響應(yīng)面法優(yōu)選紅豆杉枝葉中有效成分的提取工藝

呂佳佳， 李俊生， 王興慧， 劉志輝

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)， 江蘇 南京 210046； 2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院， 江蘇 南京 210036）

響應(yīng)面法優(yōu)選紅豆杉枝葉中有效成分的提取工藝

呂佳佳1， 李俊生1， 王興慧1， 劉志輝2*

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)， 江蘇 南京 210046； 2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院， 江蘇 南京 210036）

目的 采用響應(yīng)面法優(yōu)選紅豆杉枝葉中4種紫杉烷類有效成分的提取工藝。方法 選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間以及溶劑倍量為考察因素， 以紫杉醇、 7-表-紫杉醇、 7-表-10-去乙?；仙即?、 10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的量為評價指標(biāo)， 計算總評 “歸一值”， 并進行二項式擬合， 用效應(yīng)面法優(yōu)選提取工藝， 對結(jié)果進行預(yù)測分析。 結(jié)果 確定最優(yōu)提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù) 71.32%， 18.6 倍量回流提取 2 次、 每次提取 0.82 h。 結(jié)論 采用響應(yīng)面法得到的提取紅豆杉枝葉中有效成分的工藝條件可靠，簡單易行，對紅豆杉枝葉中有效成分的提取具有一定的參考意義。

紅豆杉；紫杉烷類；有效成分；響應(yīng)面法；提取工藝

南 方 紅 豆 杉 (Taxus chinensis var.mairei chenget L.K) 又稱美麗紅豆杉， 為國家一級保護植物， 是紅豆杉科 (Taxaceac) 紅豆杉屬 (Taxus)植物中分布最廣、生長最快的種類之一，研究證明紅豆杉中紫杉醇能促進微管聚合，穩(wěn)定微管結(jié)構(gòu)，抑制微管解聚， 并將處于分裂期的細(xì)胞阻滯于 GZ/ M期， 誘導(dǎo)細(xì)胞凋 亡而達到抗腫瘤的 作用［1-3］。紫杉醇屬于紫杉烷類，同為二萜類化合物，研究顯示紫杉烷類也具有良 好的抗腫瘤作用［4-5］， 其 中含量較高的成分有紫杉醇、7-表-紫杉醇、 7-表-10-去乙?；仙即己?10-去乙酰巴卡亭Ⅲ。 目前已有學(xué)者對紅豆杉中紫杉醇的含量及化學(xué)結(jié)構(gòu)進行了研究［6］， 但紫杉烷類有效成分提取工藝尚未見報道。為了科學(xué)、充分地利用紅豆杉資源，采用響應(yīng)面法對影響有效成分的量的關(guān)鍵因素進行考察和優(yōu)化，為大生產(chǎn)提供參考。

1 儀器與試藥

Agilent1100 高 效 液 相 色 譜 儀:G1322A 脫 氣機， G1311A 四 元 泵， G1316A 柱 溫 箱， G1314A VWD檢測器； R-Ⅱ旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (瑞典布琪公司)；DP-S24 型電熱恒溫水浴鍋 (上海精弘實驗設(shè)備有限公司)； 電子分析天平 (BP-211D型， 德國賽多利斯公司)等。

紫杉醇、7-表-紫杉醇、 7-表-10-去乙酰基紫杉醇對照品 (均購自中國藥品生物制品檢定所， 含量測 定 用， 批號 分 別為 100382-201102、 100927-201102、100925-200701)， 10-去 乙 酰 巴 卡 亭 Ⅲ(10-DABⅢ) 對照品 (購自四川省維克奇生物科技有限公司， 含量測定用， 批號為 120624)。 紅豆杉枝葉購自無錫紅豆集團藥業(yè)有限公司 (批號20121025)， 測定用甲醇和乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測定方法

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗 Aglient C18色譜柱 (4.6 mm×250 mm， 5 μm)； 流動相以水為流動相A， 乙腈為流動相 B， 按下列洗脫程序進行梯度 洗 脫:0 ～16 min， 21% ～40%B； 16 ～50 min， 40% ～55%B；50 ～54 min， 55% ～56%；54 ～70 min， 56% ～65%B。 柱溫 30 ℃；體積流量 1.0 mL/min； 檢測波長 227 nm。

分別吸取 10-DABⅢ、 7-表-10-去乙酰 基 紫 杉醇、 紫杉醇、 7-表-紫杉醇混合對照品溶液#1、 供試品溶液各 10 μL，注入高效液相色譜儀， 測定，供試品與對照品在相同位置有吸收，分離度大于1.5， 理論塔板數(shù)按紫杉醇峰計不低于3 000， 見圖1 ～2。

圖 1 10-DABⅢ、 7-表-10-去乙?；仙即肌?紫杉醇、 7-表-紫杉醇對照品色譜圖Fig.1 Reference chromatogram of 10-DABⅢ， 7-table-10-deacetyl taxol， taxol and 7-table-paclitaxel

圖2 供試品溶液色譜圖Fig.2 Chromatogram of the test solution

2.1.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取 10-DABⅢ、 7-表-10-去乙?；仙即肌?紫杉醇、 7-表-紫杉醇對照品 10.25、 10.03、 10.50、 10.57 mg于 4 個25 mL的量瓶中，甲醇定容至刻度， 搖勻， 即得質(zhì)量濃度分別為 410、 401.2、 420、 422.8 μg/m L的對照品貯備液。 精密量取 10-DABⅢ貯備液 12 mL、7-表-10-去乙?；仙即假A備液 6 m L、 紫杉醇貯備液 8 mL、 7-表-紫杉醇貯備液 8 mL于 50 mL的量瓶中， 制備為混合對照品溶液#1。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密吸取各貯備液適量， 加 甲 醇 稀 釋 成 質(zhì) 量 濃 度 分 別 為 9.84、19.68、 49.2、 68.88、 98.4 μg/mL的 10-DABⅢ系列 對 照 品 溶 液； 6.419、 12.84、 25.68、 38.51、64.19 μg/mL的 7-表-10-去乙酰基紫杉醇系列對照品 溶 液； 5.04、 10.08、 20.16、 35.28、 50.4 μg/mL的紫杉醇系列對照品溶液； 6.765、 13.53、27.06、 47.36、 67.65 μg/mL 7-表-紫杉醇系列對照品溶液。 按 “2.1.1”項下色譜條件測定， 以峰面積積分值為縱坐標(biāo)、供試品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表1。

表1 紅豆杉枝葉中4種成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Tab.1 Standard curve equation of four com ponen ts in Yew foliage

2.1.4 精密度試驗 取 10-DABⅢ、 7-表-10-去乙酰基紫杉醇、 紫杉醇、 7-表-紫杉醇混合對照品溶液1#，重復(fù)進樣 6 次， 計算 10-DABⅢ、 7-表-10-去乙?；仙即?、 紫杉醇、 7-表-紫杉醇對照品峰面積的 RSD分別為 0.58%、 0.73%、 0.60%、 0.59%。

2.1.5 加樣回收率試驗 取已知含量的紅豆杉枝葉粉末 (含量分別為:10-DABⅢ為2.241 4 mg/g，7-表-10-去乙酰基紫杉醇為0.372 9 mg/g， 紫杉醇為0.332 7 mg/g，7-表-紫杉醇為0.432 8 mg/g) 約2.5 g， 6 份， 精密稱定， 分別精密加入 10-DABⅢ對照品 (410.00 μg/mL)14 m L、 7-表-10-去乙酰基紫杉醇對照品 (401.20 μg/mL)2 mL、 紫杉醇對照品 (420.00 μg/m L)2 mL、 7-表-紫杉醇對照品 (422.80 μg/mL)3 mL， 按 “供試品溶液的制備” 項下方法制備供試品溶液， 測定， 測得 10-DABⅢ、 7-表-10-去乙?；仙即?、 紫杉醇、 7-表-紫杉醇的平均回收率分別為:97.41%、96.25%、98.02%、 97.46%， RSD分別為 2.24%、 2.46%、1.85%、 2.59%。

2.1.6 供 試 品 溶 液 的 制 備 與 測 定 分 別 將“2.2.1、 2.2.2、 2.2.3、 2.2.4” 項下得到的提取液定容至 200 mL， 過 0.45 μm濾膜， 即得供試品溶液。分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液10 μL注入高效液相色譜儀， 測定， 計算。

2.2 提取因素和相關(guān)水平的選擇

2.2.1 提取方法的選擇 取紅豆杉枝葉粉末 (80目)5 g， 分別以超聲 (功率200W)、 回流 (電熱套回流)、 溫浸 (溫度 50 ℃) 的方法進行提取，15 倍量的甲醇提取兩次， 每次 1 h。 濾過， 合并兩次提取液，按含量測定方法制備供試品溶液，測定， 結(jié)果見圖 3(n=3)。

圖3 不同提取方法對紅豆杉枝葉中紫杉烷類有效成分提取效果的影響Fig.3 Effect of differen t extraction methods on the active com ponents of taxanes in Yew foliage

由結(jié)果可知，回流提取方法比超聲和溫浸提取的有效成分含量高，故選之。

2.2.2 提取溶劑的選擇 取紅豆杉枝葉粉末 (80目)5 g， 分別以甲醇、 30%、 50%、 70%、 95%乙醇為溶劑， 15 倍量回流提取兩次， 每次 1 h。 合并提取液，按含量測定方法制備供試品，測定，結(jié)果見圖4(n=3)。

圖4 不同提取溶劑對紅豆杉枝葉中紫杉烷類有效成分提取效果的影響Fig.4 Effect of different extraction solvents on the active components of taxanes in Yew foliage

如圖所示，以甲醇和 95%乙醇為溶劑， 雖然7-表-10-去乙?；仙即?、 紫杉醇、 7-表紫杉醇的量較高， 但 10-DABⅢ含有量較低； 而以 70%乙醇為溶劑對4個指標(biāo)值均能達到較好的提取效果；隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)降低，有效成分的提取率隨之降低，考慮到多因素間的相互影響，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)的下限為 60%， 上限為 80%。

2.2.3 提取時間選擇 取紅豆杉枝葉粉末 (80目)5 g， 以15 倍量70%乙醇回流提取兩次， 時間分別為 0.5、 1、 1.5、 2 h， 合并提取液， 按含量測定方法制備供試品， 測定， 結(jié)果見圖 5(n=3)。

可知提取1 h后，有效成分含有量變化不大，考慮到多因素交互作用的影響，提取時間范圍定為0.5 ～1.5 h。

圖5 不同提取時間對紅豆杉枝葉中紫杉烷類有效成分提取效果的影響Fig.5 Effect of d ifferent extraction time on the active ingredients of taxanes in the Yew foliage

2.2.4 溶劑倍量范圍的選擇 取紅豆杉枝葉粉末(80 目)5 g， 分別加入 12、15、 18、 20、 22 倍量70%乙醇提取兩次， 每次 1 h， 合并提取液并定容至 200 mL， 按含量測定方法制備供試品， 測定，結(jié)果見圖 6(n=3)。

圖6 不同溶劑倍量對紅豆杉枝葉中紫杉烷類有效成分提取效果的影響Fig.6 Effect of different amounts of the solvents on the active com ponents of taxanes in Yew foliage

結(jié)果表明， 18 倍溶劑時提取量較高，大于 18倍增加不顯著。從節(jié)約溶劑角度考慮，溶劑倍量范圍定為16 ～20 倍。

2.3 響應(yīng)面設(shè)計［7-9］

2.3.1 試驗設(shè)計 單因素試驗結(jié)果表明， 選取乙醇體積分?jǐn)?shù) (X1)、 料液比 (X2) 和提取時間(X3) 為自變量， 根據(jù) Box-Benhnken 的中心組合實驗設(shè)計原理對各因素進行3水平設(shè)計， 見表3，以10-DABⅢ (C1)、 7-表-10-去乙?；仙即?(C2)、紫杉醇 (C3) 和 7-表紫杉醇 (C4) 量作為評價指標(biāo)， 實驗設(shè)計方案及結(jié)果見表3， 提取次數(shù)定為2次。為了將所有指標(biāo)綜合為一個能反映總體效應(yīng)結(jié)果的值， 實驗中引入 “ 總評歸一值” (overalldesirability， OD) ， 來考察指標(biāo)的綜合效果， 根據(jù) Hassan 的方法對各個指標(biāo)進行歸一化處理。

對于欲測出各指標(biāo)，其計算公式如式 (1):

其中， Yi為實測值， Ymin和 Ymax系 指 每 一指標(biāo)在不同次試驗中測得的所有值中的最小和最大值。計算出各指標(biāo)的 di值后， 由式 (2) 計算 OD值:

表 2 Box-Behnken試驗設(shè)計因素與水平的編碼Tab.2 Cod ing of factor-levels in Box-Behnken design

表 3 Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果Tab.3 Arrangement and results of Box-Behnken design

2.3.2 模 型 擬 合 將 所 得 數(shù) 據(jù) 用 Design-Expert 7.1.5 軟件進行響應(yīng)面試驗分析，以 OD為響應(yīng)值Y分別對各因素X(自變量)進行多元線性回歸和二項式方程擬合， 回歸方程為:Y=0.69+9.825 × 10-3X1-0.053X2+0.064X3-0.14X1X2+ 0.077X1X3-0.21X2X3-0.32X21-0.18X22-0.25X23。R2=0.978 6， adj-R2=0.9511。 方 差 分 析結(jié) 果 見表4。

表4 紅豆杉枝葉有效部位提取工藝條件響應(yīng)面擬合回歸方程的方差分析結(jié)果Tab.4 Results of variance analysis of the fitting regression equation w ith the response surface for extraction conditions of the effective parts of Yew foliage

由方差分析結(jié)果可知，在本實驗設(shè)定的區(qū)域范圍內(nèi)，提取時間和溶劑倍量對紅豆杉枝葉有效成分的提取有顯著影響，乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間和溶劑倍量的交互相對其有顯著影響?；貧w方程失擬檢驗不顯著，表明未知因素對試驗結(jié)果干擾很小。擬合檢驗極顯著，表明該方程與實際情況擬合很好，較好地反映了紅豆杉枝葉紫杉烷類有效成分與乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)、提取時間和溶劑倍量的關(guān)系，所得回歸方程能較好的預(yù)測紅豆杉有效成分隨各參數(shù)的變化規(guī)律。由回歸模型進行預(yù)測分析，OD最大預(yù)測值為 0.712， 最優(yōu)條件為乙醇體積分?jǐn)?shù) 71.32%， 溶劑倍量 18.6 倍、提取時間 0.82 h。

2.4 工藝驗證試驗

根據(jù)響應(yīng)面法優(yōu)選出的工藝條件，提取紅豆杉枝葉粉末 3 份 (每份 5 g)， 進行工藝驗證。 結(jié)果見表5。

表5 工藝驗證試驗 （n=3）Tab.5 Results of verification test（ n=3）

根據(jù)上述結(jié)果計算，二項式擬合方程預(yù)測值與實測值的偏差率 =(0.690 1-0.712)/0.712 × 100%=-3.08%，說明二項式擬合效果良好， 所建立的數(shù)學(xué)模型具有良好的預(yù)測性，所選工藝條件重現(xiàn)性較好。

3 討論

紫杉醇在紅豆杉類植物中的含量很低，目前產(chǎn)業(yè)用的紫杉醇多通過提取紅豆杉中的紫杉烷類成分進行半合成。與根皮相比，枝葉中所含的成分與根皮大致相同，只是含量稍低，而枝葉因其不斷地生長而可反復(fù)、循環(huán)利用，因而可較好地緩解紅豆杉資源匱乏問題，保護生態(tài)。

相對于紅豆杉中紫杉醇的提取工藝，目前國內(nèi)學(xué)者對紫杉烷類化合物的提取工藝研究較少，特別是對其多個有效成分的提取尚未見報道，本實驗采用響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，兼顧了多個影響因素和多個參考指標(biāo)，適用于非線性模型擬合，提高了數(shù)學(xué)模型的預(yù)測性，且結(jié)果較為理想。

紅豆杉枝葉成分復(fù)雜，各有效成分的極性有所不同， 所研究的 4 種有效成分中 10-DABⅢ的水溶性較強，其余3種脂溶性較強，根據(jù)有效成分的性質(zhì)選擇適宜體積分?jǐn)?shù)的乙醇熱回流提取，能保證其提取率均達到較高水平。前期研究中，有進行石油醚脫脂，二氯甲烷萃取等步驟對比，最終發(fā)現(xiàn)經(jīng)70%乙醇回流得到的提取液， 在不斷調(diào)整流動相(乙腈和水) 梯度后， 進樣分析。所得各成分峰的分離度與峰形均較好，該提取工藝簡便高效，為其有效部位或成分的進一步開發(fā)利用提供了參考。

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Optim ization of the extraction process of active com ponents in Yew foliage by response surfacem ethod

LüJia-jia1， LI Jun-sheng1， WANG Xing-hui1， LIU Zhi-hui2*

(1.Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210046， China； 2.The Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210036， China)

Chinese yew； taxanes； active components； response surfacemethod； extraction process

R284.2

:A

:1001-1528(2014)02-0280-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.02.014

2013-04-15

江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項目 (PAPD2011)

呂佳佳 (1988—)， 女， 碩士生， 從事中藥新劑型與新技術(shù)研究。 Tel:15950566883

*通信作者: 劉志輝 (1962—) ， 男， 教授， 主任中藥師， 從事中藥制劑開發(fā)及中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。 Tel:(025)86529291， E-mail:liuzh1008@126.com