寧波櫻花根癌病病原細(xì)菌鑒定

王志龍， 金楊唐， 譚志文， 王國良， 林 立

（1.寧波城市職業(yè)技術(shù)學(xué)院，寧波 315502；2.浙江萬里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院，寧波 315100）

寧波櫻花根癌病病原細(xì)菌鑒定

王志龍1， 金楊唐2， 譚志文2， 王國良2， 林 立1

（1.寧波城市職業(yè)技術(shù)學(xué)院，寧波 315502；2.浙江萬里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院，寧波 315100）

摘要從浙江寧波14個(gè)櫻花（Cerasus Mill.）病株樣本上分離到多株土壤農(nóng)桿菌菌株，其中10個(gè)菌株可致指示寄主番茄形成腫瘤，對(duì)菌株Czx-3的16S r DNA序列比對(duì)，確定櫻花根癌病是由根癌土壤桿菌（Agrobacterium tumefaciens）侵染所致。進(jìn)一步開展的標(biāo)準(zhǔn)生化和生理反應(yīng)測(cè)試、碳源利用和選擇性培養(yǎng)基等試驗(yàn)，鑒定出7個(gè)根癌病菌株為土壤農(nóng)桿菌（A.tumefaciens）生物型2型，占70%，為優(yōu)勢(shì)種群，其余3個(gè)菌株為生物型1型。對(duì)櫻花根癌病菌分類地位的確定，櫻花種苗的檢疫和病害控制奠定了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞櫻花； 根癌?。?病原細(xì)菌； 16S rDNA序列分析； 鑒定

櫻花（Cerasus Mill.）是我國重要的觀賞花木，被廣泛用于美化公園、小區(qū)、道路等綠地，多年來櫻花苗木需求量大，產(chǎn)業(yè)市場(chǎng)前景廣闊。浙江省寧波的四明山區(qū)域具有優(yōu)越的氣候和立地條件，十分適合櫻花生長(zhǎng)。目前浙江省四明山區(qū)域內(nèi)的余姚市、奉化市和鄞州區(qū)等地櫻花苗木種植面積超過3 000 hm2，占全國總面積的70%以上，每年產(chǎn)值近3億元，占全國60%～70%的市場(chǎng)份額，是名副其實(shí)的“櫻花之鄉(xiāng)”。生產(chǎn)銷售櫻花苗木已成為四明山區(qū)域農(nóng)民最主要的經(jīng)濟(jì)來源，許多花農(nóng)因此發(fā)家致富，走上小康之路。

根癌土壤桿菌［Agrobacterium tumefaciens（Smith et Townsend）Conn］為土壤習(xí)居菌，寄主范圍極廣，可侵染93科331屬643種的植物，包括多種果樹、林木、花卉，甚至瓜類，在生產(chǎn)上造成非常大的損失，1996年就被列入國內(nèi)森林植物檢疫對(duì)象名單［1］。櫻花根癌病由根癌土壤桿菌引起，最明顯的癥狀是在根莖處產(chǎn)生球狀或半球狀瘤狀物，瘤狀物慢慢地隨著苗木的長(zhǎng)大而長(zhǎng)大，嚴(yán)重影響了櫻花苗木生長(zhǎng)速度和樹勢(shì)，降低了觀賞品質(zhì)和商品價(jià)值。病害發(fā)生輕時(shí)引起提前落葉，嚴(yán)重時(shí)可引起整樹枯死，被花農(nóng)稱為櫻花的“癌癥”，防治櫻花根癌病的最有效方法是檢疫和培育無菌苗木，但是，多年來檢疫和培育無菌苗木工作沒有跟上，櫻花根癌病在各地大面積發(fā)生，隨著栽培時(shí)間的增長(zhǎng)，病害發(fā)生程度逐年加重。據(jù)我們對(duì)本地櫻花主要苗木生產(chǎn)基地初步調(diào)查，發(fā)現(xiàn)寧波市櫻花主栽區(qū)平均發(fā)病率達(dá)30%，銷售的干徑5 cm左右櫻花苗木發(fā)病率達(dá)15%～50%，重發(fā)區(qū)塊植株患病率甚至達(dá)到92%。倪大煒［2］確定引起浙江省慈溪等地的日本櫻花苗圃內(nèi)日本櫻花根癌病的病原細(xì)菌全部為根癌土壤桿菌生物型1型，劉保友［3］的研究表明，煙臺(tái)地區(qū)大櫻桃根癌病樣本，生物型2型占69.57%，為優(yōu)勢(shì)種群，其余菌株為生物型1型。

本研究旨在明確櫻花根癌病病原細(xì)菌的分類地位，為櫻花根癌病的深入研究和防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 病組織采集

2012年10月分別從四明山區(qū)多個(gè)櫻花苗木場(chǎng)和寧波市區(qū)內(nèi)櫻花種植數(shù)量比較多的公園、學(xué)校、小區(qū)等場(chǎng)所，選擇櫻花樹根莖處具有明顯根瘤癥狀部位，用刀切取新鮮根瘤的病組織。取樣櫻花樹的樹齡10～20年。

1.2 病原菌的分離

切取新鮮根瘤病組織表層后切成大小約5 mm× 5 mm的小塊，15%漂白粉溶液消毒3 min，0.1%升汞溶液消毒50 s，無菌水清洗3次。將經(jīng)上述處理的小塊放入無菌研缽內(nèi)，加入適量滅菌水研碎，直至完全研磨后靜置5 min。用接種環(huán)蘸取上清液，在LB培養(yǎng)基上畫線分離，28℃培養(yǎng)。陽性菌株A.tumefaciens cfcc-1369（分離于櫻桃根癌）由中國林業(yè)微生物菌種保藏管理中心提供，也進(jìn)行同樣畫線、培養(yǎng)。以cfcc-1369菌株培養(yǎng)48 h后的菌落特性為依據(jù)，進(jìn)行革蘭氏染色，同時(shí)制臨時(shí)玻片在顯微鏡下觀察菌體形態(tài)特征和活動(dòng)特點(diǎn)。對(duì)具有典型根癌菌菌落和菌體形態(tài)特征及活動(dòng)特點(diǎn)的單個(gè)菌落，再次在LB培養(yǎng)基上畫線培養(yǎng)。48 h后對(duì)各分離菌株制片，在JEM-1011型電子顯微鏡下觀察細(xì)菌的形態(tài)特征，分離得到純化的菌株，備用。

1.3 致病性測(cè)定

從種子公司購買番茄種子，品種為‘紅圣女’，催芽后種植在直徑10 cm，內(nèi)裝2／3泥炭培養(yǎng)基的塑料培養(yǎng)缽內(nèi)，每缽種3株，在28℃、12 h光照、85%相對(duì)濕度的人工培育室內(nèi)培養(yǎng)，根據(jù)泥炭培養(yǎng)基水分情況及時(shí)澆水。培養(yǎng)45 d后選擇生長(zhǎng)一致的番茄苗，在2～3葉之間的主莖表面用75%乙醇棉表面消毒，用無菌解剖針輕輕刺番茄主徑9～10針，造成微小創(chuàng)傷。將分離純化到的14株菌株和cfcc-1 369菌株在LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d，用滅菌水調(diào)節(jié)細(xì)菌懸浮液濃度至（1～1.5）×108cfu／m L，用藥棉蘸細(xì)菌懸浮液包裹于創(chuàng)傷處48 h，同時(shí)設(shè)藥棉蘸滅菌水包裹于創(chuàng)傷處作空白對(duì)照，兩星期后調(diào)查創(chuàng)傷處腫大和瘤腫情況。

1.4 供試菌株16S r DNA序列分析

根據(jù)致病性試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行了樣品2號(hào)Czx-3菌株的16S r DNA序列分析。

1.4.1 主要試劑和儀器

DNA提取試劑盒為TIANGEN TIANamp Bacteria DNA Kit細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（DP302）；PCR試劑盒為大連寶生物Ta KaRa Taq TM（DR001A）；PCR擴(kuò)增儀器為Mastercycler pro銀制梯度PCR儀。

1.4.2 細(xì)菌基因組的提取

參照TIANGEN TIANamp Bacteria DNA Kit細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（DP302）說明書進(jìn)行提取。

1.4.3 PCR擴(kuò)增與測(cè)序

通用引物由上海生物工程有限公司合成：F8：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG（5′-3′），R1492：ACGGCTACCTTGTTACGACTT（5′-3′），目的片段約為1 500 bp。

擴(kuò)增體系（25μL體系）：10×PCR buffer 2.5μL，dd H2O 18μL，Taq 0.5μL，模板1μL，F(xiàn)8（10μmol／L）1μL，R1492（10μmol／L）1μL，d NTP 1μL。擴(kuò)增條件：94℃，10 min；94℃，1 min；58℃，1 min；72℃，1 min；共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。電泳條件：1%的瓊脂糖凝膠，電泳緩沖液1×TBE，凝膠成像系統(tǒng)觀察成像，并保存。PCR產(chǎn)物送上海生工進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化并測(cè)序。

1.4.4 目標(biāo)細(xì)菌的16S r DNA序列分析

將16S r DNA PCR產(chǎn)物序列提交NCBI（http：∥blast.ncbi.nlm.nih.gov／Blast.cgi）中進(jìn)行比對(duì)。

1.5 生理生化試驗(yàn)

將經(jīng)過致病性試驗(yàn)后的有致病能力的10個(gè)菌株和cfcc-1369菌株進(jìn)行生理生化試驗(yàn)。

1.5.1 常規(guī)培養(yǎng)基生長(zhǎng)試驗(yàn)

參照劉保友［3］的方法對(duì)病菌的生長(zhǎng)溫度、耐鹽性、3-酮基乳糖和碳源利用等開展試驗(yàn)。將各菌株接種在相應(yīng)的培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)48 h檢查細(xì)菌生長(zhǎng)情況。

1.5.2 選擇性培養(yǎng)基試驗(yàn)

Schroth培養(yǎng)基：培養(yǎng)基組分參照Schroth［4］。Kerr＆Brisbane培養(yǎng)基：培養(yǎng)基組分參照New［5］。Roy＆Sasser培養(yǎng)基：培養(yǎng)基組分參照Roy［6］。將各菌株畫線接種在Schroth培養(yǎng)基、Kerr＆Brisbane培養(yǎng)基、Roy＆Sasser培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)48 h檢查細(xì)菌生長(zhǎng)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 病菌分離

分離純化到的14株菌株和cfcc-1369菌株在LB培養(yǎng)基的特征為稍微隆起，有光澤，邊緣完整，半透明、乳白色、黏稠圓形菌落。顯微鏡下觀察細(xì)菌的形態(tài)特性，菌體細(xì)胞桿狀，常見2～3個(gè)菌體連成長(zhǎng)桿狀，單菌體和長(zhǎng)桿狀菌體都能游動(dòng)。革蘭氏染色反應(yīng)陰性。在LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d時(shí)混濁生長(zhǎng)。電子顯微鏡下觀察菌體形態(tài)，可見菌體清晰明亮，短桿狀，大小為（1.6～2.3）μm×（0.6～0.9）μm，周生鞭毛數(shù)根（見圖1）。

圖1 櫻花根癌病菌Fig.1 The pathogen of Cerasus crown gall

2.2 致病性測(cè)定

14株菌株經(jīng)過致病性檢測(cè)試驗(yàn)，在指示植物番茄上表現(xiàn)出致病性的有10株菌，另外4株沒有致病性。具致病性菌株中8株引起腫大（圖2中），2株引起多個(gè)小瘤狀突起（圖2左），空白對(duì)照沒有明顯變化（圖2右）。cfcc-1369菌株引起腫大。

2.3 供試菌株16S r DNA序列分析結(jié)果

2.3.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

應(yīng)用通用引物F8／R1492進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約1 500 bp的目的產(chǎn)物，如圖3所示。

圖2 櫻花根癌菌在番茄主莖上的致病性測(cè)定Fig.2 Determination of the pathogenicity of A.tumefaciens in tomato stems

2.3.2 序列結(jié)果比對(duì)分析

PCR產(chǎn)物純化之后，對(duì)其進(jìn)行雙向序列測(cè)定。利用NCBI網(wǎng)站中的BLAST程序?qū)a(chǎn)物序列與數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對(duì)分析，設(shè)定參數(shù)為網(wǎng)站默認(rèn)模式，結(jié)果為樣品2號(hào)Czx-3菌株和cfcc-1369菌株的PCR產(chǎn)物的16S r DNA全長(zhǎng)1 350 bp序列與A.tumefaciens strain TA-AT-6（登錄號(hào)：KF673154）的16S r RNA基因的相似性達(dá)到100%，可認(rèn)為它們屬于同一種。

2.4 生理生化和菌株生物型試驗(yàn)

生理生化和菌株生物型試驗(yàn)結(jié)果見表1。

結(jié)果表明，A.tumefaciens的3個(gè)生物型均不能在37℃環(huán)境中生長(zhǎng)；生物型1和3均可在含有2% NaCl的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)；生物型1在3-酮基乳糖試驗(yàn)中可以生長(zhǎng)；生物型1可利用蔗糖和乙醇，生物型3只可利用蔗糖，而生物型2不可利用蔗糖和乙醇；3種選擇性培養(yǎng)基中，生物型1只能在Schroth培養(yǎng)基生長(zhǎng)，生物型2只能在Kerry＆Brisbane培養(yǎng)基生長(zhǎng)，而生物型3只能在Roy＆Sasser培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。根據(jù)以上生物型區(qū)分標(biāo)準(zhǔn)的試驗(yàn)表明：本研究中的10株具致病能力的櫻花根瘤病菌中，有7株是生物型2型，3株是生物型1型。cfcc-1369是生物型2型。

圖3 細(xì)菌16S r RNA基因擴(kuò)增圖Fig.3 Amplification of bacterial 16S r RNA

表1 菌株生物型鑒定結(jié)果1）Table 1 Diagnostic characters for determination of A.tumefaciens biotypes

3 結(jié)論

根癌病是一種危害性極大的世界性細(xì)菌病害。本研究從寧波各縣市區(qū)采集櫻花根癌病樣本，通過培養(yǎng)形態(tài)觀察和致病性測(cè)定試驗(yàn)，對(duì)樣品Czx-3菌株的16S r DNA序列比對(duì)，確定櫻花根癌病是由根癌土壤桿菌（A.tumefaciens）侵染所致。篩選出14個(gè)典型的根癌菌株，再經(jīng)生理生化反應(yīng)、選擇性培養(yǎng)基篩選等試驗(yàn)測(cè)定，對(duì)比《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》土壤桿菌菌種的鑒定［7］，明確了引起本地櫻花根癌病的病菌A.tumefaciens生物型2為優(yōu)勢(shì)種群，生物型1也占30%。

本地櫻花根癌病菌分類地位的確定可為今后病原菌的深入研究，開展種苗檢疫和有針對(duì)性地防治提供一定的理論基礎(chǔ)。無論是從遵守國家植物檢疫法或是從為本地櫻花苗木產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展角度考慮，研究、開發(fā)出一套適合當(dāng)?shù)禺a(chǎn)業(yè)發(fā)展需要的快速檢測(cè)、培育、銷售無櫻花根癌病種苗的綜合配套技術(shù)具有理論意義和實(shí)踐意義，也是櫻花苗木產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的必經(jīng)之路。

參考文獻(xiàn)

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聯(lián)系方式 E-mail：wangzhl01＠163.com

中圖分類號(hào)：S 436.85

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI：10.3969／j.issn.0529-1542.2014.03.027

收稿日期：2014-01-28

修訂日期：2014-03-14

基金項(xiàng)目：國家星火計(jì)劃重大項(xiàng)目（2012GA701002）；國家星火計(jì)劃一般項(xiàng)目（2012GA701014）；寧波市農(nóng)業(yè)社會(huì)發(fā)展重點(diǎn)項(xiàng)目（2012C10010）；寧波市科技局“雙創(chuàng)”項(xiàng)目（2011C91011）

Identification of the pathogen from Cerasus crown gall in Ningbo

Wang Zhilong1， Jin Yangtang2， Tan Zhiwen2， Wang Guoliang2， Lin Li1
（1.Ningbo City College of Vocational Technology，Ningbo 315502，China；2.College of Biological &Environmental Sciences，Zhejiang Wanli University，Ningbo 315100，China）

AbstractStrains were obtained from 14 samples of crown gall on Cerasus Mill.in Ningbo，Zhejiang Province，China，10 of which could form crown gall tomato.The pathogen was identified as Agrobacterium tumefaciens based on phenotypic features of the cells and colonies，biochemical characteristics and sequence analysis of 16S r DNA.These strains were further identified based on reactions to standard biochemical and physiological tests by carbon utilization and selective media for identification.Among the 10 strains，7 were biotype 2，accounting for 70% of the total.The other 3 strains were biotype 1.The finding that A.tumefaciens could cause crown gall disease of Cerasus laid the foundation for systematic study on quarantine and disease control.

Key wordsCerasus Mill.； crown gall； pathogenic bacterium； 16S r DNA sequence analysis； identification