殼聚糖對(duì)草魚(yú)人工感染水霉的影響

孫 琪 胡 鯤 楊先樂(lè)

(上海海洋大學(xué), 國(guó)家水生動(dòng)物病原庫(kù), 上海 201306)

殼聚糖對(duì)草魚(yú)人工感染水霉的影響

孫 琪 胡 鯤 楊先樂(lè)

(上海海洋大學(xué), 國(guó)家水生動(dòng)物病原庫(kù), 上海 201306)

水霉病給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[1,2], 水霉是引起魚(yú)類(lèi)發(fā)生水霉病的主要病原, 其適應(yīng)溫度范圍廣(5—26 ), ℃ 分布范圍亦很廣[3]。水霉對(duì)宿主無(wú)嚴(yán)格的選擇性[4,5], 除魚(yú)卵外, 魚(yú)類(lèi)水霉病均非原發(fā)性疾病, 而是繼發(fā)性疾病[6,7]。當(dāng)魚(yú)類(lèi)皮膚或鰓受到機(jī)械損傷及其他病原體的傷害時(shí), 水霉孢子會(huì)在傷口處侵染萌發(fā)。目前國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上還沒(méi)有一種藥物可有效防治水霉病, 防治水霉病成為水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)的一個(gè)重要難題。如何減少水霉病的發(fā)生成為水霉病研究的重要部分。由于水霉是腐生性的, 未受傷的魚(yú)不受感染[8,9], 所以促進(jìn)魚(yú)體傷口愈合成為減少水霉病發(fā)生的一條重要途徑。

甲殼素(Chitin)是唯一一種在自然界中大量存在的氨基多糖, 其化學(xué)命名為 β-(1→4)-2-乙酰氨基-2-脫氧-D-葡萄糖。殼聚糖(Chitosan)是甲殼素的脫乙?；a(chǎn)物, 也叫脫乙酰甲殼素, 簡(jiǎn)稱(chēng)(CTS)[10]。甲殼素分布極其廣泛, 大量存在于海洋節(jié)肢動(dòng)物(如蝦、蟹)的甲殼中, 也存在于昆蟲(chóng)、藻類(lèi)細(xì)胞膜和高等植物的細(xì)胞壁中, 在自然界的儲(chǔ)量?jī)H次于纖維素[11], 每年生物合成的甲殼素有10萬(wàn)億千克之多。殼聚糖有促進(jìn)傷口愈合的作用[12], 殼聚糖可促進(jìn)內(nèi)白細(xì)胞殺菌素和巨噬細(xì)胞的遷移, 用殼聚糖處理的傷口,可以加速Ⅲ型膠原蛋白的分泌, 從而促進(jìn)了肉芽組織和上皮組織的形成[13]。Mori, et al.[14]通過(guò)鼠體外實(shí)驗(yàn)證明殼聚糖對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞和表皮細(xì)胞有趨化性吸引作用, 可以促進(jìn)纖維母細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖。Kawakami, et al.[15]通過(guò)對(duì)小鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)殼聚糖對(duì)傷口疼痛有很好的舒緩作用。Allan, et al.[16]發(fā)現(xiàn)殼聚糖與傷口接觸時(shí)能起到清涼而舒服的潤(rùn)膚作用。

殼聚糖已在水處理、日用化學(xué)品、生物工程、農(nóng)業(yè)、食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[17—19], 在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的研究, 主要以其能增強(qiáng)魚(yú)蝦的免疫功能而逐漸引起國(guó)內(nèi)外水產(chǎn)工作者的關(guān)注[20], 而有關(guān)殼聚糖對(duì)魚(yú)類(lèi)的其他作用, 如對(duì)魚(yú)類(lèi)疾病有無(wú)預(yù)防、治療效果的研究很少,就其在促進(jìn)魚(yú)類(lèi)傷口愈合、預(yù)防水霉病等作用方面的研究還未涉及。因此, 本研究將殼聚糖添加到受傷草魚(yú)以及人工感染水霉草魚(yú)的養(yǎng)殖水體中, 研究殼聚糖對(duì)草魚(yú)傷口愈合以及對(duì)人工感染水霉草魚(yú)的影響。通過(guò)殼聚糖治療魚(yú)類(lèi)體表外傷, 減低魚(yú)類(lèi)感染水霉的概率, 為殼聚糖應(yīng)用于預(yù)防魚(yú)類(lèi)水霉病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用魚(yú)

草魚(yú)(Ctenopharyngodon idellus), 規(guī)格約為(50±10) g,體長(zhǎng)(15±2) cm,購(gòu)自江蘇省南通國(guó)營(yíng)農(nóng)場(chǎng), 體表以及解剖觀察健康。200 L玻璃容器, 24h增氧, 水源為已曝氣、消毒自來(lái)水, 各項(xiàng)指標(biāo)均符合漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)。草魚(yú)實(shí)驗(yàn)前暫養(yǎng) 10d, 每天定時(shí)投喂飼料 2次, 飼料配制參照 National Research Council(NRC)營(yíng)養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

殼聚糖, 純度為90%—95%, 購(gòu)自上海卡博工貿(mào)有限公司; 馬鈴薯葡糖糖瓊脂(PDA), 購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)菌株

水霉菌株為寄生水霉(Saprolegnia parasitica), 購(gòu)自于 ATCC, 菌株編號(hào): 200013。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

殼聚糖對(duì)草魚(yú)傷口愈合的影響 取 5個(gè)同樣規(guī)格的魚(yú)缸(65 cm×40 cm×50 cm, 本實(shí)驗(yàn)均為此規(guī)格魚(yú)缸)加入等量已曝氣水, 每個(gè)魚(yú)缸中分別加入相應(yīng)量的殼聚糖, 混勻, 使其殼聚糖最終濃度分別為0、12.5、25、50、100 mg/L。

取健康草魚(yú) 100條, 在每條草魚(yú)一側(cè)背鰭下方的位置, 用刀片劃“ ”Ⅱ 型傷口, 傷口以不出血為標(biāo)準(zhǔn), 將帶有傷口的草魚(yú)隨機(jī)地分配到5個(gè)魚(yú)缸中, 每缸20條。停止投喂, 5d后觀察傷口愈合情況。重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)3次。

草魚(yú)人工感染水霉實(shí)驗(yàn) 挑取保存于試管內(nèi)的水霉菌絲, 轉(zhuǎn)接于馬鈴薯葡糖糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA, 配方: 葡萄糖20 g/L, 瓊脂粉20 g/L, 馬鈴薯淀浸出粉15 g/L)培養(yǎng)皿中, 20℃培養(yǎng)72h, 使菌絲長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)基表面。取20個(gè)培養(yǎng)好的培養(yǎng)皿, 將水霉菌連同培養(yǎng)基一起放入過(guò)濾網(wǎng)袋中, 放入已曝氣水體中, pH 6.5—6.8, 在水溫20℃的條件下培養(yǎng)水霉, 18h后, 用血球計(jì)數(shù)板每隔2h計(jì)數(shù)一次水體中孢子數(shù), 直至水體中孢子濃度達(dá)到 1×104個(gè)/mL,作為感染水體。

取養(yǎng)殖于25℃水溫中健康草魚(yú)20條, 用手術(shù)刀將其背鰭下方兩側(cè)的鱗片去掉, 刮拭去掉鱗片部位的皮膚約9 cm2, 并用刀片輕微劃傷皮膚, 擦拭掉傷口表面的黏液。

將20條劃傷過(guò)的草魚(yú)置于感染水體中, 并使水溫在1h內(nèi)下降到15 ℃ , 48h 后開(kāi)始觀察記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)10次。

殼聚糖對(duì)水霉菌絲生長(zhǎng)的影響 配置濃度分別為0、12.5、25、50、100 mg/L的殼聚糖懸浮液, 分別取5 mL加入 6孔板的相應(yīng)各孔中, 然后每孔中加入水霉菌塊(5 mm×5 mm)。20℃培養(yǎng)20h后, 觀察水霉菌絲生長(zhǎng)情況。每個(gè)濃度分別作3組平行實(shí)驗(yàn)。

殼聚糖對(duì)草魚(yú)人工感染水霉實(shí)驗(yàn)的影響 (1) 感染水體中添加殼聚糖, 對(duì)草魚(yú)人工感染水霉實(shí)驗(yàn)的影響:實(shí)驗(yàn)組感染水體中含有殼聚糖, 其濃度為25 mg/L, 對(duì)照組為已曝氣自來(lái)水, pH 6.5—6.8, 用上述草魚(yú)人工感染水霉實(shí)驗(yàn)方法, 將劃傷的草魚(yú)隨機(jī)的放到上述兩組魚(yú)缸中,每缸各20條, 48h后開(kāi)始觀察記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)3次。(2) 殼聚糖浸泡受傷草魚(yú)后, 對(duì)草魚(yú)人工感染水霉實(shí)驗(yàn)的影響: 按照草魚(yú)人工感染水霉實(shí)驗(yàn)中劃傷魚(yú)體的方法處理草魚(yú) 40條, 隨機(jī)平均分配為兩組, 實(shí)驗(yàn)組水體中加入殼聚糖, 使其濃度為25 mg/L, 對(duì)照組為已曝氣自來(lái)水, pH 6.5—6.8, 養(yǎng)殖72h后, 進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)。

用上述草魚(yú)人工感染水霉的實(shí)驗(yàn)方法, 對(duì)以上兩組草魚(yú)進(jìn)行人工感染, 養(yǎng)殖 48h后, 開(kāi)始觀察記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)3次。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用 SPSS13.0軟件統(tǒng)計(jì)所有數(shù)據(jù)并進(jìn)行方差分析(one-way-ANOVA), 差異顯著時(shí)采用最小顯著性差異法(Least Significant Difference, LSD)對(duì)各組平均樣之間進(jìn)行多重比較, 數(shù)據(jù)表示為平均值加減標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)。

2 結(jié)果

2.1 殼聚糖對(duì)草魚(yú)傷口愈合的影響

殼聚糖濃度≥25 mg/L時(shí), 對(duì)草魚(yú)傷口愈合效果顯著,且傷口表面附有黏液(圖 1 a); 對(duì)照組草魚(yú)傷口紅腫, 未愈合, 甚至傷口有潰爛(圖1 b)。

圖1 草魚(yú)傷口愈合情況Fig. 1 The wound healing situation of grass carp

對(duì)照組草魚(yú)傷口愈合率為1.67%。在水體中添加殼聚糖對(duì)草魚(yú)傷口愈合率有顯著影響(P＜0.05)。在殼聚糖濃度為50 mg/L時(shí), 草魚(yú)傷口愈合率與濃度為100和25 mg/L時(shí)的無(wú)顯著差異(P＞0.05)(表1)。

2.2 草魚(yú)人工感染水霉實(shí)驗(yàn)

10次重復(fù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn), 本實(shí)驗(yàn)方法可成功地完成草魚(yú)人工感染水霉, 且有較高的感染率。從表2可看出, 草魚(yú)人工感染水霉平均感染率為 84.00%, 且在感染過(guò)程中草魚(yú)平均死亡率為2.00%, 各實(shí)驗(yàn)組間無(wú)顯著差異(P＞0.05)。

2.3 殼聚糖對(duì)水霉菌絲生長(zhǎng)的影響

20h后, 對(duì)照組水霉菌絲平均長(zhǎng)度為7.67 mm。200 mg/L殼聚糖懸浮液中水霉菌絲平均長(zhǎng)度與對(duì)照組的有顯著差異(P＜0.05), 其他濃度組與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P＞0.05)(表3)。

從表 3中可以看出: 低濃度殼聚糖對(duì)水霉菌無(wú)直接的抑制或殺滅作用, 在感染水體中添加殼聚糖不會(huì)對(duì)水霉菌產(chǎn)生直接影響。

2.4 殼聚糖對(duì)草魚(yú)人工感染水霉實(shí)驗(yàn)的影響

感染水體中添加殼聚糖, 對(duì)草魚(yú)人工感染水霉實(shí)驗(yàn)的影響 在死亡率相同條件下, 對(duì)照組草魚(yú)人工感染水霉感染率為86.67%。在感染水體中添加25 mg/L殼聚糖懸浮液時(shí),其感染率為61.67%與對(duì)照組有顯著差異(P＜0.05)(圖2)。

表1 不同濃度殼聚糖對(duì)草魚(yú)傷口愈合影響(n=3)Tab. 1 Effect of different concentrations of chitosan on grass carp wound healing(n=3)

表2 草魚(yú)人工感染水霉實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab. 2 The results of artificial infection of saprolegnia on grass carp

表3 20h后不同濃度的殼聚糖中水霉菌絲的長(zhǎng)度(n=3)Tab. 3 Hypha length of saprolegnia in different concentrations of chitosan after 20 hours(n=3)

感染前, 殼聚糖浸泡受傷草魚(yú)后, 對(duì)草魚(yú)人工感染水霉實(shí)驗(yàn)的影響 在死亡率相同條件下, 對(duì)照組草魚(yú)人工感染水霉感染率為86.67%。感染前, 25 mg/L殼聚糖浸泡受傷草魚(yú)3d后, 其感染率為43.33%與對(duì)照組有顯著差異(P＜0.05)(圖 2)。且未感染的草魚(yú)傷口明顯愈合, 且傷口表面附有黏液。

在感染水體中添加25 mg/L殼聚糖懸浮液時(shí), 草魚(yú)人工感染水霉感染率為61.67%; 感染前, 25 mg/L殼聚糖浸泡受傷草魚(yú)3d后, 其感染率為43.33%。感染前, 25 mg/L殼聚糖浸泡受傷草魚(yú) 3d后, 能極顯著的降低其感染率(P＜0.05)。

圖2 草魚(yú)人工感染水霉感染率(n=3)Fig. 2 The results of artificial infection of saprolegnia on grass carp with different chitosan treatments(n=3)

3 討論

3.1 傷口愈合

本實(shí)驗(yàn)所用的殼聚糖利用蝦、蟹殼生產(chǎn), 適量添加到受傷魚(yú)體養(yǎng)殖水環(huán)境中 5d, 殼聚糖在水體中的濃度達(dá)到25 mg/L以上時(shí), 對(duì)草魚(yú)體表傷口有顯著的愈合作用。Usami, et al.[21]對(duì)牛、Okamoto, et al.[22]對(duì)狗、Kaoru, et al.[23]對(duì)鼠傷口研究均發(fā)現(xiàn)殼聚糖具有很好的促進(jìn)傷口愈合作用, Graeme, et al.[24]對(duì)人體皮膚體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)殼聚糖可促進(jìn)纖維母細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞增殖。殼聚糖正被人醫(yī)、獸醫(yī)作為傷口愈合增效加速劑在醫(yī)學(xué)界廣泛使用[25], 本實(shí)驗(yàn)首次證實(shí)殼聚糖對(duì)非哺乳動(dòng)物體表傷口有愈合作用, 為進(jìn)一步推廣殼聚糖的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

3.2 人工感染

水霉病作為當(dāng)今水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)一個(gè)較重大難題, 現(xiàn)今還不存在一種可用的特效藥物防治水霉病。因此, 預(yù)防水霉病的發(fā)生成為重中之重。通過(guò)10次草魚(yú)人工感染水霉平行實(shí)驗(yàn)證明: 本方法穩(wěn)定可靠、可重復(fù)性高, 可作為草魚(yú)人工感染水霉基本方法用于科學(xué)研究。

本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了低濃度殼聚糖對(duì)水霉菌無(wú)直接的抑制或殺滅作用, 在感染水體中添加殼聚糖對(duì)水霉菌無(wú)直接影響。在此基礎(chǔ)上, 分別采用在感染水體中添加25 mg/L的殼聚糖以及感染前用 25 mg/L的殼聚糖浸泡受傷草魚(yú)3d, 結(jié)果表明: 草魚(yú)人工感染水霉感染率均降低。而感染前用殼聚糖浸泡受傷草魚(yú), 感染率相對(duì)更低, 死亡率與對(duì)照組無(wú)顯著差異, 說(shuō)明25 mg/L殼聚糖對(duì)草魚(yú)無(wú)毒害作用, 在生產(chǎn)實(shí)踐中可用于降低受傷魚(yú)類(lèi)水霉病發(fā)病率,減少經(jīng)濟(jì)損失。

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EFFECT OF CHITOSAN ON ARTIFICIAL INFECTION OF GRASS CARP SAPROLEGNIASIS

SUN Qi, HU Kun and YANG Xian-Le
(State Collection Center of Aquatic Pathogen, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

殼聚糖; 水霉; 草魚(yú); 人工感染; 傷口愈合

Chitosan; Saprolegnia parasitica; Ctenopharyngodon idellus; Artificial infection; Wound healing

S941.43

A

1000-3207(2014)01-0180-04

10.7541/2014.24

2012-11-20;

2013-10-25

科技部863課題“新型環(huán)境友好型漁藥的研制與漁藥安全性評(píng)價(jià)”(2011AA10A216); 上海市科技興農(nóng)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目“一種高效無(wú)毒防治水霉病制劑的研制”(滬農(nóng)科攻字(2011)第 4-8號(hào)); 國(guó)家科技基礎(chǔ)條件平臺(tái)建設(shè)運(yùn)行項(xiàng)目(2012)資助

孫琪(1987—), 女, 山東威海人; 碩士研究生; 主要從事魚(yú)類(lèi)水霉病研究。E-mail: silviasun1987@163.com

楊先樂(lè), E-mail: xlyang@shou.edu.cn