黑龍江省大豆鐮孢根腐病菌鑒定及致病力分析

張 麗， 耿肖兵， 王春玲， 李永剛*

（1.東北農業(yè)大學大豆生物學教育部重點實驗室，哈爾濱 150030；2.黑龍江省高校寒地作物品種改良與生理生態(tài)重點開放實驗室，哈爾濱 150030）

黑龍江省大豆鐮孢根腐病菌鑒定及致病力分析

張 麗1，2， 耿肖兵1，2， 王春玲1，2， 李永剛1，2*

（1.東北農業(yè)大學大豆生物學教育部重點實驗室，哈爾濱 150030；2.黑龍江省高校寒地作物品種改良與生理生態(tài)重點開放實驗室，哈爾濱 150030）

摘要對黑龍江省不同區(qū)域采集的大豆根腐病病原種類進行鑒定，結果表明：分離的296個真菌分離物分屬于10個種，分別為尖鐮孢（Fusarium oxysporum）、茄鐮孢（F.solani）、木賊鐮孢（F.equiseti）、輪枝鐮孢（F.verticillioides）、半裸鐮孢（F.semitectum）、大豆擬莖點種腐病菌（Phomopsis longicolla）、瓜果腐霉（Pythium aphanidematum）、茄絲核菌（Rhizoctonia solani）、禾谷鐮孢（F.graminearum）、厚垣鐮孢（F.chlamydosporum），各分離物分離頻率分別為68.24%、7.09%、5.41%、4.05%、3.38%、3.38%、3.04%、2.70%、2.03%和0.68%。利用‘合豐25’測定所有鐮孢菌分離物的致病力，病情指數(shù)在30以上的分離物占鐮孢菌總數(shù)的23.42%，其中尖鐮孢為18.22%。在中等以上（病情指數(shù)＞30）致病力鐮孢菌分離物中，尖鐮孢占77.78%。黑龍江省不同地理區(qū)域均有致病力較強的分離物，分布不均勻。大豆花芽分化期分離的致病力較強，尖鐮孢出現(xiàn)頻率比鼓粒期大。本研究為大豆根腐病的田間防治和抗源篩選的研究奠定了基礎。

關鍵詞大豆； 根腐??； 病原菌； 尖鐮孢； 致病力

大豆鐮孢根腐病是影響我國大豆單產最嚴重的威脅之一，一般使大豆減產10%～30%，重病地區(qū)可減產60%，甚至絕產［1］。種植大豆年限愈久的地塊發(fā)病愈重，產量越低。大豆根腐病主要危害植株根系，從而影響根系對水分和養(yǎng)分的吸收，造成植株生長緩慢，產量降低［2］。

引起大豆根腐病的病原菌有多種真菌，但主要致病菌的種類變化不大。王曉艷等［3］2011年在東北三省大豆主產區(qū)分離到8種鐮孢菌對大豆均有致病力，其中尖鐮孢（Fusarium oxysporum Schl.）有強致病力；茄鐮孢［F.solani（Mart.）Sacc.］、禾谷鐮孢（F.graminearum Schw.）、半裸鐮孢（F.semitectum Berk.＆Ravenel）、燕麥鐮孢［F.avenaceum（Fr.）Sacc.］、木賊鐮孢［F.equiseti（Corda）Sacc.］和厚垣鐮孢［F.chlamydosporum（Corda）Sacc.］均為中等致病力，輪枝鐮孢［F.verticillioides（Sacc.）Nirenberg］為弱致病力。邢安2009年從黑龍江不同地區(qū)通過形態(tài)學鑒定出8種鐮孢菌，它們是尖鐮孢、木賊鐮孢、茄鐮孢、半裸鐮孢、輪枝鐮孢、燕麥鐮孢、禾谷鐮孢及藍色鐮孢（F.coeruleum Lib.ex Sacc.），其中尖鐮孢和茄鐮孢的分離頻率最高［4］。白麗艷等自新疆阿勒泰地區(qū)采集分離的鐮孢菌屬菌株分別為尖鐮孢、茄腐鐮孢、禾谷鐮孢、茄鐮孢藍色變種、燕麥鐮孢和節(jié)狀鐮孢。其中，對‘黑河5號’致病力測定中尖鐮孢為大豆鐮孢根腐病病原菌中出現(xiàn)頻率最高且致病力最強的優(yōu)勢致病種，茄鐮孢次之［5］。馬淑梅2012年從黑龍江省大豆產區(qū)100個地點采集根腐病株，分離鐮孢菌42.7%，腐霉菌25.2%，立枯絲核菌7%，疫霉菌25.2%［6］。總體上，鐮孢菌在所有分離物中分離的頻率最高。

目前的研究報道均認為尖鐮孢是大豆根腐病的優(yōu)勢致病種，其引起的根腐病是大豆苗期的一種常發(fā)性土傳病害，危害較重，根治困難［7-8］。明確大豆根腐病致病菌種類和分布對病害防治時期和用藥種類十分重要，而解決該病危害最經濟有效的措施是種植抗病品種，選擇具有代表性的分離物進行抗源篩選是防治的前提和基礎［6］。因此，全面開展黑龍江省大豆根腐病病原種類、分布調查及致病力分析等工作具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料

真菌分離與純化：本試驗于2011年6月和9月從哈爾濱、佳木斯、齊齊哈爾及黑河地區(qū)等采集大豆根腐病花芽分化期病株和鼓粒期病株。采用常規(guī)組織分離法分離真菌。將病害標樣，用自來水反復沖洗，每病株取病健交界處的組織1塊，75%的乙醇消毒2 s，然后用0.1%升汞液消毒3 min，滅菌水洗3～4次后，移植于平板培養(yǎng)基上，置于26℃恒溫箱中培養(yǎng)，48 h后純化，不同分離物轉移至帶PDA培養(yǎng)基的試管中4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

供試品種：大豆品種‘合豐25’由大豆生物學教育部重點實驗室提供。

1.2 分離物鑒定及致病力測定

1.2.1 形態(tài)學鑒定

挑取純化后的分離物，轉移至PDA培養(yǎng)基上，26℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)4 d后，進行鑒定。如是鐮孢菌則接種至PDA和SNA兩種培養(yǎng)基，參照文獻［4］對分離物進行形態(tài)學鑒定；大豆擬莖點種腐病菌參照文獻［9］，立枯絲核菌參照文獻［10］，腐霉菌參照文獻［11］進行形態(tài)學鑒定。

1.2.2 鐮孢菌致病力測定

將所有的鐮孢菌分離物分別在PDA平板上培養(yǎng)4 d，打取直徑7 mm的菌碟接種到高粱粒培養(yǎng)基中，每個三角瓶（每250 m L三角瓶裝1／5高粱粒）中接種5個菌碟，26℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，期間每天振蕩三角瓶1次，待菌絲布滿每一個高粱粒表面即可用于接種，大約需要5 d左右。將無菌蛭石裝入8 cm培養(yǎng)缽中，約為容量的1／3，每缽約10粒帶菌高粱粒，覆上0.2 cm無菌蛭石，播種經10%次氯酸鈉消毒處理的大豆品種（‘合豐25’），每缽10粒種子，再在種子表面覆蓋2 cm無菌干蛭石，放入不銹鋼盤中，以未接種分離物的植株作對照，每個處理3次重復，試驗重復2次。澆足水后放在25℃光暗交替各12 h條件下培養(yǎng)，正常管理，10 d后調查結果。

病情分級參照白麗艷等［5］提出的標準略有改進，將根腐病嚴重度劃分為5個級別。

0級：無??；

1級：須根根尖輕微變黑，主根不變，植株生長正常；

3級：須根根尖變黑，主根輕微變黑嚴重，植株生長正常；

5級：主根變黑嚴重，地上部生長不良，或下胚軸腐爛，植株生長矮?。?/p>

7級：根部腐爛，植株死亡。

大豆鐮孢根腐病菌對大豆品種（‘合豐25’）的致病力評價，病情指數(shù)≤30為弱致病力；30＜病情指數(shù)≤70為中等致病力；病情指數(shù)＞70為強致病力。

1.2.3 接種發(fā)病后的再分離

凡致病力測定中對照不發(fā)病，而接種植株有發(fā)病的，采用組織分離法再次分離發(fā)病組織，獲得與第一次從田間病株相同形態(tài)的分離物，確定這些分離物為大豆根腐病的致病菌。

2 結果與分析

2.1 不同地理區(qū)域大豆根腐病菌鑒定

在大豆的花芽分化期和鼓粒期采集田間根腐病株600株，采用組織分離法分離病原菌，進行柯赫氏法則驗證。通過形態(tài)學鑒定，確定296個分離物為致病菌，結果如表1所示。

296個分離物分屬于10個種，鐮孢菌占分離大豆根腐病病原菌總數(shù)的90.88%。尖鐮孢占病原菌總數(shù)的68.24%，茄鐮孢占7.09%，木賊鐮孢占5.41%，輪枝鐮孢占4.05%，大豆擬莖點種腐病菌占3.38%，瓜果腐霉占3.04%，立枯絲核菌占2.70%。上述結果表明，黑龍江省大豆根腐病田間優(yōu)勢菌株為尖鐮孢。從幼苗根部分離到大豆擬莖點種腐病菌，所占比率為3.38%，是今后黑龍江省大豆生產上需要重點關注的病害之一。

表1 黑龍江省大豆根腐病株真菌分離物的種類鑒定Table 1 Identification of fungal isolates causing soybean root rot in Heilongjiang Province

2.2 大豆鐮孢根腐病菌的致病力測定

上述結果表明，大豆根腐病菌中鐮孢菌出現(xiàn)頻率最高。因此，本試驗選取鐮孢菌分離物進行致病力的分析，結果如表2所示。

表2 大豆鐮孢根腐病菌分離物致病力的測定Table 2 Virulence of Fusarium spp.causing soybean root rot

從表中可以看出，尖鐮孢占鐮孢菌總數(shù)的75.09%，其他鐮孢菌出現(xiàn)頻率均小于8%，本研究所采集的地理區(qū)域中田間優(yōu)勢菌株為尖鐮孢。從致病力范圍來看，致病力較強的菌株主要出現(xiàn)在尖鐮孢、茄鐮孢和木賊鐮孢，其他鐮孢菌致病力相對較弱。

黑龍江省不同地理區(qū)域均有致病力較強的分離物，病情指數(shù)在30以上的鐮孢菌占鐮孢菌總數(shù)的23.42%，其中尖鐮孢占18.22%、茄鐮孢占1.86%、輪枝鐮孢占1.49%、木賊鐮孢占1.12%和半裸鐮孢占0.74%，而未發(fā)現(xiàn)禾谷鐮孢和厚垣鐮孢的中等以上致病力的分離物。尖鐮孢在中等（病情指數(shù)＞30）致病力以上的鐮孢菌分離物中占77.78%，在大豆根腐病菌中所占比例最大。

依據(jù)黑龍江省地理區(qū)域劃分對尖鐮孢的致病力分布進行分析，哈爾濱和齊齊哈爾市的致病力較強分離物出現(xiàn)頻率大，分別占36.51%和23.81%，而黑河地區(qū)、佳木斯和雞西地區(qū)出現(xiàn)頻率較小，分別占17.46%、15.87%和6.35%。

將不同地理區(qū)域采集的分離物按采集時大豆的生育期進行分析，病情指數(shù)達到30以上的尖鐮孢分離物，68.25%分離自大豆花芽分化期病株，而來自鼓粒期的分離物所占比例為31.75%，表明從花芽分化期發(fā)病植株所分離出來致力較強尖鐮孢出現(xiàn)頻率大于成株。

3 討論

土傳病害的病原菌種類及數(shù)量因受到氣候因子、多種土壤類型演替和生物因子等因素影響，其變化較快［13］。王曉艷等［3］2011年研究認為黑龍江省大豆鐮孢根腐病的致病菌為尖鐮孢、茄鐮孢、禾谷鐮孢、半裸鐮孢、燕麥鐮孢、木賊鐮孢、厚垣鐮孢和輪枝鐮孢8種鐮孢菌，而本研究中發(fā)現(xiàn)了其中7種鐮孢菌，未發(fā)現(xiàn)燕麥鐮孢。與邢安等［4］2009年報道的結果相比，增加了厚垣鐮孢，而沒有藍色鐮孢和燕麥鐮孢。馬淑梅［6］2012年研究黑龍江省大豆根腐病菌種類發(fā)現(xiàn)，鐮孢菌占42.7%，腐霉菌為25.2%，立枯絲核菌為7%，疫霉菌為25.2%。不同研究所獲得的數(shù)據(jù)存在較大差異，主要和研究目的、采樣時間、地點和樣品量、分離方法、培養(yǎng)基種類及分離的目標菌有關。

大豆尖鐮孢為田間優(yōu)勢種得到眾多研究者公認。但是，本研究結果比以往研究［3-6］中尖鐮孢出現(xiàn)頻率更大且毒力更強，鐮孢菌占分離的病原菌總數(shù)的90.88%，尖鐮孢占病原菌總數(shù)的68.24%。分析原因是本研究分離物每病株僅分離1塊組織，且均為病健交界明顯的部位，而王曉艷和邢安則是1株病株分離多塊組織；同時，也與采集的時期、地點、接種方法及接種體的數(shù)量存在較大關系，最終導致分離的不同鐮孢菌出現(xiàn)頻率差別較大和較多的毒力強的菌株。而且，在本研究中從大豆幼苗根腐病株根部首次分離到大豆擬莖點種腐病菌（P.longicolla），所占比率為3.16%，該菌能引起大豆成株期莖枯病，是一種對大豆危害極為嚴重的病害［9］，在大豆生產過程中是值得關注和深入研究的。本研究認為目前大豆根腐病的防治和抗病育種重點工作仍需放在尖鐮孢上，這是大豆根腐病今后一段時間內研究的重點。

從分離地理區(qū)域來看，不同地理區(qū)域所分離到的分離物致病力存在差別，哈爾濱和齊齊哈爾市采集的尖鐮孢致病力強的分離物出現(xiàn)頻率較大。經初步分析，認為哈爾濱和齊齊哈爾地區(qū)和采集的大豆病株多為大面積種植的地塊，重迎茬相對嚴重，而黑河、雞西和佳木斯地區(qū)采集病株的地域相對種植面積較小，重迎茬較少。總體上說來，不同地理區(qū)域均有存在致病力強的分離物，但致病力強的分離物分離頻率存在差異。

從花芽分化期和鼓粒期大豆根腐病株所分離的尖鐮孢致病力分析，來自花芽分化期分離出來的尖鐮孢致病力強的分離物出現(xiàn)頻率較大。分析原因所在，尖鐮孢一般在溫度較低時（苗期）引起較嚴重的大豆根腐病，后期對大豆的影響較小，后期所分離的尖鐮孢有可能以腐生或弱寄生的較多。鑒于此，本研究認為對于大豆尖鐮孢抗源的篩選，以苗期鑒定為主是科學準確的，其結果可代表大多數(shù)品種對尖鐮孢的抗性表現(xiàn)。

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中圖分類號：S 435.29

文獻標識碼：A

DOI：10.3969／j.issn.0529-1542.2014.03.031

收稿日期：2013-05-30

修訂日期：2013-06-27

基金項目：東北農業(yè)大學大豆生物學教育部重點實驗室（SB12B01）；黑龍江省高校寒地作物品種改良與生理生態(tài)重點開放實驗室開放基金

*通信作者E-mail：neaulyg＠126.com

Identification and virulence of Fusarium spp.causing soybean root rot in Jeilongjiang Province

Zhang Li1，2， Geng Xiaobing1，2， Wang Chunling1，2， Li Yonggang1，2
（1.Key Laboratory of Soybean Biology in Chinese Ministry of Education，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China；2.Key Laboratory of Physiology，Ecology and Genetic Improvement of Cold Crops of Higher Education of Heilongjiang Province of China，Harbin 150030，China）

AbstractThe pathogens causing soybean root rot in Heilongjiang Province were identified.Totally，296 fungal isolates were isolated from diseased plants collected from Harbin，Jiamus，Heihe，Qiqihaer，and Jixi regions，and these isolates were identified as 10 fungal species，F(xiàn)usarium oxysporum，F(xiàn).solani，F(xiàn).equiseti，F(xiàn).verticillioides，F(xiàn).semitectum，Phomopsis longicolla，Pythium aphanidematum，Rhizoctonia solani，F(xiàn).graminearum，F(xiàn).chlamydosporum，and the proportion was 68.24%，7.09%，5.41%，4.05%，3.38%，3.38%，3.04%，2.70%，2.03%and 0.68%，respectively.Virulence test of the Fusarium isolates showed that 23.42%isolates were moderately or highly virulent to soybean variety.‘Hefeng 25’，with disease index of over 30 and F.oxysporum occupied for 18.22%.Among those isolates with disease index of over 30，F(xiàn).oxysporum occupied for 77.78%.The high virulent isolates were found in different geographic regions with uneven distribution in Heilongjiang Province.The higher virulent isolates from soybean‘Hefeng 25’at flower bud differentiation period occupied higher proportion than those at seed filling stage.This study laid a foundation for field control and resistant variety screening to soybean root rot.

Key wordssoybean； root rot； pathogen； Fusarium oxysporum； virulence