轉(zhuǎn)Temporin-GFP山羊乳腺上皮細(xì)胞株的篩選和鑒定

王春生，張志崇，張秋婷，樸善花，仇雨歌，安鐵洙

(東北林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

自Wilmut等［1］獲得體細(xì)胞核移植后代“多利”以來，體細(xì)胞核移植技術(shù)獲得快速發(fā)展。Baguis等［2］(1999)采用體細(xì)胞核移植技術(shù)首次獲得了克隆山羊。此外，Keefer等［3］用外源基因轉(zhuǎn)染的體細(xì)胞為核供體，通過體細(xì)胞核移植方法獲得轉(zhuǎn)基因山羊。目前，利用體細(xì)胞核移植技術(shù)已成為制作轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的有效手段。為了建立通過山羊乳汁獲得抗菌肽(Antimicrobial peptides，ABP)的方法，本研究利用在前期工作［3］獲得的中國林蛙皮膚ABP的真核表達(dá)載體Tem－GFP－pBC1，轉(zhuǎn)染山羊乳腺上皮細(xì)胞以獲得便于檢測(cè)并能在山羊乳腺特異表達(dá)Tem－GFP的轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞。本研究進(jìn)一步開展通過體細(xì)胞核移植獲得山羊乳腺特異表達(dá)ABP的轉(zhuǎn)基因山羊的相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞 山羊乳腺上皮細(xì)胞(由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)高學(xué)軍教授饋贈(zèng))。

1.1.2 主要藥品和試劑 SalI(TaKaRa);脂質(zhì)體Lipofectamine 2000(invitrogen);基因組DNA提取試劑盒(TaKaRa);RNA提取試劑RNAiso plus(TaKaRa)。

1.1.3 重組質(zhì)粒Tem－GFP－pBC1 利用前期工作［3］中構(gòu)建的重組質(zhì)粒Tem－GFP－pBC1，即在提取中國林蛙皮膚抗菌肽Temporin－1CEa mRNA基礎(chǔ)上，通過反轉(zhuǎn)錄獲得其cDNA。利用cDNA、pEASY－T3克隆載體和GFP基因構(gòu)建獲得山羊乳腺特異表達(dá)的重組質(zhì)粒Tem－GFP－pBC1。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 山羊乳腺上皮細(xì)胞的傳代 采用常規(guī)方法，將冷凍保存的山羊乳腺上皮細(xì)胞經(jīng)解凍復(fù)蘇后，在二氧化碳培養(yǎng)箱中(37℃，5%CO2，飽和濕度)進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到90%以上匯合時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 山羊乳腺上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞的篩選 采用王春生等［5］方法，用通過SalI單酶切后線性化的重組質(zhì)粒Tem－GFP－pBC1或者空載體pEASY－T3(對(duì)照組)對(duì)山羊乳腺上皮細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，48 h后，利用含有400 μg/mL G418(預(yù)篩選的最佳濃度)選擇培養(yǎng)基進(jìn)行轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞篩選。

1.2.3 轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的鑒定 將上述獲得的轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，觀察其細(xì)胞形態(tài)、生長曲線、冷凍復(fù)蘇后增殖特點(diǎn)等。此外，根據(jù)基因組DNA提取試劑盒說明提取上述篩選獲得的轉(zhuǎn)Tem－GFP－pBC1的陽性細(xì)胞的基因組DNA。采用根據(jù)Tem－GFP－pBC1序列設(shè)計(jì)的引物(5’－TCAAGGAGGATGGCAACA－3’和5’－GTGGACAGGTAGT GGTTATC－3’)對(duì)細(xì)胞基因組DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞的Tem－GFP基因RT－PCR檢測(cè) 根據(jù)Genbank中山羊GAPDH基因序列和插入基因 Tem－GFP 序列，利用 Oligo6.0和Primer 6.0軟件，分別設(shè)計(jì)1對(duì)RT－PCR引物(GAPDH:5’－ATCACTG CCACCCAGAAGACT－3’和 5’－CATGCCAGTGAGCTTCCCGTT－3’;Tem－GFP:5’－TCAAGGAGGATGGCAACA－3’和5’－GTGGACAGGTAGTGGT TATC－3’);采用Trizol法分別提取轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞的總RNA，并經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA;。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng):采用25μL反應(yīng)體系進(jìn)行，反應(yīng)混合物包括10×buffer 2.5μL(含 MgCl2)，cDNA1.5μL，引物各 0.5μL，dNTP 0.5μL，Taq 酶 0.3μL，ddH2O 19.7μL。反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5min，94℃變性30 s，60℃復(fù)性30 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán);72℃延伸10min后保存于4℃。擴(kuò)增結(jié)束后，取5μL PCR產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，并用凝膠成像系統(tǒng)記錄結(jié)果。

2 結(jié)果分析

2.1 乳腺特異性表達(dá)載體Tem-GFP-pBC1的線性化

將乳腺特異性表達(dá)質(zhì)粒Tem－GFP－pBC1經(jīng)SalI單酶切進(jìn)行線性化，并通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，其結(jié)果，與未經(jīng)SalI單酶切的Tem－GFP－pBC1(陰性對(duì)照)的雙條帶不同，Tem－GFP－pBC1經(jīng)SalI單酶切后，僅能觀察到1條條帶(圖1)。

2.2 轉(zhuǎn)染Tem-GFP-pBC1的山羊乳腺上皮細(xì)胞

當(dāng)傳代培養(yǎng)的山羊乳腺上皮細(xì)胞(圖2)達(dá)到90%以上匯合時(shí)，采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染經(jīng)線性化的山羊乳腺特異表達(dá)載體Tem－GFP－pBC1，其結(jié)果，在轉(zhuǎn)染后的第24 h，在熒光倒置顯微鏡下可觀察到表達(dá)GFP的細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染后的第48 h，約有60%細(xì)胞表達(dá)GFP(圖3)。

圖1 Tem－GFP－pBC1的線性化電泳圖Fig.1 SalI digestion of Tem－GFP－pBC1

圖2 傳代培養(yǎng)的山羊乳腺上皮細(xì)胞(50×)Fig.2 Subculture goat mammary epithelial cells(50×)

2.3 轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞的篩選

將上述經(jīng)轉(zhuǎn)染48 h的轉(zhuǎn)Tem－GFP－pBC1陽性細(xì)胞，利用G418進(jìn)行陽性細(xì)胞篩選，其結(jié)果，獲得在熒光倒置顯微鏡下發(fā)出綠色熒光(表達(dá)GFP)的轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞(圖4)。

2.4 轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞的鑒定

2.4.1 轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞的形態(tài) 在熒光倒置顯微鏡下，轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞(圖5)和傳代培養(yǎng)的山羊乳腺上皮(圖2)一樣，分散的細(xì)胞呈現(xiàn)梭形，而堆積存在的細(xì)胞呈現(xiàn)圓形或橢圓形。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到90%以上匯合時(shí)，細(xì)胞的形態(tài)呈現(xiàn)圓形或橢圓形(圖6)。

圖3 轉(zhuǎn)染Tem－GFP－pBC1后第48 h的表達(dá)GFP的山羊乳腺上皮細(xì)胞(50×)Fig.3 goat mammary epithelial cells could express GFP after transfection 48h(50×)

圖4 篩選特異表達(dá)GFP的轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞(50×)Fig.4 G418－resistant cells express GFP specially(50×)

圖5 傳代培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞(50×)Fig.5 Subculture of positive transgenic cells(50×)

圖6 90%以上匯合的轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞(50×)Fig.6 above 90%confluence transgenic cell(50×)

圖7 轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的生長曲線Fig.7 The growth curve of goat mammary epithelial cells transfected by Tem－GFP－pBC1

2.4.2 轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞的生長曲線 將獲得的轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞進(jìn)行續(xù)培養(yǎng)時(shí)，于續(xù)培養(yǎng)后的第24 h開始貼壁，前4 d生長緩慢，第9天時(shí)細(xì)胞匯合至約90%，而第10天始趨于平穩(wěn)，其生長曲線呈“S”形，符合細(xì)胞生長的生物學(xué)規(guī)律(圖7)。

2.4.3 轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞的冷凍復(fù)蘇后的生物學(xué)特性 將冷凍保存的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇后進(jìn)行續(xù)培養(yǎng)，并在熒光倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)，其結(jié)果，和正常傳代培養(yǎng)的山羊乳腺上皮細(xì)胞一樣，分散時(shí)呈現(xiàn)梭形，當(dāng)?shù)竭_(dá)90%以上匯合時(shí)，呈現(xiàn)圓形或橢圓形(圖未顯示);當(dāng)對(duì)復(fù)蘇的細(xì)胞進(jìn)行續(xù)培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)后24 h開始貼壁，前4 d生長緩慢，第9天時(shí)細(xì)胞匯合達(dá)到90%以上，10 d后趨于平穩(wěn)，整個(gè)過程呈現(xiàn)“S”型(圖7)。

2.4.4 轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞的PCR鑒定 轉(zhuǎn)染Tem－GFP－pBC1后，收集利用含G418的培養(yǎng)基篩選的具有正常增殖能力的山羊乳腺上皮細(xì)胞，提取其基因組，利用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可得與陽性對(duì)照(Tem－GFP－pBC1質(zhì)粒)相一致的約240 bp的目的條帶(圖8)。

圖8 轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的PCR鑒定Fig.8 PCR identification of transgenic cells

圖9 RT－PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.9 Electrophoresis of RT－PCR product

2.4.5 轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的Tem－GFP相對(duì)表達(dá)量的檢測(cè) 將RT－PCR的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后，轉(zhuǎn)染前后GAPDH基因表達(dá)量持平，未轉(zhuǎn)染細(xì)胞沒有檢測(cè)到抗菌肽基因的表達(dá)，而轉(zhuǎn)染細(xì)胞可以檢測(cè)到與理論值一致的目的條帶(如圖9)。

3 討論

ABP是廣泛存在于生物體內(nèi)的一種由20～60個(gè)氨基酸構(gòu)成的具有生物活性的小分子多肽［6－8］由于ABP具有相對(duì)分子質(zhì)量低、較好的水溶性、低抗原性和較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，且抗菌肽是通過增加原核細(xì)胞膜的通透性而誘發(fā)抑菌或殺菌，不易引起病原體對(duì)其產(chǎn)生耐藥性等生物學(xué)特性［9－10］。為了獲取ABP的方法，許多學(xué)者探索了直接利用昆蟲、兩棲類動(dòng)物組織等提取ABP的方法，但是，存在操作復(fù)雜、產(chǎn)量低、成本高等缺陷，難以獲得大量高純度的ABP［11］。

自Simons等［12，13］首次利用轉(zhuǎn)基因小鼠的乳腺表達(dá)綿羊β－球蛋白獲得成功以來，該項(xiàng)技術(shù)已不斷完善。以乳腺作為生物反應(yīng)器大量生產(chǎn)生物活性蛋白變得可能［14］。隨著體細(xì)胞克隆技術(shù)的不斷完善，通過外源 DNA 轉(zhuǎn)染的體細(xì)胞為核供體的體細(xì)胞核移植轉(zhuǎn)基因綿羊［15］、牛［16］、豬［17，18］和山羊［3］相繼獲得成功。上述結(jié)果表明，如果利用目的基因構(gòu)建乳腺特異的表達(dá)載體，經(jīng)轉(zhuǎn)染體細(xì)胞后獲得轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞，再通過體細(xì)胞核移植的方法就有可能獲得目的基因在乳腺中特異表達(dá)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。

為了建立通過山羊乳汁獲得中國林蛙抗菌肽的方法，本研究在對(duì)前期工作中獲得山羊乳腺特異表達(dá)的真核表達(dá)載體Tem－GFP－pBC1轉(zhuǎn)染傳代培養(yǎng)的山羊乳腺上皮細(xì)胞，并經(jīng)G418篩選獲得轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞。其結(jié)果，將線性化的Tem－GFP－pBC1(圖1)轉(zhuǎn)染傳代培養(yǎng)的山羊成纖維細(xì)胞(圖2，3)后，經(jīng)G418篩選獲得轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞(圖4);轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞和經(jīng)冷凍復(fù)蘇的轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞進(jìn)行續(xù)培養(yǎng)后，其細(xì)胞形態(tài)(圖5，6)和生長曲線(圖7)均正常;經(jīng)PCR檢測(cè)Tem－GFP－pBC1已整合入山羊乳腺上皮細(xì)胞的基因組中(圖8)，且與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞大量表達(dá)抗菌肽基因Tem(圖9)。上述結(jié)果表明，本研究獲得了能夠在山羊乳腺中特異表達(dá)Tem－GFP融合蛋白的轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞。能否利用該細(xì)胞通過體細(xì)胞核移植方法獲得乳腺特異表達(dá)中國林蛙抗菌肽的轉(zhuǎn)基因山羊有待于探討。

［1］Willmut I，Schnieke A E，McWhir J，et al.Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells［J］.Nature，1997，385(2):810－813.

［2］Baguis A，Behboodi E，Melican D T，et al.Production of goats by somatic cell nuclear transfer［J］.Nature Biotehnol，1999，17:456－461.

［3］Keefer C L，Baldassarre H，Keyston R，et al.Generation of dwarf goat(Capra hircus)clones following nuclear transfer with transfected and nontransfected fetal fibroblasts and in vitro－matured oocytes［J］.Biology of Reproduction，2001，64:849－856.

［4］張志崇，王春生，張秋婷，等.中國林蛙抗菌肽 Temporin－1CEa基因的真核表達(dá)載體構(gòu)建［J］.經(jīng)濟(jì)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2012，16(1):26－30.

［5］王春生，劉欣，原璐，等.轉(zhuǎn) pK2.10－擬蜘蛛 spidriod1基因綿羊成纖維細(xì)胞株的篩選［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2009，40(8):1262－1265.

［6］柴曉杰，王丕武，徐雅維，等.［J］.中國飼料，2005(4):15－17.

［7］Zasloff M.Antimicrobial peptides of multicellular organisms［J］.Nature，2002，415:389－394.

［8］布冠好，李宏基，楊國宇，等.抗菌肽的作用特點(diǎn)及應(yīng)用前景［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2005，26(3):26－28.

［9］Thompson A H，Bjourson A J，Orr D F，et al.A combined mass spectrometric and cDNA sequencing approach to the isolation and characterization of novel ant imicrobial peptides from the skin secretions of Phyllomedusa hypochondrialis azurea［J］.Peptides，2007，28(7):1331－1343.

［10］虞鳳慧，張麗芳，李俊峰，等.中國林蛙皮膚抗菌肽基因的cDNA克隆及抗菌、抗癌和溶血活性的測(cè)定［J］.生物工程學(xué)報(bào)，2009，25(1):101－108.

［11］中國林蛙皮抗菌肽提取條件的優(yōu)化研究［J］.食品科學(xué)，2008，29(10):223－227.

［12］Simons J P，McClenaghan M，Clark A J.Alteration of the quality of milk by expression of sheep β－lactoglobulin in transgenic mice［J］.Nature，1987，328(6130):530－532.

［13］Simons J P，Land R B.Transgenic livestock［J］.J Reprod Fertil Suppl，1987，34:237－250.

［14］王慶忠，李國榮，李云龍，等.乳腺生物反應(yīng)器的研究現(xiàn)狀和產(chǎn)業(yè)化前景［J］.生命科學(xué)，2005，17(1):76－81.

［15］Schnieke A E，Kind A J，Ritchie W A，et al.Human factorⅨ transgenic sheep produced by transfer of nuclei from transfected fetal fibroblasts［J］.Science，1997，278(5346):2130－2133.

［16］Cibelli J B，Stice S L，Golueke P J，et al.Cloned transgenic calves produced from nonquiescent fetal fibroblasts［J］.Science，1998，289(5367):1256－1258.

［17］Hao Y H，Yong H Y，Murphy C N，et al.Production of endothelial nitric oxide synthase(eNOS)over－expressing piglets［J］.Transgenic Research，2006，15(6):739－750.

［18］Lai L X，Park K W，Cheong H T，et al.Transgenic pig expressing the enhanced green fluorescent protein produced by nuclear transfer using colchicines－treated fibroblasts as donor cells［J］.Molecular Reproduction and Development，2002，62(3):300－306.