黃瓜綠斑駁花葉病毒磁免疫層析試紙條的研制

魏梅生， 李桂芬， 馬 潔， 朱水芳， 王軍平， 文朝慧

（1.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院植物檢疫研究所，北京 100029；2.甘肅出入境檢驗(yàn)檢疫局，蘭州 730020）

黃瓜綠斑駁花葉病毒磁免疫層析試紙條的研制

魏梅生1， 李桂芬1， 馬 潔1， 朱水芳1， 王軍平2， 文朝慧2

（1.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院植物檢疫研究所，北京 100029；2.甘肅出入境檢驗(yàn)檢疫局，蘭州 730020）

摘要用磁性納米顆粒標(biāo)記黃瓜綠斑駁花葉病毒的兔多克隆抗體建立了簡(jiǎn)便快速的磁免疫層析試紙條檢測(cè)方法。該方法檢測(cè)提純病毒的靈敏度為0.1μg／m L，檢測(cè)葫蘆病汁液可稀釋10 000倍（重量／體積）。試紙條和黃瓜綠斑駁花葉病毒具有特異性反應(yīng)，和同屬的煙草花葉病毒、番茄花葉病毒、辣椒輕斑駁病毒和齒蘭環(huán)斑病毒，未出現(xiàn)交叉反應(yīng)。該試紙條可用于田間病害檢測(cè)和診斷。

關(guān)鍵詞黃瓜綠斑駁花葉病毒； 磁免疫層析； 試紙條

黃瓜綠斑駁花葉病毒（Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV）為煙草花葉病毒屬（Tobamovirus）成員，是全國(guó)農(nóng)業(yè)植物檢疫性有害生物和我國(guó)進(jìn)境檢疫性有害生物。CGMMV主要危害葫蘆科作物，引起植物葉片斑駁、系統(tǒng)性花葉等癥狀，造成產(chǎn)量和品質(zhì)下降，對(duì)生產(chǎn)危害很大［1］。

該病毒分布于英國(guó)、以色列、西班牙、希臘、沙特阿拉伯、印度、巴基斯坦、韓國(guó)和日本等國(guó)家和地區(qū)［2］。根據(jù)我國(guó)農(nóng)業(yè)部公布的《2012年全國(guó)農(nóng)業(yè)植物檢疫性有害生物分布行政區(qū)名錄》，國(guó)內(nèi)遼寧、上海、江蘇、浙江、安徽、湖北、湖南、廣東、廣西［3］、海南等10個(gè)?。▍^(qū)、市）59個(gè)縣（市、區(qū)）有CGMMV的分布。

早期診斷和發(fā)現(xiàn)田間CGMMV，采取有效的檢疫處理措施，可避免病害的進(jìn)一步擴(kuò)散蔓延［4-5］。目前，用于CGMMV快速檢測(cè)方法主要是膠體金免疫層析法（gold immunochromatography assay，GICA），可在15 min內(nèi)得到檢測(cè)的結(jié)果。膠體金免疫層析采用膠體金來(lái)標(biāo)記特異性的檢測(cè)抗體，利用膠體金的呈色性用肉眼判別檢測(cè)的結(jié)果，但膠體金結(jié)果的判斷有時(shí)會(huì)受到植物葉綠素的干擾。磁納米顆粒（magnetic nanoparticles）是一種新型納米材料，其核心是由具有超順磁性的（superparamagnetic）Fe3O4或鐵磁性的（ferromagnetic）γ-Fe2O3組成。超順磁性納米材料具有在外加磁場(chǎng)的作用下能迅速聚集，在無(wú)磁場(chǎng)的情況下能夠均勻分散的特點(diǎn)，表面功能化的磁性納米材料可用于蛋白質(zhì)、DNA和RNA等生物大分子的純化以及細(xì)胞、病原微生物的分離和檢測(cè)［6］，如用于檢測(cè)人類免疫缺陷病毒的抗體，定量檢測(cè)人乙型肝炎表面抗原以及農(nóng)藥的測(cè)定［7-9］。這種磁性納米材料呈棕色具有磁信號(hào)可供檢測(cè)。

本文以CGMMV為材料，利用磁性納米材料的磁性去分離病毒，并根據(jù)其顏色判斷磁免疫層析（magnetic immunochromatography assay）試紙條的測(cè)試結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 病毒毒原

黃瓜綠斑駁花葉病毒為遼寧蓋州分離物。病毒摩擦接種繁殖于葫蘆（Lagenaria siceraria）上。病毒的提純見參考文獻(xiàn)［10］。

1.2 主要試劑和設(shè)備

黃瓜綠斑駁花葉病毒兔多克隆抗體為本所自制，經(jīng)1 m L HiTrap Protein G（GE公司）柱純化。羊抗兔抗體購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所。磁性納米材料為Chemicell公司的fluid MAGUC／A（100 nm）。層析膜為Millipore公司的產(chǎn)品HiFlow Plus HFB 13502（貨號(hào)HF13502S25）。磁力分離架為Bioreba公司產(chǎn)品。

1.3 磁納米顆粒-抗體結(jié)合物的制備

取25μg純化的CGMMV兔多克隆抗體加入到400μL的蒸餾水中，在其中加入100 nm的fluid MAG-UC／A納米顆粒1 mg，室溫條件下振蕩孵育1 h后，即為標(biāo)記好的抗體-磁性納米顆粒。置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 試紙條的制作

1.4.1 抗體固相硝酸纖維素（層析）膜的制備

CGMMV兔多克隆抗體和羊抗兔抗體用固相溶液（0.02 mol／L p H8.0磷酸鹽緩沖液）分別稀釋成2 mg／m L和8 mg／m L的濃度。在BioDot XYZ 3050三維噴點(diǎn)平臺(tái)上，用BioJet Quanti 3000非接觸式微定量噴頭，將上述兩種抗體均勻地噴在硝酸纖維素膜上，形成粗細(xì)適中的兩條平行線，分別為T檢測(cè)線和C質(zhì)控線。將固相抗體硝酸纖維素膜置封閉液（1%脫脂奶粉）中，37℃水浴鍋中孵育1 h，其后在0.02 mol／L p H7.0的磷酸鹽緩沖液中洗滌2次，室溫下風(fēng)干，置4～8℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 試紙條的組裝

在80 mm×300 mm雙面膠塑料板25 mm端內(nèi)側(cè)黏附25 mm×300 mm抗體固相硝酸纖維素膜。在雙面膠塑料板25 mm端黏附20 mm×300 mm玻璃纖維素紙條帶，并與抗體固相NC膜重疊2 mm，再黏附一層標(biāo)有MAX線的膠帶。在雙面膠塑料板30 mm端黏附25 mm×300 mm寬的吸水紙與抗體固相硝酸纖維素紙重疊2 mm，并黏附一層膠帶。用BioDot CM4000切條機(jī)切成4 mm寬的試紙條。

1.5 磁免疫層析試紙條檢測(cè)和結(jié)果判斷

1.5.1 樣品制備

病葉或健康葉片稱重后用0.01 mol／L p H7.2磷酸鹽緩沖液稀釋，經(jīng)研磨并低速離心后為制備好的樣品，提純的病毒也用上述緩沖液稀釋。

1.5.2 測(cè)試和結(jié)果判斷

在500μL的塑料離心管中加入100μL的病葉或健康葉汁液，400μL的蒸餾水和40μL的磁納米顆粒-抗體結(jié)合物，充分混勻，靜置5 min，充分振蕩后放在磁力分離架上靜置3 min，待磁性納米顆粒吸附在離心管壁上，吸出離心管中的溶液，再加入400μL的蒸餾水將磁性納米顆粒充分懸浮起來(lái)。

取出試紙條恢復(fù)至室溫，將標(biāo)有MAX線的一端插入到上述檢測(cè)樣品中，10 min左右判斷結(jié)果。若試紙條C線出現(xiàn)棕色線而T線未顯色，結(jié)果為陰性；若試紙條上C線和T線均出現(xiàn)棕色，結(jié)果為陽(yáng)性；若試紙條C線和T線都沒有顯色，則說(shuō)明此試紙條已經(jīng)失效，結(jié)果無(wú)效。

2 結(jié)果

2.1 磁分離的結(jié)果

所用的普通磁力分離架可有效地將棕色磁納米顆粒吸附在離心管壁上，并和樣品溶液中的葉綠素分開（見圖1）。

2.2 磁免疫層析試紙條特異性測(cè)試

用CGMMV磁免疫層析試紙條檢測(cè)黃瓜綠斑駁花葉病毒，C線和T線均出現(xiàn)棕色，結(jié)果呈陽(yáng)性反應(yīng)；交叉檢測(cè)同屬的煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV），番茄花葉病毒（Tomato mosaic virus，To MV），辣椒輕斑駁病毒（Pepper mild mottle virus，PMMo V），齒蘭環(huán)斑病毒（Odontoglossum ringspot virus，ORSV），僅C線出現(xiàn)棕色，T線未出現(xiàn)棕色，結(jié)果是陰性；試紙條對(duì)健康和緩沖液對(duì)照檢測(cè)的結(jié)果，僅C線出現(xiàn)棕色，T線未出現(xiàn)棕色，結(jié)果是陰性。結(jié)果說(shuō)明磁免疫層析試紙條檢測(cè)的特異性強(qiáng)。

圖1 外磁場(chǎng)作用后管壁聚集的磁納米顆粒Fig.1 Magnetic nanoparticles accumulated at the tube wall by an external magnetic field

2.3 磁免疫層析試紙條檢測(cè)靈敏度

磁免疫層析試紙條檢測(cè)提純的CGMMV靈敏度可達(dá)0.1μg／m L（見圖2）；檢測(cè)CGMMV葫蘆病葉汁液可稀釋10 000倍（W／V）（見圖3），健康對(duì)照T線未顯色避免了植物葉綠素的干擾。

圖2 磁免疫層析試紙條檢測(cè)提純的CGMMVFig.2 Detection of the purified CGMMV by magnetic immunochromatography assay

圖3 磁免疫層析試紙條檢測(cè)CGMMV病葉汁液Fig.3 Detection of CGMMV in the extract of the infected Lagenaria siceraria leaves by magnetic immunochromatography assay

2.4 和膠體金試紙條測(cè)試的比較

膠體金試紙條檢測(cè)提純的CGMMV靈敏度可達(dá)0.1μg／m L（見圖4）；檢測(cè)CGMMV葫蘆病葉汁液可稀釋10 000倍（W／V），但健康對(duì)照在T線上，受植物葉綠素的干擾有時(shí)會(huì)出現(xiàn)綠色的線（見圖5）。

圖4 膠體金免疫層析試紙條檢測(cè)提純的CGMMVFig.4 Detection of the purified CGMMV by GICA

圖5 膠體金免疫層析試紙條檢測(cè)CGMMV病葉汁液Fig.5 Detection of CGMMV in the extract of the infected L.siceraria leaves by GICA

3 討論

直徑小于100 nm磁性納米顆粒，由于需要用更強(qiáng)的磁場(chǎng)來(lái)分離，普通的磁力分離架難以使超順磁性納米材料迅速聚集起來(lái)，因此本文選用直徑100 nm帶有負(fù)電荷的磁性納米材料來(lái)標(biāo)記抗體，標(biāo)記是靠物理吸附作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的，這種磁性納米材料遠(yuǎn)大于標(biāo)記用膠體金的20～30 nm［11］大小的顆粒，分散系中的鹽等電解質(zhì)，極易造成磁性納米顆粒的聚集和沉淀，致使顆粒在層析膜上行走不暢，到達(dá)不了C、T線，從而影響檢測(cè)的結(jié)果，因此在抗體的標(biāo)記和樣品的檢測(cè)過(guò)程中要避免使用高濃度的鹽溶液。

本研究所制作的CGMMV磁免疫層析試紙條檢測(cè)提純病毒可達(dá)0.1μg／m L，檢測(cè)病葉汁液可稀釋10 000倍（W／V），檢測(cè)靈敏度和膠體金試紙條相當(dāng)，并且可有效避免植物葉綠素對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，具有檢測(cè)快速，靈敏度高，特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，可用于對(duì)該病毒的田間調(diào)查和疫情監(jiān)測(cè)。本研究主要通過(guò)肉眼來(lái)觀察檢測(cè)的結(jié)果，而磁信號(hào)的檢測(cè)可用于病毒的定量檢測(cè)，可進(jìn)一步提高檢測(cè)的靈敏度。

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中圖分類號(hào)：S 41

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI：10.3969／j.issn.0529-1542.2014.03.019

收稿日期：2013-07-17

修訂日期：2013-08-21

基金項(xiàng)目：公益性行業(yè)（質(zhì)檢）科研專項(xiàng)（201310071）

Magnetic immunochromatography assay for rapid detection of Cucumber green mottle mosaic virus

Wei Meisheng1， Li Guifen1， Ma Jie1， Zhu Shuifang1， Wang Junping2， Wen Zhaohui2
（1.Institute of Plant Quarantine，CAIQ，Beijing 100029，China；2.Gansu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Lanzhou 730020，China）

AbstractRapid magnetic immunochromatography assay was developed by coupling magnetic nanoparticles with polyclonal rabbit antibody against Cucumber green mottle mosaic virus（CGMMV）.Sensitivity of the method was 0.1μg／m L for detecting purified CGMMV.CGMMV could be detected in the extract of the infected Lagenaria siceraria leaves at a dilution of 10－4（W／V）.The immunostrip was specific to CGMMV，without cross reaction with other tobamoviruses such as Tobacco mosaic virus，Tomato mosaic virus，Pepper mild mottle virus and Odontoglossum ringspot virus.The immunostrip is an ideal screening tool for field inspection and disease diagnosis.

Key wordsCucumber green mottle mosaic virus； magnetic immunochromatography assay； immunostrip