斑馬魚nr1d4a和nr1d4b基因的表達及其對不同環(huán)境刺激的響應

楊 玲嚴軍軍龍 勇崔宗斌鮑傳和

(1. 安徽農(nóng)業(yè)大學生命科學院, 合肥 230000; 2. 中國科學院水生生物研究所, 武漢 430072)

斑馬魚nr1d4a和nr1d4b基因的表達及其對不同環(huán)境刺激的響應

楊 玲1嚴軍軍2龍 勇2崔宗斌2鮑傳和1

(1. 安徽農(nóng)業(yè)大學生命科學院, 合肥 230000; 2. 中國科學院水生生物研究所, 武漢 430072)

研究獲得了斑馬魚nr1d4a和nr1d4b基因的cDNA, 進行了序列比對和系統(tǒng)進化分析, 并采用實時定量RT-PCR (qPCR)方法研究了其表達模式及對不同環(huán)境刺激的轉(zhuǎn)錄反應。研究發(fā)現(xiàn), 斑馬魚nr1d4a和nr1d4b是由基因復制產(chǎn)生的旁系同源基因, 具有高度保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。斑馬魚nr1d4a和nr1d4b的表達模式具有明顯的差別。nr1d4a在胚胎發(fā)育早期的表達量很低, 72 hpf時開始顯著升高; 而nr1d4b具有較高水平的母源性表達, 6 hpf時的表達量明顯降低, 但也在72 hpf顯著回升。nr1d4a在腦和腎臟中表達量最高, 其次是鰓、卵巢、精巢和眼, 在肝臟中的表達量最低; nr1d4b在卵巢中表達量最高, 其次是精巢和腦, 在腸道和心臟中表達量最低。斑馬魚nr1d4a和nr1d4b都能被多種環(huán)境刺激瞬時誘導表達。16℃低溫處理0.5h就能顯著誘導斑馬魚nr1d4a和nr1d4b基因的表達, 但處理6h后其誘導效應開始下降并逐漸消失。除低溫外, 重金屬(2 μmol/L鎘)、缺氧(5%氧氣)和鹽度(5‰)處理均能瞬時誘導nr1d4a和nr1d4b的表達,說明nr1d4a和nr1d4b基因可能參與斑馬魚對多種環(huán)境刺激的適應性反應。研究為深入揭示魚類nr1d4a和nr1d4b基因的生物學功能及其表達調(diào)控機制奠定了基礎。

斑馬魚; 細胞核受體; 環(huán)境刺激; 基因表達

斑馬魚 nr1d4a和 nr1d4b基因是細胞核受體(Nuclear receptor)家族的成員[1]。細胞核受體是一類能與類固醇激素、甲狀腺激素、親脂性維生素和小分子代謝產(chǎn)物等配體相結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子[2]。細胞核受體與相應的配體結(jié)合后產(chǎn)生變構(gòu)效應而被激活,激活的受體與特定 DNA序列結(jié)合, 并募集其他通用轉(zhuǎn)錄因子和共激活因子(Coactivator)或共抑制因子(Corepressor), 從而激活或抑制下游基因的表達[3]。除了已知的能與配體結(jié)合的細胞核受體外, 大約有50%的細胞核受體因缺乏已知的配體而被稱為“孤兒受體”[2]。細胞核受體家族成員眾多, 在胚胎發(fā)育、體內(nèi)穩(wěn)態(tài)維持、代謝調(diào)控、疾病發(fā)生等生物學過程中發(fā)揮著重要功能[1]。

長期以來, NR1D亞類細胞核受體(Rev-reb)都被認為是孤兒受體。近期研究發(fā)現(xiàn), 血紅素是NR1D1、NR1D2和 E75(NR1D3)等的配體[4—6]。 NR1D1和 NR1D2主要起抑制基因表達的作用, 在脊椎動物中主要參與生物鐘節(jié)律(Circadian rhythm)、代謝調(diào)控和炎癥反應[7—10]。在果蠅等無脊椎動物中, E75參與蛻皮激素信號傳導、蛻皮激素合成、胚胎發(fā)育等重要的生物學過程[6]。雖然該亞類其他幾個受體的研究較多, 但魚類 Nr1d4的研究還未見報道, 尚不清楚其配體和生物學功能。

前期研究發(fā)現(xiàn), 在暴露于16℃低溫2h后, 斑馬魚96hpf出膜仔魚中nr1d4a和nr1d4b的表達量都顯著上調(diào); 暴露 48h后誘導效應消失, 而 34℃高溫處理2h和48h都不能誘導其表達[11]。據(jù)此推測這兩個基因都是低溫刺激條件下的即刻早期基因(Immediate early gene, IEG), 可能對低溫適應性表型的建立起著重要的調(diào)控作用。為研究斑馬魚nr1d4a和nr1d4b基因的表達特征, 驗證其是否具有低溫特異性, 本研究克隆獲得了這兩個基因的cDNA, 研究其在胚胎和仔魚階段及成體不同組織中的表達模式; 同時將斑馬魚96hpf仔魚分別暴露于低溫、高溫、重金屬、鹽度和缺氧等環(huán)境刺激, 檢測不同處理對其轉(zhuǎn)錄表達的誘導效應, 為深入研究斑馬魚nr1d4a和nr1d4b基因的生物學功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 cDNA克隆

根據(jù) GenBank中預測的斑馬魚 nr1d4a(XM_ 686515)和nr1d4b(XM_695595)mRNA序列分別設計PCR引物(表1), 用成體斑馬魚腦cDNA作模板擴增其編碼區(qū)序列。切膠回收擴增片段后用 BamHⅠ和XbaⅠ雙酶切, 并與經(jīng)相同酶切的 pCMV-N-HA(碧云天)載體連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 Top10大腸桿菌后,挑取陽性克隆測序。

1.2 序列比對和系統(tǒng)進化分析

用Vector NTI 8.0軟件進行序列比對, 分析不同NR1D受體氨基酸序列之間的保守位點和同源性。為構(gòu)建 NR1D亞類細胞核受體的系統(tǒng)進化樹, 先用Clustalx 2.1[12]軟件對不同受體的氨基酸序列進行多重序列比對, 序列比對結(jié)果用 MEGA 4.0[13]中的最大簡約法(Maximum parsimony)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

表1 用于cDNA克隆的引物Tab. 1 Primers used for cDNA cloning

1.3 斑馬魚胚胎和組織樣品的收集

按照文獻[14]的方法收集和培養(yǎng) AB品系斑馬魚胚胎。分別在受精后0.75(2細胞期), 6、12、24、48、72、96和 120h收集胚胎或仔魚。收集的樣品保存在1.5 mL塑料離心管中, 并將培養(yǎng)液吸干。每個時間點各取3個生物學平行, 其中2細胞期時每管收100粒胚胎, 其他時期每管各取60粒(尾)胚胎(仔魚)。取出膜仔魚時先將培養(yǎng)皿放冰上, 待其麻醉后再吸入離心管。1齡斑馬魚成魚[體重(0.55±0.12) g]用0.016% MS-222麻醉后解剖, 取腦、鰓、心臟、眼、腎臟、肝臟、腸道、肌肉、精巢和卵巢等組織置于離心管中。除卵巢取自雌魚外, 其他組織都來自雄魚。收集的樣品置液氮中速凍后于–80℃保存。

1.4 斑馬魚仔魚的處理

將胚胎培養(yǎng)到48 hpf時取表型正常的胚胎, 按60粒/培養(yǎng)皿的密度隨機分配到盛6 mL胚胎培養(yǎng)液的60 mm塑料培養(yǎng)皿中。96 hpf時開始環(huán)境因子暴露, 包括對照、低溫(16℃)、高溫(34℃)、重金屬(2 μmol/L 氯化鎘)、鹽度(5‰)和缺氧等6個處理組,每個處理組設3個生物學平行。低溫和高溫處理方法參照文獻[11, 15]。除溫度刺激外, 其他處理都在28℃條件下進行。重金屬和鹽度處理時分別將氯化鎘(國藥集團)和海水晶(廣東鹽業(yè)集團)用胚胎培養(yǎng)液(30% Danieau溶液)配制成所需濃度。缺氧處理在Eppendorf Galaxy?48R CO2培養(yǎng)箱中進行, 氧氣含量為5%。斑馬魚胚胎的培養(yǎng)和除缺氧以外的處理都在生化培養(yǎng)箱(上海精宏 SHP-150型)中進行。處理后未發(fā)現(xiàn)實驗魚死亡情況。對照和低溫處理組分別在暴露后0.5、2、6、12和24h收集樣品, 其他處理組則分別在暴露后2、12和24h收集樣品。

1.5 總RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄

收集的樣品用TRIZOL試劑(Invitrogen)提取總RNA。用NanoDrop 8000 (Thermo Scientific)測定總RNA濃度。瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA樣品完整性, 28S 和18S 核糖體RNA 條帶清晰, 兩者的光密度比值都在2.0 左右。逆轉(zhuǎn)錄前用無RNA酶的DNA酶Ⅰ(Promega)處理總RNA樣品以去除基因組DNA污染。用Fermentas RevertAidTM第一鏈cDNA合成試劑盒中的6堿基隨機引物從4 μg總RNA合成第一鏈cDNA。

1.6 qPCR

qPCR引物用Primer Premier 6.0軟件設計, 由上海生物工程有限公司合成。qPCR反應在Bio-rad CFX96實時定量 PCR儀中進行。每個反應重復 3次。qPCR反應體系和程序、Cq值的確定、標準曲線的繪制及引物擴增效率的計算參考文獻[11]。qPCR檢測的基因名稱、GenBank登錄號、引物的序列和擴增效率見表2。文獻[16]的研究結(jié)果表明, 常用內(nèi)參基因中18S (18S ribosomal RNA)的表達在不同發(fā)育階段和不同組織中最穩(wěn)定, 而 actb1 (actin beta1)的表達在不同環(huán)境刺激處理后最穩(wěn)定。因此,本研究以18S作內(nèi)參檢測目的基因在胚胎發(fā)育過程中和不同成體組織中的表達, 以 actb1作內(nèi)參檢測不同處理條件下目的基因的表達。用Q-Gene方法[17]計算目的基因的相對表達量。

1.7 統(tǒng)計分析

處理組和對照組之間目的基因的表達差異用SPSS 15.0軟件中的獨立樣本t檢驗方法進行顯著性分析(P＜0.05)。

表2 定量PCR引物序列及擴增效率Tab. 2 Sequences and amplification efficiency of qPCR primers

2 結(jié)果

2.1 斑馬魚nr1d4a和nr1d4b是旁系同源基因

本研究采用RT-PCR方法獲得斑馬魚nr1d4a和nr1d4b基因的編碼區(qū), 并提交到 GenBank數(shù)據(jù)庫,登錄號為JX869170和JX869171。這兩個序列與預測序列(XM_686515和XM_695595)的相應編碼區(qū)長度相同, 核苷酸序列僅存在細微差別, 分別相差 12和5個堿基, 編碼的肽鏈分別相差7和3個氨基酸,說明本研究成功獲得斑馬魚nr1d4a和nr1d4b基因的編碼序列。

斑馬魚nr1d4a和nr1d4b基因分別位于23號和11號染色體(圖 1A)。基因同線性分析(Syntenic analysis)結(jié)果表明, 雖然斑馬魚nr1d4a和nr1d4b上游的基因各不相同, 但其下游的基因具有較為嚴格的同線性, 如 raraga/b、hoxc13a/b、hoxc12a/b和hoxc11a/b等(圖1A)。斑馬魚nr1d4a和nr1d4b基因的結(jié)構(gòu)也相當保守, 都包含 8個外顯子, 各個外顯子的長度也非常接近(圖 1B)。這些結(jié)果表明, 斑馬魚nr1d4a和nr1d4b是進化過程中由基因組復制產(chǎn)生的旁系同源基因。

2.2Nr1d細胞核受體的系統(tǒng)進化和序列比對分析

NR1D亞類細胞核受體共有 4個, 包括NR1D1(Rev-erbα)、NR1D2(Rev-erbβ)、NR1D3(E75)和NR1D4, 其中哺乳動物中只有NR1D1和NR1D2, NR1D3只在果蠅等無脊椎動物中存在, 而 NR1D4則為硬骨魚類所特有[1,6]。NR1D2和NR1D4在斑馬魚中發(fā)生了加倍, 各有兩個旁系同源基因[1]。用斑馬魚Nr1d4a和Nr1d4b氨基酸序列Blast搜尋Ensembl數(shù)據(jù)庫中的青 鳉 (Oryzias latipes)基因組序列, 都能找到高度保守的同源基因(圖 2 A), 說明nr1d4基因在其他硬骨魚類中也發(fā)生了復制。系統(tǒng)進化分析結(jié)果表明, 斑馬魚的Nr1d1、Nr1d2a和Nr1d2b分別與人(Homo sapiens)和小鼠(Mus musculus)的NR1D1與NR1D2聚為一類, 斑馬魚的Nr1d4a和Nr1d4b與青鳉的 ENSORLP00000009821和 ENSORLP000000 19274聚為一類(NR1D4), 家蠶(Bombyx mori)和旋毛蟲(Trichinella spiralis)的 E75親緣關系最近(NR1D3)(圖 2A)。這些研究結(jié)果進一步明確了斑馬魚Nr1d亞類細胞核受體的分類關系。

斑馬魚nr1d4a和nr1d4b分別編碼570和576個氨基酸, 其核苷酸和蛋白質(zhì)序列的同源性分別為68%和67%。為分析斑馬魚Nr1d4a和Nr1d4b重要功能域的保守性, 將其與研究較為詳細的人NR1D1和NR1D2的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域序列進行了比對分析。結(jié)果表明, 這些蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域高度保守, 同源性高達 90%以上, 配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域也非常保守, 但同源性比 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域低(圖2B)。因此, 斑馬魚Nr1d4a和Nr1d4b與人NR1D1和NR1D2可能具有相似的DNA結(jié)合位點和結(jié)合相同的配體。

2.3 斑馬魚nr1d4a和nr1d4b基因的表達譜

基因在發(fā)育過程及成體組織中的表達數(shù)據(jù)對探討其功能具有重要作用。收集不同發(fā)育階段的斑馬魚胚胎及仔魚進行 qPCR分析, 檢測 nr1d4a和nr1d4b在早期發(fā)育過程中的轉(zhuǎn)錄表達。結(jié)果表明, nr1d4a在早期(0.75—48 hpf)的表達量很低, 出膜后其表達量迅速升高, 72 hpf時的表達量是48 hpf的13.40倍, 96 hpf時表達量在72 hpf的基礎上進一步升高, 而從96 hpf到120 hpf其表達量保持不變(圖3A)。nr1d4b在2細胞期(0.75 hpf)具有較高水平的母源性表達, 6 hpf開始其表達量明顯下降并維持在較低水平(6—48 hpf), 72 hpf時表達量顯著升高, 約為 48 hpf表達量的7.89倍, 96 hpf的表達量與 72 hpf相同, 120 hpf時表達量進一步升高(圖3B)。胚胎發(fā)育過程中nr1d4b的表達量高于 nr1d4a,但隨著發(fā)育的進行其差距逐漸縮小, 如在 0.75、6、12、24和48 hpf時nr1d4b的表達量分別為nr1d4a表達量的40.28、26.63、10.77、3.36和3.51倍。另外, 這兩個基因的表達量都在出膜后(72 hpf)顯著升高(圖3), 說明其存在是仔魚的正常生命活動所必需的。

在成體組織中, 斑馬魚nr1d4a在腦和腎臟中的表達量最高, 其次是鰓、卵巢、精巢和眼, 而在肝臟中的表達量最低; nr1d4b在卵巢中表達量最高, 其次是精巢和腦, 而在腸道和心臟中表達量最低(圖4)。在腸道、肝臟、肌肉、心臟和眼中nr1d4a與nr1d4b的表達量非常接近, 而在腦、腎臟和鰓中nr1d4a的表達量高于nr1d4b, 在精巢和卵巢中nr1d4b的表達量高于nr1d4a (圖4)。這些結(jié)果表明, 斑馬魚nr1d4a和nr1d4b的組織分布存在較大差別; 由于其氨基酸序列高度保守, 可能這兩個受體在成體的不同組織中發(fā)揮相同的功能。

2.4 斑馬魚nr1d4a和nr1d4b基因?qū)Σ煌h(huán)境刺激的響應

為研究不同環(huán)境刺激對斑馬魚 nr1d4a和nr1d4b基因轉(zhuǎn)錄表達的誘導效應, 將96 hpf斑馬魚仔魚分別暴露于低溫、鹽度、高溫、缺氧和重金屬(Cd)等環(huán)境刺激。首先根據(jù)文獻報道選擇不同環(huán)境刺激條件下顯著上調(diào)表達的標記基因, 包括 cirbp (低溫)[15]、hsp70(高溫和鹽度)[11,18]、igfbp1a(缺氧)[19]和mt2(重金屬)[20]。通過檢測標記基因的表達來驗證本研究中環(huán)境刺激的有效性。結(jié)果表明不同環(huán)境刺激都能顯著誘導相應標記基因的表達(圖5), 說明了本研究所用刺激條件的有效性。

由圖6A可知, 暴露于低溫處理0.5h后nr1d4a的表達量就顯著上調(diào), 處理 2—6h后誘導倍數(shù)進一步升高, 而處理 12h后誘導效應開始下降, 到 24h時處理組的表達量已降低到與對照組相同的水平。對于其他環(huán)境刺激, 暴露2h后缺氧和鹽度處理能顯著誘導nr1d4a的表達, 暴露12h后重金屬、高溫和鹽度能顯著誘導nr1d4a的表達, 而處理24h后只有高溫能顯著誘導nr1d4a的表達(圖6B)。以上結(jié)果表明, 不同環(huán)境刺激都能在暴露后瞬時誘導nr1d4a的表達, 其中低溫處理的誘導效應最強; 不同環(huán)境刺激的作用時間也有差別, 低溫、缺氧和鹽度處理2h后即可顯著誘導其表達, 而鎘和高溫則在處理 12h后才表現(xiàn)出誘導效應(圖6)。

圖2 NR1D細胞核受體的系統(tǒng)進化分析和序列比對Fig. 2 Phynogenetic analysis and sequence alignment of NR1D nuclear receptors

與 nr1d4a相似, 低溫處理0.5h也能顯著誘導nr1d4b的表達, 處理2和6h后誘導效應進一步增強, 而處理12和24h后則沒有誘導效應(圖7A)。對于其他環(huán)境刺激, 暴露 2h后只有缺氧能顯著誘導nr1d4b的表達, 暴露12h后鎘和鹽度能顯著誘導其表達, 而暴露 24h后則都不能誘導其表達(圖7B)。對比 nr1d4a和 nr1d4b對不同環(huán)境刺激的轉(zhuǎn)錄反應可以發(fā)現(xiàn), nr1d4a和nr1d4b的表達具有相同的變化方式, 都是在暴露后早期瞬時上調(diào)表達, 而且都能對不同環(huán)境刺激發(fā)生反應; 但也有不同之處, 首先是 nr1d4a發(fā)生反應的時間范圍比 nr1d4b寬, 如低溫暴露后 0.5—12h對 nr1d4a都有誘導效應, 而只在暴露后 0.5—6h對 nr1d4b有誘導效應,另外, 高溫處理能誘導nr1d4a的表達, 但不能誘導nr1d4b的表達(圖6、圖7)。這些結(jié)果表明, 斑馬魚nr1d4a和nr1d4b都是能被多種環(huán)境刺激誘導表達的早期反應基因。

圖3 斑馬魚nr1d4a (A)和nr1d4b (B)在胚胎期和仔魚期的表達Fig. 3 Expression patterns of zebrafish nr1d4a (A) and nr1d4b (B) at embryonic and larval stages

3 討論

Nr1d4是硬骨魚類所特有的細胞核受體, 屬于NR1D亞類[1]。雖然對該亞類中的NR1D1、NR1D2和 E75進行了較多的研究, 其配體和生物學功能已有一定的認識, 但 Nr1d4的研究還未見報道。本研究克隆獲得了斑馬魚nr1d4a和nr1d4b基因的cDNA,并進行了序列比對和系統(tǒng)進化分析, 發(fā)現(xiàn)其核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域和配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域均與人 NR1D1和NR1D2的相應結(jié)構(gòu)域高度保守; 另外, 雖然E75是果蠅等無脊椎動物中所特有的 NR1D亞類成員, 但其與哺乳動物的NR1D1和NR1D2一樣都識別血紅素作為配體[4—6]。因此, 斑馬魚Nr1d4a和Nr1d4b可能結(jié)合與其他同亞族成員相同的配體和 DNA序列,但還需要進一步實驗驗證。

圖4 斑馬魚nr1d4a和nr1d4b在不同組織中的表達Fig. 4 Tissue-specific expression of zebrafish nr1d4a and nr1d4b

圖5 不同環(huán)境刺激對標記基因的誘導表達Fig. 5 Induced expression of maker genes by their corresponding environmental stresses

本研究結(jié)果表明, 斑馬魚nr1d4a和nr1d4b是由基因復制產(chǎn)生的旁系同源基因, 雖然其編碼的氨基酸序列具有很高的同源性, 但其表達模式具有明顯的差別, 如 nr1d4a在胚胎發(fā)育早期表達量很低, 而nr1d4b具有較高水平的母源性表達; nr1d4a在腦和腎臟中表達量最高, 而nr1d4b則在卵巢中表達量最高, 說明在進化過程中不僅基因序列發(fā)生了改變,表達模式也發(fā)生了明顯變化, 這與 Bertrand等的研究結(jié)果相一致[1]。雖然人的NR1D1和NR1D2并不是由基因復制產(chǎn)生的旁系同源基因, 但其調(diào)控的下游基因卻有很大比例的重疊[8]。因此, 斑馬魚nr1d4a和nr1d4b這兩個旁系同源基因可能在魚體的不同發(fā)育階段和不同組織中發(fā)揮著相似的作用; 但其具體生物學功能, 以及對所調(diào)控的下游基因究竟是起激活還是抑制作用都有待進一步研究。另外, 斑馬魚nr1d4a和 nr1d4b基因?qū)Φ蜏氐雀鞣N環(huán)境刺激都能產(chǎn)生相似的轉(zhuǎn)錄反應, 說明其表達調(diào)控機制也具有很大程度的相似性。

圖6 不同環(huán)境刺激對斑馬魚nr1d4a轉(zhuǎn)錄表達的誘導效應Fig. 6 Inductive effect of different environmental stresses on the transcriptional expression of zebrafish nr1d4a

圖7 不同環(huán)境刺激對斑馬魚nr1d4b轉(zhuǎn)錄表達的誘導效應Fig. 7 Inductive effect of different environmental stresses on the transcriptional expression of zebrafish nr1d4b

雖然斑馬魚nr1d4a和nr1d4b最初是由基因芯片研究發(fā)現(xiàn)的低溫刺激誘導表達的即刻早期基因[11],但本研究結(jié)果表明, 除低溫以外, 重金屬、缺氧和鹽度等環(huán)境刺激都能在暴露的早期階段瞬時誘導其表達, 說明斑馬魚nr1d4a和nr1d4b是機體應對多種環(huán)境刺激的一般性即刻早期基因。這類基因的突出代表還包括fos (v-fos FBJ murine osteosarcoma viral oncogene homolog)和atf 3 (activating transcription factor 3)等, 這兩個基因既能被低溫處理顯著誘導,又能被高溫處理誘導表達[11]。深入研究這些基因的表達調(diào)控, 鑒定受其調(diào)控的下游基因, 將揭示環(huán)境刺激條件下細胞的基因表達調(diào)控網(wǎng)絡以及機體應對不同環(huán)境刺激的適應性機制。

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EXPRESSION PATTERNS OF ZEBRAFISH NR1D4A AND NR1D4B AND THEIR TRANSCRIPTIONAL RESPONSES TO DIFFERENT ENVIRONMENTAL STRESSES

YANG Ling1, YAN Jun-Jun2, LONG Yong2, CUI Zong-Bin2and BAO Chuan-He1
(1. School of Life Sciences, Anhui Agricultural University, Hefei 230000, China; 2. Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China)

We cloned the cDNAs of zebrafish nr1d4a and nr1d4b, performed sequence alignment and phynogenetic analyses, and characterized the expression patterns and their transcriptional responses to several environmental stresses by using real time quantitative RT-PCR (qPCR). The results indicated that zebrafish nr1d4a and nr1d4b genes are paralogs generated by genomic duplication. The DNA binding domain and ligand binding domain of these two paralogs are highly conserved, but these genes possess distinct expression patterns. The abundance of nr1d4a mRNA was quite low during the early stages of embryogenesis and markedly increased at 72hpf; however, nr1d4b was found to be maternally expressed and the mRNA abundance decreased at 6hpf and significantly increased at 72hpf as well. As for tissue-specific expression, the highest expression of zebrafish nr1d4a was found in brain and kidney, followed by gill, ovary, testis and eye, and liver was the organ with the lowest expression. The highest abundance of nr1d4b mRNA was found in ovary, followed by testis and brain, and the lowest expression was found in intestine and heart. The expression of both nr1d4a and nr1d4b could be induced by multiple environmental stresses. The up-regulation of zebrafish nr1d4a and nr1d4b could be detected at as early as 0.5h after exposed to cold stress (16℃). However, the inductive effect of cold stress decreased and gradually disappeared after 6h of exposure. In addition to cold stress, the expression of zebrafish nr1d4a and nr1d4b was also induced by heavy metal (2 μmol/L cadmium), hypoxia (5% oxygen) and salinity (5‰), indicating the involvement of these genes in the acclimation to various environmental stresses. Thus, these findings have laid the foundation for further investigation of nr1d4a and nr1d4b functions and mechanisms underlying the regulation of their expression in fish.

Zebrafish; Nuclear receptor; Environmental stresses; Gene expression

Q78

A

1000-3207(2014)01-0100-08

10.7541/2014.13

2012-10-16;

2013-09-12

國家自然科學基金項目(31101892)資助

楊玲(1986—), 女, 河南信陽人;碩士研究生; 研究方向為遺傳學。E-mail: yangling_19860105@126.com

鮑傳和, E-mail: baochh1202@ahau.edu.cn; 崔宗斌, E-mail: zbcui@ihb.ac.cn