稻蝗腸道真菌的除草活性篩選及菌株DH03的鑒定

藍 添， 陳婷婷， 邵明偉， 樊秋琴， 潘倩倩， 文 丹， 張應(yīng)烙

（浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，金華 321004）

稻蝗腸道真菌的除草活性篩選及菌株DH03的鑒定

藍 添， 陳婷婷， 邵明偉， 樊秋琴， 潘倩倩， 文 丹， 張應(yīng)烙*

（浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，金華 321004）

摘要利用涂布平板法從中華稻蝗腸道中分離得到6株真菌，活性篩選試驗表明菌株DH03具有較好的除草活性。當(dāng)供試質(zhì)量濃度為100μg／m L時，該菌株發(fā)酵液的乙酸乙酯提取物對稗草和反枝莧根生長的抑制率均大于80%，比陽性對照2，4-二氯苯氧乙酸的活性好；進一步研究表明發(fā)酵液活性物質(zhì)主要集中在中等極性部分；該菌株的發(fā)酵液對盆栽稗草幼苗生長表現(xiàn)出較強的抑制作用，當(dāng)噴施發(fā)酵液原液時，稗草的受害率和均株高分別為36.1%和9.78 cm。經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察和ITS序列分析確定該菌株為Cladosporium oxysporum。DH03作為微生物源除草劑值得進一步研究。

關(guān)鍵詞中華稻蝗； 昆蟲腸道真菌； 除草活性

稗草［Echinochloa crusgalli（Linn.）Beauv.］和反枝莧［Amaranthus retroflexus Linn.］為世界性分布的惡性雜草，嚴重危害農(nóng)業(yè)生產(chǎn)［1-2］。長期使用化學(xué)除草劑進行防除帶來了環(huán)境污染嚴重和雜草抗藥性增強等諸多問題［3-4］，而生物源除草劑以資源豐富、毒性小、殘留少、選擇性強、環(huán)境兼容性好、經(jīng)濟效益高等優(yōu)于化學(xué)除草劑的特點，逐步引起人們的重視［5］，其中微生物或微生物代謝產(chǎn)物作為除草劑具有許多潛在優(yōu)勢［6］，已成為一個研究重點。目前，微生物源除草劑的研究主要集中在土壤放線菌和植物病原菌兩個方面［7］，但對于昆蟲腸道菌研究的報道卻很少。研究表明昆蟲腸道菌能分泌一些消化酶幫助昆蟲消化［8-9］，還可能合成植物毒素，殺死植物以利于昆蟲消化［10］。因此，昆蟲腸道菌作為一種研究較少的特境微生物資源［11］，可能是新型天然除草劑的一個重要來源。在較系統(tǒng)研究棉蝗和負蝗腸道真菌除草活性的基礎(chǔ)上［10，12-13］，活性篩選表明一株稻蝗腸道真菌DH03具有較強的除草活性。本文報道該活性菌株并初步確定其分類地位，旨在為開發(fā)新型微生物源除草劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 樣品采集

供試昆蟲中華稻蝗［Ox ya chinensis（Thunb.）］采自浙江師范大學(xué)校園內(nèi)。

1.2 供試雜草種子

供試雜草種子為常見雜草稗草（Echinochloa crusgalli）和反枝莧（Amaranthus retroflexus）的種子。

1.3 培養(yǎng)基

MEA培養(yǎng)基：生麥芽20 g，加水煮沸30 min，經(jīng)紗布過濾，濾液加水補足至1 000 m L，加入15～20 g瓊脂，加熱溶化，再加蔗糖20 g和蛋白胨1 g，分裝，121℃高壓蒸汽滅菌20 min。

ME培養(yǎng)基：MEA培養(yǎng)基相應(yīng)的液體培養(yǎng)基，不加瓊脂。

2 方法

2.1 菌種的分離和純化

參照文獻的方法［12］，將捕捉到的中華稻蝗饑餓24 h后，在無菌條件下解剖，分離出的腸道用75%乙醇表面消毒2 min，無菌水漂洗3次，加少量無菌水在無菌研缽中研磨，用無菌水將研磨液梯度稀釋成10－1、10－2，分別取0.2 m L稀釋液涂布于MEA培養(yǎng)基平板上，28℃恒溫培養(yǎng)，待菌體長出后，挑取菌落邊緣菌絲純化，得到6株稻蝗腸道真菌。

2.2 菌種的發(fā)酵及產(chǎn)物的提取

挑取新鮮的菌絲體接種到ME培養(yǎng)基中，于搖床上180 r／min 30℃培養(yǎng)7 d。發(fā)酵液在室溫下過濾，所得濾液用乙酸乙酯萃取2～3次，至萃取液變?yōu)闊o色，經(jīng)減壓濃縮得到粗浸膏。

2.3 菌株DH03發(fā)酵液不同極性物質(zhì)的提取

菌株DH03的發(fā)酵濾液依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取2～3次，至萃取液變?yōu)闊o色，經(jīng)減壓濃縮后分別得石油醚提取物、乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物。

2.4 除草活性測試

除草活性測試采用培養(yǎng)皿生物分析法［10］，分別測定各提取物對稗草和反枝莧的除草活性。將雜草種子置于28℃下催芽1～2 d，待種子露白后備用。將待測物質(zhì)用丙酮溶解，配制成100μg／mL的藥液。在直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中放入一張圓濾紙片，加入待測藥液5.00 m L，待溶劑揮發(fā)干后，加入5.00 m L蒸餾水，選擇15粒成熟度一致的露白的種子放入培養(yǎng)皿中，蓋好皿蓋，置于28℃智能光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，處理1～3 d后測定根長。另外設(shè)丙酮和相同濃度的2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）分別作為空白對照和陽性對照。按如下公式計算抑制率：抑制率（%）＝［（空白對照組的根長－處理組的根長）／（空白對照組的根長）］×100。

2.5 DH03發(fā)酵液對盆栽稗草幼苗的生長抑制活性測定

將催芽后的稗草種子播種于直徑為10 cm的花盆中，每盆10株，置于28℃智能光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，出苗后第3天分別噴施發(fā)酵原液和用蒸餾水稀釋10、20倍的發(fā)酵液，13 d后觀察幼苗受害程度，測量株高。另設(shè)蒸餾水和100μg／m L的2，4-D溶液分別作為空白對照和陽性對照。幼苗受害級別觀察與受害率計算的方法參照文獻［14］，受害率（%）＝∑［（每盆各受害級別株數(shù)×級別）／（每盆株數(shù)×最高級別）］×100。

2.6 DH03菌種鑒定

將該菌接種于MEA平板上，培養(yǎng)7 d后觀察菌落的表面狀態(tài)、顏色等特征。挑取少量菌落制片，利用顯微鏡觀察菌絲形態(tài)和產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)等。同時用基因組DNA提取試劑盒提取菌株的基因組DNA，采用ITS-5.8S r DNA區(qū)域的通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）對ITS基因進行PCR擴增。產(chǎn)物經(jīng)檢測、純化后由上海生工生物工程有限公司測序。將獲得序列進行BLAST比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定菌株的分類地位。

2.7 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析（Duncan多重比較分析，P＝0.05）。

3 結(jié)果與分析

3.1 6株稻蝗腸道真菌提取物對稗草和反枝莧根生長的抑制作用

6株稻蝗腸道真菌提取物對稗草和反枝莧根生長的抑制作用結(jié)果見表1。供試質(zhì)量濃度均為100μg／m L時，6株真菌發(fā)酵液的乙酸乙酯提取物對常見雜草稗草和反枝莧根的生長均表現(xiàn)出一定的抑制作用。菌株DH03的除草活性最強，其對稗草根的抑制率為96.9%，與陽性對照2，4-D活性（97.2%）相當(dāng)；其對反枝莧根的抑制率為80.8%，高于陽性對照活性（74.2%）。菌株DH04的活性次之，其對稗草和反枝莧根生長的抑制率分別為49.7%和65.2%。

表1 6株真菌發(fā)酵液乙酸乙酯粗提物對稗草和反枝莧根生長的抑制作用1）Table 1 Inhibitory effects of EtOAc extracts from the fermentation broth of six fungi against the roots of E.crusgalli and A.retroflexus

3.2 DH03發(fā)酵液不同極性提取物對稗草和反枝莧根生長的抑制作用

DH03發(fā)酵產(chǎn)物不同極性提取物對稗草和反枝莧根生長的抑制作用結(jié)果見表2。DH03發(fā)酵液的3種提取物中，乙酸乙酯提取物對稗草和反枝莧根生長的抑制作用最強，抑制率分別為66.5%和47.0%；正丁醇提取物對稗草根的抑制作用強于石油醚提取物，而它們對反枝莧根生長的抑制活性相當(dāng)。上述結(jié)果表明DH03發(fā)酵液除草活性成分主要集中在中等極性部分。

表2 DH03發(fā)酵液不同極性提取物對稗草和反枝莧根生長的抑制作用1）Table 2 Inhibitory effects of different polar fractions from DH03 fermentation broth against the roots of E.crusgalli and A.retroflexus

3.3 DH03發(fā)酵液對盆栽稗草幼苗生長的抑制作用

DH03發(fā)酵液對盆栽稗草幼苗生長的抑制作用結(jié)果見表3。DH03發(fā)酵液對盆栽稗草幼苗表現(xiàn)出較強的抑制作用，且隨著發(fā)酵液濃度的提高，抑制作用逐漸增強。當(dāng)噴施發(fā)酵原液時，稗草受害率和平均株高分別為36.1%和9.78 cm，其抑制活性比陽性對照2，4-D稍弱。

3.4 DH03菌種鑒定

在MEA培養(yǎng)基上，菌絲初為無色，數(shù)天后菌落呈灰褐色，中部凸起，呈絨毛狀，菌絲疏松。分生孢子梗直或微彎，不分支，有隔，褐色，有明顯的節(jié)狀膨大；分生孢子頂生于梗頂膨大體上，呈圓柱形、橢圓形或近球形，深褐色。以上形態(tài)特征與文獻［15］中基本一致，初步確定DH03為枝孢屬真菌。其ITS基因擴增產(chǎn)物序列長度為570 bp，經(jīng)BLAST比對，與枝孢屬Cladosporium oxysporum（登錄號：JN887339）的相似性達99%以上，親緣關(guān)系最近，在系統(tǒng)發(fā)育樹上處于同一分支（圖1）。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，將菌株DH03鑒定為C.oxysporum。

圖1 基于5.8S r DNA基因序列構(gòu)建的菌株DH03與枝孢屬相關(guān)菌株之間的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree based on 5.8S r DNA gene sequences of DH03 and related strains

表3 DH03發(fā)酵液對盆栽稗草幼苗生長的抑制作用1）Table 3 Inhibition effects of DH03 fermentation broth against the growth of E.crusgalli

4 討論

本研究從中華稻蝗腸道中分離出6株真菌，并從中篩選出1株對稗草和反枝莧幼根具有較強抑制活性的真菌C.oxysporum DH03，經(jīng)測定，其除草活性物質(zhì)主要集中在中等極性部分，且其發(fā)酵液對稗草幼苗具有較好的抑制活性。因此，稻蝗腸道菌C.oxysporum DH03具有開發(fā)成微生物源除草劑的潛力，值得深入研究。

昆蟲是地球生物圈中已知種類最多的一類生物，昆蟲的種類、數(shù)量及分布范圍的多樣性意味著昆蟲腸道菌的多樣性［16］，我們的研究及Gebhardt等發(fā)現(xiàn)昆蟲腸道菌具有除草活性［12-13，17］，因此，昆蟲腸道菌可能是新型天然除草劑的廣泛來源。但是令人遺憾的是，目前對于昆蟲共生菌次生代謝研究僅有極少報道，亟待研究開發(fā)。

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中圖分類號：S 476

文獻標識碼：A

DOI：10.3969／j.issn.0529-1542.2014.03.013

收稿日期：2013-08-03

修訂日期：2013-09-25

基金項目：國家自然科學(xué)基金（21272215，21002092）；浙江師范大學(xué)校級課題（KJ20120026）

*通信作者Tel：0579-82286419；E-mail：ylzhang＠zjnu.cn

Screening of herbicidal fungi from the gut of Oxya chinensis and identification of the strain DJ03

Lan Tian， Chen Tingting， Shao Mingwei， Fan Qiuqin， Pan Qianqian， Wen Dan， Zhang Yinglao
（College of Chemistry and Life Sciences，Zhejiang Normal University，Jinhua 321004，China）

AbstractSix fungi were isolated from the gut of Oxya chinensis by plate separation method.The phytotoxic experiments suggested that the strain DH03 had the best herbicidal activity.When the mass concentration was 100μg／mL，the inhibition rates of EtOAc extract against the roots of Echinochloa crusgalli and Amaranthus retroflexus were more than 80%，comparable to that of 2，4-dichlorophenoxyacetic acid.Further research showed that the main herbicidal ingredients of fermentation broth were in the moderate polar part.Moreover，its fermentation broth showed a strong inhibitory effect on growth of E.crusgalli.Sprayed with fermentation broth of DH03，victimization rate and average plant height were 36.1%and 9.78 cm，respectively.The strain was identified as Cladosporium oxysporum by the morphological features and ITS sequence analysis.As a microbial herbicide，it is worthy of further study.

Key wordsOxya chinensis； insect gut fungus； herbicidal activity