‘贊皇棗’黑腐病菌拮抗芽胞桿菌的篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化

高 芬， 李靜虹， 張娜莎， 王俊宏， 王夢亮

（山西大學應用化學研究所，太原 030006）

‘贊皇棗’黑腐病菌拮抗芽胞桿菌的篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化

高 芬， 李靜虹， 張娜莎， 王俊宏， 王夢亮*

（山西大學應用化學研究所，太原 030006）

摘要以‘贊皇棗’黑腐病主要病原菌鏈格孢菌［Alternaria alternata（Fries）Keissler］為靶標，對具有較強抗真菌活性的10株芽胞桿菌進行室內(nèi)多重篩選，并采用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)設(shè)計和單因素試驗對篩選獲得的目標菌分別進行發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化和最佳發(fā)酵條件確立。結(jié)果表明：芽胞桿菌B07對靶標菌拮抗作用良好，活體拮抗抑菌帶寬度達（8.00±0.50）mm，無菌發(fā)酵濾液抑菌圈直徑為（24.44±1.37）mm，且有良好的持久性，具有開發(fā)應用價值；B07發(fā)酵的最優(yōu)培養(yǎng)基為：紅薯粉2 g／L，牛肉膏10 g／L，NaCl 10 g／L，MnSO40.02 g／L；最佳發(fā)酵條件為：種子液濃度1.5×107～2.0×108cfu／mL時，接種量5%（V／V），裝液量40 mL／250 m L，原始p H7.0，發(fā)酵溫度32℃，時間72 h。

關(guān)鍵詞贊皇棗； 黑腐病菌； 拮抗芽胞桿菌； 多重篩選； 發(fā)酵條件優(yōu)化

‘贊皇棗’（Zanhuang jujube）又名金絲大棗，是我國700多個棗品種中唯一的自然三倍體，每100 g鮮棗中維生素C含量高達383～597 mg，稱為“活維生素丸”，居各種果品之首［1］。黑腐病是‘贊皇棗’主要果實病害之一，受害果實的病部稍有凹陷或皺折，進而整個病果呈暗紅色；發(fā)病后期棗果實干縮成灰黑色或黑色，易脫落，味苦，不能食用［2］。近幾年來該病害發(fā)生日趨嚴重［3］，極大地影響了‘贊皇棗’的產(chǎn)量、果實品質(zhì)和商品價值。

針對該病害大多采用化學藥劑防治，雖有一定成效，但由于化學農(nóng)藥存在毒性大、殘留高、污染嚴重、對人體有危害等諸多缺點，且‘贊皇棗’作為鮮食品種，對防治果實病害的農(nóng)藥具有更高的使用要求，所以選用高效、低毒、低殘留的生物農(nóng)藥，對生產(chǎn)綠色或有機棗果具有重大的現(xiàn)實意義［4］。拮抗微生物不僅不易使病原菌產(chǎn)生耐藥性、不污染環(huán)境、無殘留，而且其生防制劑具有高效、持久等特點，是植物病害生物防治中的重要可利用資源。芽胞桿菌分布廣泛，具有顯著的抗菌活性和極強的抗逆能力［5-6］，能忍受極端的外部環(huán)境而長期存活［7］，可以制成可濕性粉劑、粉劑等各種劑型而不失活，因此，是一種理想的生防微生物。一些芽胞桿菌（Bacillus spp.）的優(yōu)勢菌株已經(jīng)開發(fā)成生物農(nóng)藥投入到植物病害的防治中。陳志誼［8］、黎起秦［9］等利用芽胞桿菌進行水稻紋枯病防治，取得了良好的效果；Daivasikamani等利用枯草芽胞桿菌（Bacillussubtilis）來防治咖啡銹病，體外抑制試驗表明：該芽胞桿菌對咖啡銹菌（Hemileia vastatrix）孢子萌發(fā)的抑制率高達68.20%，而在體內(nèi)試驗中對其孢子萌發(fā)的抑制率也能達到42.98%［10］。目前，有關(guān)棗黑腐病生物防治的報道較少，僅見陳貽金等［11］將農(nóng)抗鏈霉素（70～140 IU／mL）、50%DT600倍液、卡那霉素（140 IU／mL）和土霉素（210 IU／mL）等在發(fā)病期內(nèi)混合使用，保果率在90%以上；李志清等［12］將3%中生菌素（800倍）、4%農(nóng)抗120（400倍）和4%雙抗（400倍）等與化學農(nóng)藥甲基硫菌靈等交替使用，防治效果也較好，但利用芽胞桿菌開發(fā)防治棗黑腐病生防制劑的研究未見報道。因此，為尋找棗果實病害無公害防治的新途徑，本研究以從山西省石樓縣‘贊皇棗’黑腐病果中分離獲得的主要病原菌之一鏈格孢菌［Alternaria alternata（Fries）Keissler］為靶標，對本實驗室保存的10株具較好抗真菌活性的芽胞桿菌進行了篩選，并對篩選獲得的芽胞桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基配方和條件進行了優(yōu)化，以期為田間試驗的進行和生防制劑的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試芽胞桿菌：B01（Bacillus thuringiensis）、B02（B.cereus）、B03（B.polymyxa）、B04（B.megaterium）、B06（B.laterosporus）、B09（B.licheniformis）、B05、B07、B08、B10均為B.subtilis，上述供試菌株由本實驗室篩選并保存，相關(guān)種屬鑒定數(shù)據(jù)待發(fā)表。

供試病原菌：‘贊皇棗’黑腐病主要病原菌鏈格孢菌（A.alternata），由本實驗室分離鑒定。

1.2 拮抗芽胞桿菌的多重篩選

1.2.1 病原菌培養(yǎng)

孢子懸液制備：將靶標菌接PDA斜面活化120 h后，每個斜面加入無菌水5 m L，制備孢子或菌絲懸浮液（10×15倍下，30～40個／視野），置4℃冰箱備用。

菌塊制備：在制備好的PDA平板上加入孢子懸液0.2 m L，玻璃棒涂布均勻，28℃恒溫培養(yǎng)72 h，待靶標菌長滿全皿后，用無菌打孔器制備菌塊（直徑7 mm），待用。

1.2.2 拮抗菌無菌發(fā)酵濾液制備

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖6 g／L，牛肉膏9 g／L，NaCl4g／L，MnSO40.05 g／L，p H 7.0。將待篩選的芽胞桿菌在PDA培養(yǎng)基活化48 h（28℃），然后制成終濃度為1.5×107～2×108cfu／m L的菌懸液，按4%的比例（V／V）接種至50 m L的液體培養(yǎng)基中（250 m L三角瓶），180 r／min搖床振蕩培養(yǎng)48 h（30℃）后，6 000 r／min離心10 min，取上清液，用細菌過濾器除去菌體（0.22μm），得拮抗菌無菌發(fā)酵濾液，置4℃冰箱備用。

1.2.3 活體對峙篩選

采用平板對峙法［13］篩選：挑取一環(huán)活化好的拮抗菌，在PDA平板1／2處畫線，28℃培養(yǎng)24 h后，在拮抗菌線兩邊等距離（15 mm）接入靶標菌菌塊，28℃培養(yǎng)72 h，測量抑菌帶寬度。

1.2.4 拮抗菌搖瓶發(fā)酵篩選

用牛津杯法［14］進行復篩菌株抑菌活性測定：將靶標菌孢子懸液加入熔融態(tài)PDA培養(yǎng)基（30μL／70 m L PDA，20 m L／皿，9 cm平皿），制成混菌平板。凝固后，等距離放入牛津杯2個，牛津杯無菌濾液加樣量0.2 m L，28℃培養(yǎng)72 h后，十字交叉法測量抑菌圈直徑。

1.2.5 無菌發(fā)酵濾液抑制菌絲生長法篩選

采用含藥平板法［15］測定發(fā)酵液對菌絲生長的抑制效果：把無菌發(fā)酵濾液按比例加入熔融態(tài)的PDA培養(yǎng)基中，使其最終稀釋倍數(shù)分別為10、20、40、80、160倍，制備平板（每皿20 m L）。然后將靶標菌菌塊接入平板中央，72、120、168 h時測量菌落直徑，并計算抑制率。相對抑制率（%）＝［（對照菌落直徑－處理菌落直徑）／對照菌落直徑］×100。

上述試驗均設(shè)無菌水為對照，試驗設(shè)3次重復。

1.3 拮抗芽胞桿菌培養(yǎng)條件優(yōu)化

1.3.1 發(fā)酵培養(yǎng)基碳、氮源優(yōu)化

碳源優(yōu)化：以原始培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，將其中的葡萄糖（C-A）依次換為麥芽糖（C-B）、可溶性淀粉（C-C）、紅薯粉（C-D）、蔗糖（C-E）、麩皮（C-F）。按1.2.2的方法制備無菌發(fā)酵濾液，牛津杯法進行生物測定，確定最佳碳源。

氮源優(yōu)化：在確定最適碳源基礎(chǔ)上，將培養(yǎng)基中的牛肉膏（N-A）依次換為蛋白胨（N-B）、豆餅粉（NC）、酵母膏（N-D）、魚粉（N-E）、氯化銨（N-F）。方法同碳源優(yōu)化，確定最佳氮源。

以上試驗均設(shè)3次重復。

1.3.2 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計發(fā)酵培養(yǎng)基

采用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計，選擇培養(yǎng)基中4種主要組分：碳源（X1）、氮源（X2）、NaCl（X3）、MnSO4（X4）為4個考察因素，每個因素選取5個顯著水平，采用DPS軟件設(shè)計4因素5水平正交回歸旋轉(zhuǎn)試驗組合，共進行36組試驗［16-18］，確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基。試驗重復3次。

優(yōu)化前后培養(yǎng)基的效價對比：將優(yōu)化前后的培養(yǎng)基同時發(fā)酵，按照1.2.2的方法制備無菌發(fā)酵濾液，牛津杯法生物測定，明確培養(yǎng)基優(yōu)化后的效果。試驗設(shè)3次重復。

1.3.3 發(fā)酵條件優(yōu)化

接種量：以優(yōu)化后的培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基，分別以2%、3%、4%、5%、6%的比例（V／V）進行接種，孢子液制備同1.2.1，無菌發(fā)酵濾液制備同1.2.2，生物測定同1.2.4，確定最佳接菌量。

初始p H：在接種量確定的基礎(chǔ)上，將培養(yǎng)基初始p H分別調(diào)至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，同上試驗，確定最佳初始p H。

裝液量：在上述試驗的基礎(chǔ)上，裝液量分別為20、30、40、50、60 m L（250 m L三角瓶）時進行發(fā)酵，同上試驗，確定最佳裝液量。

發(fā)酵溫度：在上述試驗的基礎(chǔ)上，分別于20、24、28、32、36℃下發(fā)酵，同上試驗，確定最佳發(fā)酵溫度。

發(fā)酵時間：在上述試驗的基礎(chǔ)上，分別發(fā)酵培養(yǎng)24、36、48、60、72 h，同上試驗，確定最佳發(fā)酵時間。

以上試驗均設(shè)3次重復。所有結(jié)果采用DPS統(tǒng)計軟件進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗芽胞桿菌的多重篩選

通過平板對峙法對10株芽胞桿菌進行初篩，其中菌株B01、B05、B07有明顯拮抗效果，抑菌帶寬度分別為（9.25±0.96）、（8.00±0.50）和（8.00± 0.50）mm，遠大于其他備篩菌株。上述3株菌的無菌發(fā)酵濾液活性測定表明：菌株B01、B07抑菌圈直徑分別為（17.44±3.16）和（24.44±1.37）mm，而菌株B05抑菌圈直徑僅為（12.13±1.66）mm，因此選取菌株B01、B07進入下步篩選。

菌絲生長抑制試驗結(jié)果表明：同等稀釋倍數(shù)下，B07的抑菌率明顯高于B01，在稀釋10倍時，B07的抑菌率可達54%；相同時間下，隨著稀釋倍數(shù)的增加，B01和B07發(fā)酵液對靶標菌的抑制率也隨之下降（圖1），但B01抑菌活性的下降速度明顯比B07快。在發(fā)酵液稀釋160倍，168 h時測定抑菌活性發(fā)現(xiàn)：B07發(fā)酵液的抑菌率仍達36%，而B01的抑菌率僅為13%，說明菌株B07代謝產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)有較好的持效性。

圖1 芽胞桿菌B01和B07無菌發(fā)酵濾液對菌絲生長的抑制作用Fig.1 The inhibition effects of bacteria-free filtrate of B01 and B07 on mycelial growth

2.2 拮抗芽胞桿菌培養(yǎng)基優(yōu)化

2.2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基碳、氮源優(yōu)化

在供試的6種碳源中，以紅薯粉、淀粉、蔗糖和麥芽糖為碳源進行發(fā)酵，發(fā)酵液的抑菌效果較好，且活性依次略有降低，但四者之間無顯著差異（P＞0.05）。從實際應用和發(fā)酵成本考慮，選用紅薯粉作為碳源。在供試的6種氮源中，以牛肉膏為氮源進行發(fā)酵后，發(fā)酵液的抑菌效果顯著高于其他5種氮源，故選用牛肉膏作為氮源（圖2）。

2.2.2 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計發(fā)酵培養(yǎng)基

采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對二次回歸旋轉(zhuǎn)組合試驗的數(shù)據(jù)進行擬合，由方差分析（表1）可知，回歸方程的失擬性檢驗F1＝2.202 14＜F0.05（10，11）＝2.85不顯著，可以認為所選定的二次回歸模型是適當?shù)?；回歸方程的顯著性檢驗F2＝2.396 98＞F0.05（14，21）＝2.20顯著，說明方程與試驗數(shù)據(jù)的配合是可行的，可用來建立模型［19］，故認為僅就各試驗因素而言，方程回歸結(jié)果是可靠的。最終獲得的優(yōu)化后培養(yǎng)基配方為：紅薯粉2 g／L，牛肉膏10 g／L，NaCl 10 g／L，MnSO40.02 g／L。

通過優(yōu)化前后的培養(yǎng)基效價對比試驗，測得原始培養(yǎng)基發(fā)酵液的抑菌圈直徑為（26.25±0.71）mm，而優(yōu)化后可達（30.50±1.52）mm，抑菌活性提高了16.2%，表明優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基更利于B07菌株代謝產(chǎn)生抗菌物質(zhì)。

圖2 不同碳、氮源對芽胞桿菌B07發(fā)酵后抗菌物質(zhì)的影響Fig.2 Effects of carbon and nitrogen sources on antifungal substances from Bacillus B07

表1 回歸旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計試驗方差分析1）Table 1 Analysis of variance test of quadratic orthogonal rotation combination design

2.2.3 發(fā)酵條件優(yōu)化

接菌量：在接種量占發(fā)酵液總體積2%～5%的范圍內(nèi)，菌株B07發(fā)酵液的抑菌活性隨接種量的上升而上升，且在接種量占發(fā)酵液總體積的5%時產(chǎn)量達到最高。接種量＞6%時，發(fā)酵液抑菌活性有所降低（圖3a）?？梢?，在一定量的發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量的多少與抑菌活性物質(zhì)的產(chǎn)量有關(guān)，菌量太小不能充分利用發(fā)酵培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分；菌量過多則導致營養(yǎng)成分不足，使抑菌活性物質(zhì)的產(chǎn)量受到影響。當接種量控制在5%時可得到較好的發(fā)酵效果。

初始p H：在不同初始p H條件下，菌株B07發(fā)酵液的抑菌活性隨著p H的升高緩慢上升，當p H＝7時達到最高，此后開始緩慢下降，但各處理間差異不顯著，說明初始p H在5.0～9.0的范圍內(nèi)，對發(fā)酵液的抑菌活性影響不大，但以p H 7.0時為最佳。這可能和芽胞桿菌對極端環(huán)境有極強的抗逆能力，弱酸弱堿條件對菌株的生長沒有造成太大的影響有關(guān)（圖3b）。

裝液量：菌株B07發(fā)酵液的抑菌活性隨裝液量增加緩慢上升，當裝液量＞40 m L時抑菌活性開始緩慢下降。裝液量為20～60 m L／250 m L的范圍內(nèi)，各處理間抑菌活性無顯著差異，但以40 m L最佳，說明裝液量在40 m L時，營養(yǎng)成分的供應和通氣量達到了良好的平衡（圖3c）。由于裝液量的多少直接影響到培養(yǎng)瓶中的氧氣含量，氧氣的量供應不足會影響菌體的生長，導致產(chǎn)素量降低［16］。因此，以該裝液量為后續(xù)試驗選用的裝液量。

發(fā)酵時間：B07發(fā)酵液的抑菌活性隨發(fā)酵時間的延長而增加，當發(fā)酵72 h時抑菌活性達到最佳，而84 h時抑菌活性無明顯變化，可見72 h是其發(fā)酵的最佳時間，既保證了抗菌物質(zhì)達到最大產(chǎn)生量，又節(jié)約了時間（圖3d）。

溫度：發(fā)酵溫度在24～32℃之間時，發(fā)酵液的抑菌活性逐步上升，在32℃時達到最高，36℃時開始下降（圖3e），但28℃和32℃處理間無顯著差異，所以28～32℃都可視為適合發(fā)酵溫度，以32℃為佳。

圖3 不同發(fā)酵條件對芽胞桿菌B07產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的影響Fig.3 Effects of different fermentation conditions on antifungal substances from Bacillus B07

綜上所述，B07搖瓶發(fā)酵的最佳條件為：種子液濃度1.5×107～2×108cfu／m L時，接種量5%（V／V），裝液量40 m L／250 m L三角瓶，起始p H7.0，發(fā)酵溫度32℃，發(fā)酵時間72 h。

3 討論

生物防治是未來農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的重要措施，而分離篩選高效拮抗菌是進行生物防治研究的基礎(chǔ)［20-21］。本研究通過對10株有抗真菌活性的芽胞桿菌進行多重篩選，從中獲得一株對‘贊皇棗’黑腐病主要病原菌鏈格孢菌（A.alternata）具有良好抑菌活性的菌株—枯草芽胞桿菌B07。該菌株在活體對峙培養(yǎng)和搖瓶發(fā)酵復篩中，表現(xiàn)出了顯著而穩(wěn)定的抑菌效果，同時也顯示出了較好的持效性?？莶菅堪麠U菌的研究與應用在國內(nèi)外已有100多年的歷史，作為一種安全、高效、多功能和極具開發(fā)潛力的微生物菌種已廣泛應用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生、食品、畜牧業(yè)、水產(chǎn)及科研諸領(lǐng)域［22］。為此，我們對菌株B07的發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，獲得了最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基組合和室內(nèi)搖瓶發(fā)酵的最佳條件，為進入中試發(fā)酵和田間試驗奠定了基礎(chǔ)。

本研究篩選獲得的芽胞桿菌B07雖然在室內(nèi)篩選中表現(xiàn)出了良好的抑菌效果，具有作為生物農(nóng)藥的潛力，但是由于生防制劑在使用過程中，受不同地區(qū)生態(tài)條件，包括溫濕度、降雨量、土壤結(jié)構(gòu)、p H、含水量以及微生物區(qū)系等因素的影響［23］，田間的防治效果和室內(nèi)的抑菌結(jié)果不具有完全的對應關(guān)系，因而還需在芽胞桿菌B07發(fā)酵條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上進行中試發(fā)酵，進一步明確其田間防治效果。另外，由于棗黑腐病由多個病原菌引起，單純施用對一種菌具有拮抗效果的生防制劑，不一定能起到最優(yōu)的防治效果，所以，B07與多種拮抗菌株聯(lián)合使用時，能否保持較好的拮抗效果也是后續(xù)生防制劑開發(fā)需要考慮的問題。

此外，抑菌有效組分的分離、活性物質(zhì)理化性質(zhì)的測定以及安全性試驗等方面的工作也有待進一步深入開展。

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中圖分類號：S 476

文獻標識碼：A

DOI：10.3969／j.issn.0529-1542.2014.03.012

收稿日期：2013-07-15

修訂日期：2013-10-29

基金項目：科技部創(chuàng)新方法專項（2010IM020700）

*通信作者E-mail：mlwang＠sxu.edu.cn

In vitro screening of antagonistic Bacillus against Alternaria alternata and optimization of fermentation factors

Gao Fen， Li Jinghong， Zhang Nasha， Wang Junhong， Wang Mengliang
（Institute of Applied Chemistry，Shanxi University，Taiyuan 030006，China）

AbstractMultiple in vitro screening of 10 Bacillus strains against Alternaria alternata（Fries）Keissler was conducted.The optimum fermentation medium and fermentation conditions for the selected strain were determined by using quadratic orthogonal rotation combination design and single-factor experiment design，respectively.The results showed that the strain Bacillus B07 had obvious and stable antagonistic effect on A.alternata.The inhibition belt of the living body was up to（8.00±0.50）mm in width，and the inhibition zone of the bacteria-free filtrate was（24.44±1.37）mm in diameter.With lasting inhibition effect，Bacillus B07 had great potential for a commercial development.The optimum fermentation medium for strain B07 consisted of 2 g／L sweet potato powder，10 g／L beef extract，10 g／L NaCl，and 0.02 g／L MnSO4.The optimum fermentation conditions were defined as follows：inoculation amount，5%（V／V）with a seed broth concentration of 1.5×107－2.0×108cfu／m L，40 m L media in a 250 m L flask，initial p H at 7.0，and fermentation at 32℃for 72 h.

Key wordsZanhuang jujube； black rot； antagonistic Bacillus spp.； screening； optimization