研究生細(xì)胞電生理實(shí)驗(yàn)課設(shè)計(jì)與實(shí)踐

范 茁，吳振強(qiáng)

（華南理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510006）

理論和實(shí)踐相結(jié)合一直是現(xiàn)代化高校辦學(xué)的宗旨，科學(xué)實(shí)驗(yàn)可以驗(yàn)證理論并加深對理論知識的理解，在高校生物學(xué)科的教學(xué)中占有舉足輕重的地位［1］。然而目前大多數(shù)高校仍然存在教學(xué)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備陳舊，而科研實(shí)驗(yàn)室的大型儀器對教學(xué)領(lǐng)域的開放嚴(yán)重不足等問題，這就導(dǎo)致了學(xué)生理論知識的發(fā)展更新速度較快，而實(shí)驗(yàn)課程因?yàn)閮x器方面的限制跟進(jìn)不上的現(xiàn)狀［2-3］。例如，在生物學(xué)科本科及研究生的教學(xué)中，電生理學(xué)的知識主要來自于沿用多年的蛙坐骨神經(jīng)腓腸肌標(biāo)本的制備及對其神經(jīng)干動作電位傳導(dǎo)的測量，這是組織水平的電生理現(xiàn)象。細(xì)胞水平電生理由于其所依托的膜片鉗實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)價(jià)格相對昂貴，操作精細(xì)、復(fù)雜，主要服務(wù)于科研領(lǐng)域，一直是高校生物學(xué)科實(shí)驗(yàn)教學(xué)領(lǐng)域的空缺。本文將根據(jù)華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院現(xiàn)有的教學(xué)和科研條件，闡述利用膜片鉗技術(shù)為生物學(xué)科研究生開設(shè)細(xì)胞電生理學(xué)實(shí)驗(yàn)課程的必要性和可行性，并對課程的內(nèi)容、設(shè)置及考核方式進(jìn)行詳細(xì)的探討。

1 為生物學(xué)科研究生開設(shè)細(xì)胞電生理學(xué)實(shí)驗(yàn)課程的必要性

細(xì)胞電生理是組織及機(jī)體電生理現(xiàn)象的基礎(chǔ)，因?yàn)殡y以檢測使之變得更抽象、更難理解。任何一個學(xué)科，尤其是生物學(xué)科，理論和實(shí)驗(yàn)都是相輔相成、互相促進(jìn)的，理論指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)又反過來驗(yàn)證理論、使理論知識變得形象易懂。生物學(xué)本科生相對粗淺的電生理學(xué)知識來自于蟾蜍坐骨神經(jīng)腓腸肌標(biāo)本制作及神經(jīng)干動作電位傳導(dǎo)測量等實(shí)驗(yàn)課程。研究生階段對知識的追求更加深入、細(xì)致、透徹，細(xì)胞電生理學(xué)作為理解其他電生理現(xiàn)象的基石，是生物學(xué)科研究生教學(xué)的重要內(nèi)容。然而由于儀器操作復(fù)雜、樣品準(zhǔn)備時(shí)間較長、實(shí)驗(yàn)失敗率高等缺點(diǎn)，細(xì)胞電生理的實(shí)驗(yàn)課程在大多數(shù)院校生物學(xué)科的教學(xué)中一直存在空缺。近年來有些院校開始將細(xì)胞電生理和膜片鉗技術(shù)作為高級生理學(xué)課程的一小部分內(nèi)容，與之配套的實(shí)驗(yàn)課程則由于膜片鉗實(shí)驗(yàn)技術(shù)的難度及復(fù)雜程度并沒有很好地跟進(jìn)，這就使得學(xué)生對離子通道、動作電位等細(xì)胞電生理知識的理解處于死記硬背的層面，停留在似懂非懂的狀態(tài)。由此可見，為生物學(xué)科研究生開設(shè)與理論知識配套的細(xì)胞電生理實(shí)驗(yàn)課程非常必要和緊要。

2 為生物學(xué)科研究生開設(shè)電生理實(shí)驗(yàn)課程的可行性

膜片鉗技術(shù)作為研究離子通道的“金標(biāo)準(zhǔn)”，將細(xì)胞水平和分子水平的電生理學(xué)研究聯(lián)系在一起，被人們稱為可以和基因克隆技術(shù)并駕齊驅(qū)的革命性技術(shù)，給生命科學(xué)研究帶來了巨大的前進(jìn)動力。它自上世紀(jì)70年代問世以來，已經(jīng)發(fā)展成為現(xiàn)代細(xì)胞電生理學(xué)的常規(guī)研究方法，廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、神經(jīng)科學(xué)、藥理學(xué)、病理生理學(xué)、心血管科學(xué)、中醫(yī)藥學(xué)等研究領(lǐng)域［4-7］。利用膜片鉗技術(shù)可以在細(xì)胞水平記錄可興奮細(xì)胞的動作電位及不同成分離子電流、記錄單通道及全細(xì)胞離子通道電流的動力學(xué)特征、研究不同神經(jīng)元之間的突觸聯(lián)系、觀察藥物對特異性離子通道電流的影響［8］。

經(jīng)過幾十年的發(fā)展，膜片鉗技術(shù)日趨成熟和完善，研究領(lǐng)域也越來越廣。從只能記錄一個細(xì)胞的單探頭放大器發(fā)展到可記錄不同神經(jīng)元之間突觸聯(lián)系的雙探頭、甚至三探頭放大器；從獨(dú)立的系統(tǒng)發(fā)展到可以和鈣成像、肌張力等系統(tǒng)聯(lián)用的多功能綜合系統(tǒng)；從耗時(shí)耗力的常規(guī)手動技術(shù)發(fā)展到高通量的全自動膜片鉗技術(shù)［9-10］。除此之外，系統(tǒng)外圍配件人性化的改進(jìn)使得膜片鉗操作變得更加簡單和易控，例如微操系統(tǒng)的自動化以及顯微鏡和CCD成像系統(tǒng)結(jié)合等方面的改進(jìn)都大大減輕了操作人員的工作量和工作強(qiáng)度。

膜片鉗技術(shù)在上世紀(jì)80年代進(jìn)入中國，經(jīng)過幾十年的發(fā)展，國內(nèi)有越來越多的專家學(xué)者從事電生理領(lǐng)域的研究，培養(yǎng)出一批又一批的優(yōu)秀人才，他們?yōu)槟てQ電生理實(shí)驗(yàn)課程的開設(shè)提供了人力資源保障。如今膜片鉗技術(shù)在國內(nèi)更加普及，越來越多院校的生物學(xué)科配置了科研使用的膜片鉗系統(tǒng)。總之，膜片鉗技術(shù)的成熟和硬件系統(tǒng)的完善為細(xì)胞電生理實(shí)驗(yàn)課程的開設(shè)提供了有力的硬件保障。

3 細(xì)胞電生理實(shí)驗(yàn)課程的設(shè)置和考核方式

膜片鉗電生理是融合了物理學(xué)、電子學(xué)、生物學(xué)等多學(xué)科的綜合實(shí)驗(yàn)技術(shù)，為生物學(xué)科研究生開設(shè)的細(xì)胞電生理實(shí)驗(yàn)課要適合生物學(xué)科的學(xué)生物理學(xué)、電子學(xué)知識相對不足的特點(diǎn)，對膜片鉗技術(shù)原理方面的講解要淺顯易懂，側(cè)重于生物學(xué)應(yīng)用相關(guān)的內(nèi)容。下面就這一課程的具體設(shè)置和考核方式一一闡述。

細(xì)胞電生理實(shí)驗(yàn)課包含理論講解和實(shí)驗(yàn)操作2部分內(nèi)容，理論部分包括：

（1）細(xì)胞離子通道的類型，靜息電位的形成機(jī)制，可興奮性細(xì)胞動作電位的形成機(jī)制。

（2）膜片鉗技術(shù)的發(fā)展、原理和應(yīng)用。

（3）膜片鉗技術(shù)的4種常見的記錄方式。

（4）膜片鉗硬件和軟件的介紹。

重點(diǎn)和詳細(xì)地講解第一和第三部分。第二和第四部分講解地點(diǎn)最好在放置膜片鉗的實(shí)驗(yàn)室，對照實(shí)物可以使學(xué)生更容易理解抽象的內(nèi)容。實(shí)驗(yàn)部分則主要以急性分離的大鼠心肌細(xì)胞為研究對象，觀測大鼠心肌細(xì)胞的靜息電位、動作電位和3種主要成分離子電流（Na＋、K＋和 Ca2＋電流）［11-12］。此外將某一種電壓門控性離子通道（例如BK通道）轉(zhuǎn)染到傳代培養(yǎng)的細(xì)胞（CHO或HEK293），可以研究特定種類離子通道單通道和全細(xì)胞的特性。

樣品準(zhǔn)備，尤其是心肌細(xì)胞的急性分離需要的時(shí)間較長，且容易失敗，需要由膜片鉗技術(shù)人員或者電生理研究室高年級的研究生來完成，但是樣品準(zhǔn)備的原理和過程要對學(xué)生進(jìn)行講解，這樣可以使學(xué)生更容易理解實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)操作課程采取觀摩和動手操作相結(jié)合的方式進(jìn)行，簡單且易于掌控的操作可以由學(xué)生完成，難度大的操作如封接、破膜等由教師或技術(shù)員完成后給學(xué)生看一下結(jié)果即可。

實(shí)驗(yàn)操作課分4次進(jìn)行。

第一次課，練習(xí)玻璃微電極的拉制和拋光；在顯微鏡下尋找玻璃電極；電極入水接近細(xì)胞等一系列操作。此外利用模擬細(xì)胞演示檢測全細(xì)胞電流的整個操作過程，這一次的實(shí)驗(yàn)主要由學(xué)生完成，為以后檢測真實(shí)細(xì)胞的動作電位及電流打下基礎(chǔ)。

第二次課，檢測大鼠心肌細(xì)胞靜息電位、動作電位和動作電流。大鼠心肌細(xì)胞要在上課前準(zhǔn)備好，上課時(shí)先讓學(xué)生觀察大鼠心肌細(xì)胞的形態(tài)，選擇橫紋清楚的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本次實(shí)驗(yàn)課難度高的操作要由教師完成，比如心肌細(xì)胞的封接和破膜，破膜后可在教師的指導(dǎo)下由學(xué)生進(jìn)行操作。封接、破膜完成后將電壓鉗轉(zhuǎn)換為電流鉗模式，觀測細(xì)胞靜息膜電位，之后給細(xì)胞施加約900pA、5ms時(shí)長的脈沖電流，檢測細(xì)胞的動作電位。動作電流則以之前檢測到的動作電位為鉗制電壓程序，在電壓鉗模式下進(jìn)行檢測。結(jié)合動作電位和動作電流的形狀，給學(xué)生講解動作電位形成的離子機(jī)制及不同時(shí)間段對應(yīng)的離子電流的方向和成分。

第三次課，檢測心肌細(xì)胞3種主要離子電流成分。細(xì)胞封接、破膜完成后在電壓鉗模式下檢測電流，先在不加任何阻斷劑的情況下檢測全部成分混合的離子電流，然后用阻斷劑結(jié)合脈沖電壓程序分離出Na＋、K＋和Ca2＋3種不同的離子電流成分。實(shí)驗(yàn)完成后，讓學(xué)生觀察和記錄3種成分離子電流的特征和幅度。

第四次課，檢測轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞上的BK單通道及全細(xì)胞電流。HEK293的傳代培養(yǎng)要提前準(zhǔn)備好，BK及GFP質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染在實(shí)驗(yàn)課的前一天由實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員完成，讓學(xué)生選擇有綠色熒光的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。和上次一樣，細(xì)胞的封接、破膜等難度大的操作由教師完成，其他可以交給學(xué)生操作。封接完成后，cell-attach模式記錄BK單通道電流［13］，之后破膜，記錄BK全細(xì)胞電流。實(shí)驗(yàn)完成后，讓學(xué)生觀察BK單通道和全細(xì)胞電流的特征，記錄電流幅度。

課程考核采取動手能力和實(shí)驗(yàn)報(bào)告相結(jié)合的方式，動手能力主要看學(xué)生實(shí)驗(yàn)操作掌握的快慢程度和準(zhǔn)確程度、有沒有嚴(yán)重的操作錯誤，實(shí)驗(yàn)報(bào)告則針對實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖形、數(shù)據(jù)及課后思考題的回答等給予評分。

4 總結(jié)和討論

本文闡述了為生物學(xué)科研究生開設(shè)細(xì)胞電生理課程的必要性、可行性以及課程具體的設(shè)置和考核方式。細(xì)胞電生理是生物體可興奮組織電生理現(xiàn)象的基礎(chǔ)，如心肌的搏動、神經(jīng)的沖動等都是依賴于單個細(xì)胞的電生理特性的。依托于膜片鉗技術(shù)的電生理實(shí)驗(yàn)課程可以彌補(bǔ)學(xué)生在細(xì)胞電生理實(shí)驗(yàn)方面的不足，輔助其理解抽象的理論知識。因?yàn)槟てQ技術(shù)專業(yè)性強(qiáng)、操作復(fù)雜，樣品的前期準(zhǔn)備也耗時(shí)耗力，所以細(xì)胞電生理的實(shí)驗(yàn)課程不適合為理論知識和實(shí)驗(yàn)技能相對薄弱的本科生開設(shè)，而作為加強(qiáng)型課程為對此領(lǐng)域感興趣的研究生開設(shè)則有助于其提高實(shí)驗(yàn)技能、拓展知識面、增強(qiáng)創(chuàng)新能力。

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