2011－2012年三種水稻矮縮病在我國的分布及發(fā)生調(diào)查

饒黎霞， 王震成， 吳建祥， 周雪平

（浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院生物技術(shù)研究所，國家水稻生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310058）

2011－2012年三種水稻矮縮病在我國的分布及發(fā)生調(diào)查

饒黎霞， 王震成， 吳建祥*， 周雪平*

（浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院生物技術(shù)研究所，國家水稻生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310058）

摘要水稻黑條矮縮病毒、南方水稻黑條矮縮病毒和水稻鋸齒矮縮病毒均可以引起水稻矮縮病。于2011－2012年，利用dot-ELISA和RT-PCR方法對江蘇、浙江、江西、廣西、海南、云南、貴州、四川、重慶、湖南等省的水稻矮縮病進(jìn)行調(diào)查。檢測結(jié)果表明，2011年水稻中3種矮縮病的病毒感染率分別為：水稻黑條矮縮病毒10.92%，南方水稻黑條矮縮病毒30.67%，水稻齒葉矮縮病毒4.62%。2012年水稻中3種矮縮病的病毒感染率分別為：水稻黑條矮縮病毒0.40%，南方水稻黑條矮縮病毒48.38%，水稻齒葉矮縮病毒26.32%。檢測結(jié)果說明2012年的南方水稻黑條矮縮病害、水稻齒葉矮縮病害重于2011年，水稻黑條矮縮病害輕于2011年。水稻黑條矮縮病主要發(fā)生于江蘇、浙江等??；南方水稻黑條矮縮病主要在廣西、海南、云南、貴州、重慶、浙江等省區(qū)流行；水稻齒葉矮縮病在廣西、海南、云南等地均有發(fā)生，且往往與南方水稻黑條矮縮病毒復(fù)合感染。

關(guān)鍵詞水稻黑條矮縮病毒； 南方水稻黑條矮縮病毒； 水稻齒葉矮縮病毒； dot-ELISA； RT-PCR

水稻病毒病是水稻上的重要病害之一。侵染我國水稻引起矮縮癥狀的病毒主要有水稻黑條矮縮病毒（Rice black-streaked dwarf virus，RBSDV）、南方水稻黑條矮縮病毒（Southern rice black-streakeddwarf virus，SRBSDV）、水稻齒葉矮縮病毒（Rice ragged stunt virus，RRSV），目前這3種病毒病嚴(yán)重危害我國的水稻生產(chǎn)，是防控上的重點(diǎn)。

RBSDV屬呼腸孤病毒科（Reoviridae）斐濟(jì)病毒屬（Fijivirus）［1］，主要經(jīng)灰飛虱（Laodelphax striatellus）傳播，一經(jīng)獲毒終身帶毒，不通過卵傳給下一代［2］。RBSDV能侵染水稻、玉米、麥類等禾本科植物，引起水稻黑條矮縮病、玉米粗縮病、小麥綠矮?。?］。20世紀(jì)50年代該病害在我國首次報(bào)道后，迄今為止已在我國至少16個省、自治區(qū)發(fā)生。2008年該病害又突然在山東、浙江、江蘇、安徽、江西等省暴發(fā)，危害嚴(yán)重。

SRBSDV于2001年由周國輝等在廣東陽西縣首次發(fā)現(xiàn)，是呼腸孤病毒科（Reoviridae）斐濟(jì)病毒屬（Fijivirus）一個新的暫定種，主要的傳播介體是白背飛虱（Sogatella furcifera）［4］。2008年擴(kuò)散至長江流域，2009－2010年在我國南方地區(qū)暴發(fā)成災(zāi)。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，2010年受災(zāi)水稻種植面積超過30萬hm2，失收面積超過6 500 hm2，是一次發(fā)生在水稻上的重大災(zāi)害［5］。此外，該病害也在越南北部造成了嚴(yán)重的危害，據(jù)2009年的調(diào)查顯示，越南北部19個省發(fā)病面積達(dá)到33.33萬hm2，絕收面積約0.67 hm2［6］。

RRSV為呼腸孤病毒科（Reoviridae）水稻病毒屬（Oryzavirus）成員，以褐飛虱為其主要傳毒媒介，褐飛虱以持久性方式傳播病毒［7］。1978年在我國首次發(fā)現(xiàn)以來，先后在湖南、浙江、江西、福建、廣東和臺灣等地檢出，但發(fā)病率較低。1980年后，田間常難以發(fā)現(xiàn)病株。2005年福建省再度檢出水稻齒葉矮縮病，近年呈上升趨勢，重病田產(chǎn)量損失達(dá)80%～90%［8-9］。

本研究對2011－2012年江蘇、浙江、江西、廣西、海南、云南、貴州、四川、重慶、湖南等地上述3種病毒病暴發(fā)流行重點(diǎn)區(qū)域進(jìn)行調(diào)查，采集具有矮縮癥狀的水稻及稻飛虱樣本，通過dot-ELISA、RTPCR及核酸測序進(jìn)行病原的鑒定檢測，初步了解其發(fā)生、流行情況，為我國水稻病毒病的預(yù)警預(yù)報(bào)及科學(xué)防控體系的建立打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

水稻樣品為2011－2012年我國南方稻區(qū)（江蘇、浙江、江西、湖南、重慶、四川、云南、貴州、廣西、海南等）表現(xiàn)矮縮癥狀的疑似感病水稻。

稻飛虱樣品來源于2011－2012年我國病害暴發(fā)重點(diǎn)區(qū)域（江蘇、浙江、廣西、海南、云南、貴州、重慶、四川、湖南等）。

1.2 RT-PCR檢測

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫報(bào)道的3種病毒CP序列設(shè)計(jì)特異性引物：SRBSDV-F：TGCACTTAGAAAAGGAGTCG，SRBSDV-R：TGCAGTGGTAGCTTTCTTA；RBSDV-F：CACGTTGCGCACTAATTACG，RBSDV-R：GGCGGAAAGTGCCTTCTTT；RRSV-F：ACCGTCGTTGAGCTACCATCCATT，RRSV-R：GGCGGGCCACTCAAACCAT。采用Trizol試劑（Invitrogen）提取水稻總RNA。利用天根公司的FastQuantcDNA第一鏈合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成病毒RNA的cDNA第一鏈。PCR反應(yīng)體系如下：2×Master Mix（Sigma）12.5μL、5′和3′引物各0.5μL、1μL反轉(zhuǎn)錄模板、dd H2O 10.5μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min，94℃變性30 s，設(shè)置相應(yīng)的退火溫度退火30 s（SRBSDV 48℃，RBSDV 51℃，RRSV 52℃），SRBSDV、RBSDV均延伸45 s，RRSV延伸30 s，進(jìn)行32個循環(huán)，最后一個循環(huán)后72℃再延伸10 min。取4μL PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳分析。部分樣品的PCR產(chǎn)物進(jìn)行核酸序列測定。

1.3 dot-ELISA檢測

dot-ELISA步驟參考劉歡、Wu等［10-11］，即取2μL病毒樣品研磨液上清或2μL單頭稻飛虱搗碎液點(diǎn)于硝酸纖維素膜（NC膜），植株樣品分別用感病葉及健康葉作陽性和陰性對照，稻飛虱樣品分別用帶毒飛虱和不帶毒飛虱作陽性和陰性對照；點(diǎn)樣后的NC膜室溫晾干15 min；膜用含5%脫脂奶粉的封閉液37℃封閉30 min后，加入適當(dāng)稀釋的相應(yīng)病毒單抗（本實(shí)驗(yàn)室制備）作為一抗，37℃孵育1 h；PBST緩沖液洗滌3～4次后將膜移入適當(dāng)稀釋的堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗鼠IgG的二抗中（Sigma公司產(chǎn)品）于37℃反應(yīng)1 h；洗滌4～5次，用NBT／BCIP（植株樣品）、TMB（稻飛虱樣品）底物顯色10～30 min，觀察記錄結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 dot-ELISA在水稻和稻飛虱檢測上的應(yīng)用及與RT-PCR的吻合率

分別對疑似感染SRBSDV、RBSDV、RRSV的3批水稻樣品進(jìn)行dot-ELISA、RT-PCR及核酸序列檢測。結(jié)果為：SRBSDV的檢測中，檢測到12個病毒陽性標(biāo)樣（圖1），與RT-PCR、核酸序列測定結(jié)果基本吻合，吻合率約95.45%。RBSDV的檢測中，檢測到10個病毒陽性標(biāo)樣（圖2），與RT-PCR、核酸序列檢測結(jié)果完全吻合，吻合率100%。RRSV的檢測中，檢測到6個病毒陽性標(biāo)樣（圖3），與RTPCR、核酸序列檢測吻合率90.00%。

圖2 水稻中RBSDV的dot-ELISA檢測結(jié)果Fig.2 Detection of RBSDV in field rice samples by dot-ELISA

圖3 水稻中RRSV的dot-ELISA檢測結(jié)果Fig.3 Detection of RRSV in field rice samples by dot-ELISA

對飼毒稻飛虱樣品進(jìn)行dot-ELISA檢測。34頭白背飛虱樣品中檢測出9頭呈藍(lán)色斑點(diǎn)反應(yīng)，帶毒率約26.47%（圖4）。34頭褐飛虱樣品中檢測出8頭呈藍(lán)色斑點(diǎn)反應(yīng)，帶毒率約23.53%（圖5）。

圖4 dot-ELISA檢測白背飛虱體內(nèi)SRBSDV結(jié)果Fig.4 Detection of SRBSDV in field whitebacked planthopper samples by dot-ELISA

圖5 dot-ELISA檢測褐飛虱體內(nèi)RRSV結(jié)果Fig.5 Detection of RRSV in field brown planthopper samples by dot-ELISA

以上結(jié)果說明本實(shí)驗(yàn)室建立的病毒檢測體系已非常完善，且dot-ELISA檢測體系已達(dá)到了較高的靈敏度和準(zhǔn)確度，可以彌補(bǔ)RT-PCR的不足，用于田間樣品的高通量檢測。

2.2 2011年RBSDV、SRBSDV、RRSV三種水稻病毒病的發(fā)生情況

2011年對江蘇、浙江、廣西、云南、貴州、四川、重慶、湖南等?。ㄊ校┧静『M(jìn)行調(diào)查。采用dot-ELISA、RT-PCR及核酸測序的方法，檢測了矮縮癥狀的水稻樣本238份，檢測結(jié)果顯示水稻黑條矮縮病毒檢出率10.92%，南方水稻黑條矮縮病毒檢出率30.67%，水稻齒葉矮縮病毒檢出率4.62%。其中江蘇省僅檢出水稻黑條矮縮病毒，帶毒率83.33%。浙江省水稻黑條矮縮病毒檢出率64.71%。云南、廣西南方水稻黑條矮縮病毒檢出率分別為31.94%和 62.50%，水稻齒葉矮縮病毒檢出率分別為13.89%和3.13%。貴州、重慶僅檢出南方水稻黑條矮縮病毒，帶毒率分別為43.28%和7.69%。四川、湖南兩省未檢測到以上3種病毒（表1）。說明由水稻黑條矮縮病毒引起的水稻黑條矮縮病江蘇、浙江等省的局部地區(qū)發(fā)生嚴(yán)重。由南方水稻黑條矮縮病毒引起的南方水稻黑條矮縮病在我國廣西、云南、貴州、重慶等?。ㄊ?、區(qū)）的局部地區(qū)均有發(fā)生，尤其在廣西的興安縣，云南的施甸縣，貴州的貴定縣、荔波縣等地暴發(fā)成災(zāi)。由水稻齒葉矮縮病毒引起的水稻齒葉矮縮病在我國廣西、云南等地均有發(fā)生，且往往與SRBSDV復(fù)合感染水稻。

表1 2011－2012年田間水稻三種病毒的檢測結(jié)果Table 1 Detection results of three viruses in field rice samples collected in 2011－2012

在稻飛虱的帶毒調(diào)查中檢測了2011年7－9月廣西、云南、貴州、四川、重慶等五省（市、區(qū)）南方水稻黑條矮縮病毒暴發(fā)流行熱點(diǎn)區(qū)白背飛虱。采用dot-ELISA的方法共檢測白背飛虱620頭，結(jié)果顯示攜帶南方水稻黑條矮縮病毒檢出率3.50%。其中云南省檢測稻飛虱總數(shù)量240頭，帶毒數(shù)11頭，帶毒率4.60%；廣西壯族自治區(qū)檢測的稻飛虱總數(shù)量40頭，其中帶毒數(shù)2頭，帶毒率5.00%；貴州省檢測的稻飛虱總數(shù)量155頭，其中帶毒數(shù)6頭，帶毒率3.90%；四川省檢測的稻飛虱總數(shù)量60頭，其中帶毒數(shù)0頭，帶毒率0.00%；重慶市檢測的稻飛虱總數(shù)量15頭，其中帶毒數(shù)0頭，帶毒率0.00%（表2）。

表2 2011年7－9月田間白背飛虱體內(nèi)SRBSDV檢測結(jié)果Table 2 Detection result of SRBSDV in field white-backed planthoppers collected from July to September in 2011

2.3 2012年RBSDV、SRBSDV、RRSV三種水稻病毒病的發(fā)生情況

2012年對江蘇、浙江、江西、廣西、海南、云南等省的水稻病害進(jìn)行了調(diào)查。采用dot-ELISA、RTPCR及核酸測序的方法檢測了以矮縮癥狀為主的水稻樣本494份，結(jié)果表明：水稻黑條矮縮病毒檢出率0.40%，南方水稻黑條矮縮病毒檢出率48.38%，水稻齒葉矮縮病毒檢出率26.32%。其中江蘇省主要為水稻黑條矮縮病毒，檢出率40.00%。浙江省僅檢測出南方水稻黑條矮縮病毒，檢出率72.22%。江西省均未檢測到以上3種病毒。廣西、海南兩?。▍^(qū)）檢測到南方水稻黑條矮縮病毒和水稻齒葉矮縮病毒及這兩種病毒復(fù)合侵染，其中南方水稻黑條矮縮病毒檢出率分別為89.66%、48.48%，水稻齒葉矮縮病毒檢出率分別為13.79%、34.85%。云南檢測到南方水稻黑條矮縮病毒和水稻齒葉矮縮病毒及其復(fù)合侵染情況，其檢出率分別為南方水稻黑條矮縮病毒36.70%，水稻齒葉矮縮病毒10.09%（表1）。表明由水稻黑條矮縮病毒引起的水稻黑條矮縮病主要在華東地區(qū)江蘇等省的局部地區(qū)發(fā)生。由南方水稻黑條矮縮病毒引起的南方水稻黑條矮縮病在我國的浙江、廣西、海南、云南等?。▍^(qū)）的局部地區(qū)均有發(fā)生，尤其在海南省的三亞、澄邁、文昌等地更是暴發(fā)成災(zāi)。由水稻葉矮縮病毒引起的水稻齒葉矮縮病在我國廣西、海南、云南等地均有發(fā)生。

2012年在稻飛虱的帶毒調(diào)查中檢測了江蘇、浙江、廣西、海南、云南和湖南等六省（區(qū)）的稻飛虱樣品。共檢測白背飛虱5 496頭，攜帶南方水稻黑條矮縮病毒檢出率0.74%。褐飛虱709頭，攜帶水稻齒葉矮縮病毒檢出率0.14%。其中檢測江蘇省白背飛虱58頭，未檢測出帶毒飛虱。檢測浙江省白背飛虱534頭，帶毒數(shù)7頭，帶毒率1.31%。檢測廣西壯族自治區(qū)白背飛虱2 409頭，帶毒數(shù)48頭，帶毒率1.99%。檢測海南省白背飛虱207頭，帶毒數(shù)2頭，帶毒率0.97%。檢測云南省白背飛虱2 188頭，帶毒數(shù)8頭，帶毒率0.37%。檢測湖南省白背飛虱100頭，未檢測出帶毒飛虱（表3）。在2012年5月16日至7月28日對廣西桂林水稻種植區(qū)白背飛虱連續(xù)監(jiān)測發(fā)現(xiàn)5月16日至30日很少檢出帶毒白背飛虱，從5月31日開始連續(xù)檢出一定的帶毒率。其中重病田的白背飛虱帶著檢出率高達(dá)27.55%（圖6）。由于之前在海南的水稻中檢測到了較高的水稻齒葉矮縮病毒帶毒率，猜想其傳毒介體褐飛虱極有可能也具有一定的帶毒率，經(jīng)過采樣檢測，從709頭褐飛虱中檢測到1頭帶毒陽性，帶毒率0.14%（表3）。

表3 2012年田間稻飛虱體內(nèi)兩種水稻病毒檢測結(jié)果Table 3 Detection results of two rice viruses in field rice planthopper samples collected in 2012

圖6 對廣西桂林2012年5月16日－7月28日采集的白背飛虱SRRSDV帶毒率的監(jiān)測Fig.6 Infection rates of SRRSDV in white-backed planthopper samples collected in Guilin of Guangxi from 16 May to 28 July in 2012

2.4 2011－2012年三種水稻病毒病發(fā)生情況比較

通過對2011－2012年我國廣大稻區(qū)的樣品檢測，結(jié)果表明2011年水稻帶毒率為：水稻黑條矮縮病毒10.92%，南方水稻黑條矮縮病毒30.67%，水稻齒葉矮縮病毒6.30%。2012年水稻帶毒率為：水稻黑條矮縮病毒0.40%，南方水稻黑條矮縮病毒48.38%，水稻齒葉矮縮病毒26.32%。初步推測，2012年的南方水稻黑條矮縮病害、水稻齒葉矮縮病害均重于2011年，水稻黑條矮縮病害輕于2011年（圖7）。

圖7 2011－2012年三種病毒病在水稻樣品中的感染率Fig.7 Infection rates of three viruses in field rice samples collected in 2011 and 2012

3 討論

從田間調(diào)查和疑似感病水稻及其傳毒介體稻飛虱的檢測結(jié)果來看，RBSDV、SRBSDV、RRSV三種病毒仍然是最近幾年我國水稻生產(chǎn)上的主要威脅。水稻黑條矮縮病害的田間癥狀與南方水稻黑條矮縮病害非常類似，其差別主要表現(xiàn)在南方水稻黑條矮縮病株會產(chǎn)生高位分蘗且莖節(jié)部有倒生根。同時它們的主要傳毒介體灰飛虱（RBSDV的傳毒介體）和白背飛虱（SRBSDV的傳毒介體）分布區(qū)域的不同導(dǎo)致了兩種病害發(fā)生范圍很不一樣。我國江蘇、浙江等省主要發(fā)生水稻黑條矮縮病害。浙江的局部地區(qū)、廣西、海南，西南地區(qū)的云南、貴州和重慶等?。ㄊ?、區(qū)）則是南方水稻黑條矮縮病害的重點(diǎn)暴發(fā)流行區(qū)。水稻齒葉矮縮病毒常與南方水稻黑條矮縮病毒復(fù)合侵染水稻，其主要傳毒介體為褐飛虱，在我國分布廣泛。RT-PCR和dot-ELISA是檢測水稻病毒最常用的兩種方法，本文證實(shí)了本實(shí)驗(yàn)室建立的dot-ELISA檢測體系具有很高的準(zhǔn)確性和靈敏度，可以與RT-PCR、核酸測序共同用于病毒樣品的檢測。同時又由于它操作簡便且不需要復(fù)雜的儀器，克服了RT-PCR不易推廣的不足之處，更適用于基層樣品的高通量檢測，為田間病毒病害的鑒定及預(yù)測預(yù)報(bào)打下了基礎(chǔ)。通過對2011－2012年的田間樣品進(jìn)行病毒檢測，結(jié)果顯示2012年的南方水稻黑條矮縮病害、水稻齒葉矮縮病害均重于2011年，而水稻黑條矮縮病害輕于2011年。病害發(fā)生的嚴(yán)重程度一般主要與當(dāng)年的氣候條件及傳毒介體數(shù)量和帶毒率等因素有關(guān)。本文檢測結(jié)果中2012年白背飛虱的帶毒率（0.74%）低于2011年3.5%，原因可能是受樣品采集時間的影響，2012年采蟲時間較早，稻飛虱樣品主要來源于5－6月，而2011年的稻飛虱樣品主要來源于7－8月。從病害流行學(xué)的角度分析，一般7－8月是病害暴發(fā)的高峰期，這段時期的稻飛虱帶毒率往往是最高的。此外在對2012年5月16日－7月28日廣西桂林水稻種植區(qū)白背飛虱的連續(xù)監(jiān)測中也證實(shí)了6月以后的帶毒率要明顯高于6月之前。

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中圖分類號：S 435.111.49

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

DOI：10.3969／j.issn.0529-1542.2014.03.028

收稿日期：2013-07-18

修訂日期：2013-08-07

基金項(xiàng)目：國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（國家“973計(jì)劃”）（2010CB126203）；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)（201003031）；農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)（nycytx-001）

*通信作者E-mail：wujx＠zju.edu.cn，zzhou＠zju.edu.cn

Investigation of distributions and occurrences of three rice dwarf diseases in China in 2011－2012

Rao Lixia， Wang Zhencheng， Wu Jianxiang， Zhou Xueping
（State Key Laboratory of Rice Biology，Institute of Biotechnology，College of Agriculture and Biotechnology，Zhejiang University，Hangzhou 310058，China）

AbstractAll Rice black-streaked dwarf virus（RBSDV），Southern rice black-streaked dwarf virus（SRBSDV）and Rice ragged stunt virus（RRSV）can cause rice dwarf disease.The occurrence and distribution of three rice dwarf diseases in Jiangsu，Zhejiang，Jiangxi，Guangxi，Hainan，Yunnan，Guizhou，Sichuan，Chongqing and Hunan provinces during 2011－2012 were investigated with dot-ELISA and RT-PCR detection methods.The results showed that infection rates of the three viruses（RBSDV，SRBSDV and RRSV）were 10.92%，30.67%and 4.62%for rice samples collected in 2011，and 0.40%，48.38%and 26.32%for rice samples collected in 2012，respectively，indicating that the occurrences of SRBSDV and RRSV in 2012 were severer than those in 2011，while the RBSDV disease in 2012 was lighter than that in 2011.RBSDV occurred mainly in Jiangsu and Zhejiang provinces，SRBSDV occurred mainly in Guangxi，Hainan，Yunnan，Guizhou，Chongqing and Zhejiang，while RRSV occurred mainly in Guangxi，Hainan，Yunnan，Guizhou and Chongqing，and often co-infected with SRBSDV.

Key wordsRice black-streaked dwarf virus； Southern rice black-streaked dwarf virus； Rice ragged stunt virus；dot-ELISA； RT-PCR