的發(fā)現(xiàn)似乎為這一難題的解決提供了契機(jī)，但國(guó)內(nèi)外的研究結(jié)論并不完全一致。Marrero等[1]、Riener等[7]及國(guó)內(nèi)的Mao等[3]、Hu等[8]均認(rèn)為GP73比AFP更有效，但Morota等[9]和楊穎等[10]則認(rèn)為GP73和AFP的診斷價(jià)值相當(dāng)（其AUC分別為0.78和0.81）。由此，GP73和AFP及其它腫瘤標(biāo)志物的聯(lián)合檢測(cè)可能有更好的診斷價(jià)值[3，7，11]。

本研究結(jié)果表明，血清GP73與AFP、CEA、SF、CA19-9、CA15-3、CA125、ALP、GGT、LAP均有一定的相關(guān)性（均P＜0.05），但除CA125外，肝癌組比非肝癌組的相關(guān)性要差，這提示GP73與其它腫瘤標(biāo)志物存在互補(bǔ)的可能，且慢性乙肝組、乙肝肝硬化組、肝癌組血清GP73與其它9種腫瘤標(biāo)志物水平均高于正常對(duì)照組，特別是肝癌組的GP73、AFP、LAP的血清水平均顯著高于其他組（均P＜0.05）。因此，如將GP73與AFP、LAP等腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)，則有可能提高診斷效能。

聯(lián)合診斷試驗(yàn)一般有兩種方法，即平行（或稱(chēng)并聯(lián)）試驗(yàn)和系列（或稱(chēng)串聯(lián)）試驗(yàn)，兩者無(wú)法同時(shí)提高敏感性和特異性。其中平行試驗(yàn)，即一系列試驗(yàn)中任何一試驗(yàn)呈陽(yáng)性其結(jié)果即判為陽(yáng)性，提高了敏感性（至少是相等），卻降低了特異性；而系列試驗(yàn)，即一系列試驗(yàn)中所有試驗(yàn)均為陽(yáng)性其結(jié)果才判為陽(yáng)性，提高了特異性（至少是相等），卻降低了敏感性。但是通過(guò)多因素logistic回歸分析構(gòu)建新的預(yù)測(cè)模型，可以有效解決上述問(wèn)題[6]。ROC曲線分析結(jié)果表明，單項(xiàng)指標(biāo)中，以GP73的診斷價(jià)值最好（AUC=0.792），但與AFP和ALP的差異不大，這與Morota等[9]和楊穎等[10]的觀點(diǎn)一致；而聯(lián)合預(yù)測(cè)因子的AUC顯著高于其它所有單項(xiàng)指標(biāo)（均P＜0.05），證明聯(lián)合檢測(cè)確實(shí)可以提高肝癌的診斷效能。

總之，GP73單項(xiàng)檢測(cè)對(duì)HBsAg陽(yáng)性肝癌有較好的診斷價(jià)值，GP73聯(lián)合AFP、CEA、SF、CA19-9、CA15-3、CA125、ALP、GGT、LAP檢測(cè)可有效提高對(duì)肝癌的診斷效能。由于本文所選擇的病例有限，在異質(zhì)性、研究人群、測(cè)試設(shè)備或方法等方面難免存在偏倚，更確切的結(jié)論還需要多中心、大樣本的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)其進(jìn)行支持。

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[3]Mao Y,Yang H,Xu H,et al．Golgi protein 73(GOLPH2)is a valuable serum marker for hepatocellular carcinoma[J]．Gut,2010,59(12)：1687-1693．

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Single detection of Golgi protein 73 and combined with other serum tumor markers in diagnosis of HBsAg-positive hepatocellular car-cinoma

Objective To evaluate single detection of Golgi protein 73(GP73)or combined with other serum tumor markers in diagnosis of HBSAg-positive hepatocellular carcinoma(HCC)．MethodsSerum samples were collected from 133 cases of HBsAg-positive HCC,85 cases of chronic hepatitis B (CHB),74 cases of liver cirrhosis(LC)infected with HBV and 46 healthy subjects．Serum levels of GP73,AFP,CEA,SF,CA19-9,CA15-3,CA125,ALP,GGT and LAP were assayed and the results were analyzed．ResultsSpearman correlation analysis showed that levels of serum GP73 was associated with the levels of AFP,CEA, SF,CA19-9,CA15-3,CA125,ALP,GGT and LAP(P＜0．05),not with CA125;the correlation coefficient of AFP,GGT and LAP in HCC group were lower than that in non-HCC group(P＜0．05)．There were significant differences in serum levels of GP73,AFP, CEA,SF,CA19-9,CA15-3,CA125,ALP,GGT and LAP between CHB,LC,HCC patients and normal controls(P＜0．05)．The serum levels of GP73,AFP and LAP in HCC group were significantly higher than those in other groups(P＜0．05)．ROC curve analysis showed that there was no significant difference in area under ROC among GP73,AFP and ALP (Z=0．127 and 1．908 respectively,P=0．899 and 0．056 respectively),although the AUC of GP73 was the largest(AUC=0．792）．By logistic regression,we used all these indicators to build a new prediction model．The results showed that the AUC of the combined markers was significantly higher than any single markers(P＜0．05)．ConclusionGP73 is a high sensitive and specific serum mark for diagnosis of PHC and the detection of GP73 combined with AFP,CEA,SF,CA19-9,CA15-3,CA125,ALP,GGT and LAP can improve the diag-nostic value for HBsAg-positive HCC patients．

Hepatocellular carcinoma Golgi protein 73 Alpha fetoprotein ROC curve

2013-07-05）

（本文編輯：嚴(yán)瑋雯）

國(guó)家自然科學(xué)基金（81101485）；天晴肝病研究基金（TQGB20120081）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生一般研究計(jì)劃（2011KYB107）

325035 溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院、生命科學(xué)學(xué)院（董飛波，現(xiàn)在在寧波市第二醫(yī)院檢驗(yàn)科工作）；溫州醫(yī)科大學(xué)附屬臺(tái)州醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室（顏衛(wèi)華）；寧波市第二醫(yī)院檢驗(yàn)科（高國(guó)生），肝病二科（徐曉珍）；武漢大學(xué)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科（祝成亮）

顏衛(wèi)華，E-mail:yanwh@tzhospital.com