提高放線菌次級代謝產物產量方法的研究進展

雷秀清 李力 黃建忠

（福建師范大學生命科學學院 工業(yè)微生物教育部工程研究中心 福建省現代發(fā)酵技術工程研究中心，福州 350108）

微生物能夠產生多種具有生物活性的天然次級代謝產物，已發(fā)現的大部分的活性天然次級代謝產物來自放線菌。放線菌次級代謝產物從結構上分為：β-內酰胺類、多肽類、糖肽類、核苷類及聚酮類化合物等［1-5］，這些物質具有抗細菌、抗真菌、抗腫瘤、殺蟲、免疫抑制劑和免疫激活劑等的功效，被廣泛地應用于醫(yī)藥業(yè)、農業(yè)、獸業(yè)、食品工業(yè)等領域［6］。其中，研究較多的是聚酮類化合物，主要包括大環(huán)內酯類、四環(huán)素類和多烯類等［7，8］。聚酮類化合物是聚酮合成酶（Polyketide synthase，PKS）催化形成的，其合成途徑與脂肪酸長鏈的合成相類似，催化合成聚酮相應化合物主體骨架結構的酶為聚酮合成酶［9］。根據聚酮合成酶的結構和作用模式的不同分為3 類：Ⅰ型 PKS，Ⅱ型 PKS 和Ⅲ型 PKS。Ⅰ型 PKS 又可分為模塊式和迭代式，模塊式即每個模塊的蛋白有不同的結構域，且結構域的激活位點只使用一次，主要參與細菌聚酮的合成，而迭代式即一個蛋白一個結構域，且這個結構域可以被重復使用，主要在真菌中［10］；Ⅱ型 PKS 是具有不同催化功能的酶復合體，重復催化多次反應來合成聚酮化合物，這類聚酮合酶主要在細菌類中［11］；Ⅲ型 PKS與前兩者不同的是不依賴ACP 直接利用酮基合成酶（ketosynthase，KS）催化泛酰輔酶A 之間的縮合，重復利用KS 催化合成一系列結構復雜的聚酮類化合物，主要在真菌中［12］。

伴隨著多耐藥性、強耐藥性病原菌的不斷出現，從自然界中分離到的菌株活性產物產量不高，不足以滿足實際需求。如何尋找新藥以及提高微生物次級代謝產物產量成為首要任務。傳統(tǒng)的“誘變-篩選”到更具目的性方向性的基因技術，第二代和第三代DNA 測序技術帶來的技術革新，成為解決上述問題的重要手段。已發(fā)表的菌株基因組序列分析結果顯示，基因組中存在大量沉默或者隱性的次級代謝產物生物合成基因簇，即這些基因簇在試驗條件下未得到表達或者表達量低［13，14］。通過基因技術改造菌株使低產菌株變高產，以及激活沉默的生物合成基因簇，為尋找新藥和提高次級代謝產物提供相應技術的參考。

本文結合目前提高次級代謝產物產量的方法、新抗生素的研究成果，尤其是聚酮化合物方面的研究，主要在調節(jié)基因及基因簇的表達、核糖體相關蛋白基因的突變和異源表達等3 個方面進行概述。

1 調節(jié)基因及基因簇的表達

在自然界中，一株放線菌往往產生多種抗生素，有的產物還存在多條分支代謝途徑，調節(jié)子存在多級層調控，多種代謝產物共同競爭同一種前體［15］。放線菌的次級代謝產物生物合成基因簇成簇串聯在一起，且絕大多數的基因簇轉錄水平受各種調節(jié)因子的控制，途徑特異性調節(jié)子的調節(jié)最為直接［16］。通過調控途徑特異性正調節(jié)子的過表達，負調節(jié)子的敲除，基因簇加倍表達提高次級代謝產物產量［10］。

1.1 過表達正調節(jié)子

納他霉素也叫匹馬霉素（Pimaricin），是由Streptomyces natalensis 合成的26 元環(huán)多烯大環(huán)內酯類抗生素，能抑制酵母和霉菌的生長，廣泛應用于食品業(yè)的防腐防霉，延長貨架期限［5］。Antón 等［17，18］發(fā)現合成Pimaricin 的基因簇中有兩個正調節(jié)子PimR 和PimM；Jang 等［19］構建pimM 和pimR 過表達突變株，發(fā)酵結果顯示，pimM 過表達的突變株在液體培養(yǎng)基中Pimaricin 產量為200 mg/L，野生型和pimR 過表達的突變株產量均為80 mg/L，說明pimM比pimR 對納他霉素的產量影響大。這可能是兩個調節(jié)子的調控級層的不同，pimR 調控pimM 的表達，而pimM 調控整個pimaricin 基因簇基因的表達［20］。Streptomyces ambofaciens 產生的次級代謝產物已知的有兩種：螺旋霉素（Spiramycin）［21］和紡錘菌素（Congocidine）［22］，利用生物信息學分析其染色體組結果發(fā)現，S. ambofaciens 染色體上存在許多隱性的可能合成次級代謝產物的生物合成基因簇，其中有個大型的Ⅰ型PKS 基因簇推測可能編碼一個目前最大的聚酮化合物［14］。Lusia 等［14］對該基因簇進行克隆并進行RT-PCR 分析，結果顯示該基因簇未得到轉錄表達。為激活該基因簇表達，過表達該基因簇內一個可能是轉錄激活子的調節(jié)基因sanmR0484，該基因編碼的蛋白與LAL（ Large ATP binding of the LuxR）家族相似。結果在發(fā)酵液中檢測到一類51 元環(huán)的糖基化大環(huán)內酯stambomycins A-D，生物活性測定顯示新的化合物Stambomycins 抗革蘭氏陽性菌不抗真菌及革蘭氏陰性菌，比較特別的是還具有抗人體腫瘤細胞繁殖的生物活性。

1.2 敲除負調節(jié)因子

基因敲除對合成次級代謝產物起到抑制作用的調節(jié)子，可以提高生物合成基因簇的轉錄與表達水平，最終目的產物產量得到提高。Streptomyces platensis MA7327 產平板霉素（Platensimycin）［23］和平板素（Platencin）［24］，兩抗生素產量都很低產量只有1-3 mg/L。平板霉素和平板素是可抑制細菌脂肪酸形成的一類新光譜抑菌抗生素，包括抑制耐甲氧西林金色葡萄球菌等革蘭氏陽性細菌［23］。在合成平板霉素和平板素的基因簇中發(fā)現ptmR1 基因編碼GntR 家族類似的轉錄抑制子，基因敲除ptmR1基因，產生的突變株S. platensis SB12001 platencin 產量為255±30 mg/L，突變株S. platensis SB12002 platensimycin 產量為323±29 mg/L。兩突變株產量都顯著提高，比野生型菌株產量高100 倍［25］。

1.3 過表達與基因敲除相結合

力達霉素C-1027 是Streptomyces globisporus C-1027 產生的一種新型抗腫瘤抗生素，有一個由聚酮合酶合成的烯二炔結構的九元環(huán)，在醫(yī)學臨床上C-1027 其抗腫瘤活性比阿霉素高，已進入臨床二期試驗［26］。C-1027 基因簇中發(fā)現4 個調節(jié)子：生物信息學分析SgcR3 與泰樂菌素正調控子TylR 的調控子類似；SgcR2 屬于AraC/XylS 轉錄激活子家族；SgcR1 與StrR 調節(jié)子類似，StrR 是轉錄激活子；SgcR 可能編碼DNA 結合蛋白，是負調節(jié)子。分別過表達sgcR3、sgcR2、sgcR1 正調節(jié)子基因，突變株C-1027 的產量都有顯著提高，野生型C-1027 產量為5.5 mg/L，其中過表達sgcR1 基因的突變株C-1027產量最高為19.6±2.2 mg/L［27］?；蚯贸齭gcR 突變株C-1027 產量高達17.4±1.6 mg/L，在敲除sgcR的突變株的基礎上過表達正調節(jié)因子基因sgcR1，C-1027 的產量進一步提高，比野生型高7 倍，達到37.5±7.7 mg/L［28］。

1.4 加倍基因簇

研究人員［29］在卡那霉素高產菌株的染色體組內發(fā)現多拷貝的卡那霉素生物合成基因簇，由此可見加倍次級代謝產物生物合成基因簇拷貝數亦可以提高產量。Murakami 等［30］構建一個含有ZouA（編碼TraA 型蛋白，負責接合轉移），RsA 和RsB（類似于oriT）定點重組系統(tǒng)，能將大片段的基因簇成串的整合到宿主染色體上并表達。以模式菌株S. coelicolor 的 放 線 紫 紅 素（Actinorhodin，ACT）基因簇ACT 為例用該重組系統(tǒng)增加ACT 拷貝數，S. coelicolor 突變株基因組分析發(fā)現，基因組中平均整合9 個拷貝數的ACT 基因簇，突變株的ACT 的產量為400 mg/L，野生型約為20 mg/L，突變株產量提高20 倍。尼可霉素（Nikkomycins）是核苷類抗生素，具有抗真菌、殺螨蟲等生物活性，對于人類和哺乳動物無毒性，被認為是較理想的一種抗生素。Liao等［31］利用Red/ET 整合技術使nikkomycin 完整基因簇在鏈霉菌Streptomyces ansochromogenes 的染色體組上加倍，發(fā)酵結果顯示nikkomycin X 和nikkomycin Z的產量都得到不同程度的提高，nikkomycin X 從220 mg/L 提高到880 mg/L，nikkomycin Z 從120 mg/L 提高到210 mg/L。氧四環(huán)素Oxytetracycline 是光譜抗菌抗生素，由Ⅱ型PKS 催化合成，最小PKS 負責合成19 碳單位長鏈。以Streptomyces nimosus M4018和工業(yè)菌株SR16 為例，為提高氧四環(huán)素產量，加倍兩原始菌株染色體上minimal PKS 拷貝數，突變株MR69 氧四環(huán)素的產量比M4018 增加51.2%，達369.9 mg/L；突變株SR903 與SR16 相比，氧四環(huán)素產量提高32.9 %，達到1 309.4 mg/L［32］。

2 核糖體相關蛋白基因的誘變

核糖體工程是用于發(fā)掘新產物、激活沉默基因簇表達的手段，即使核糖體相關蛋白（包括核糖體蛋白S12 或者RNA 聚合酶）發(fā)生基因突變賦予抗性，微生物基因轉錄和翻譯表達水平得到提高的技術［13，33］。通常突變發(fā)生在rpoB 基因（編碼RNA 聚合酶β 亞基）和rpsL 基因（編碼核糖體蛋白S12）上［33］。

2.1 rpoB基因突變

S. lividans 66 擁有完整的放線紫紅素（ACT）和靈菌紅素（Undecylprodigiosin，RED）基因簇，通常不產放線紫紅素和靈菌紅素。S. lividans 66 用利福平抗生素進行誘變，編碼RNA 聚合酶β 亞基的rpoB基因發(fā)生點突變，產生抗利福平的突變株合成ACT和RED［34］。rpoB 基因發(fā)生點突變后，RNA 聚合酶能模仿與ppGpp 結合的形式，增加與次級代謝產物啟動子區(qū)域親和力，激活次級代謝產物的合成［13］。

2.2 rpsL基因突變

新發(fā)現的一株S. lividans TK24 在正常情況下產大量的ACT，經基因分析發(fā)現S. lividans TK24 有鏈霉素（Str）抗性基因的突變，突變點發(fā)生在編碼核糖體蛋白S12 的rpsL 基因上（K88E），激活ACT 的合成［35］。S. coelicolor 的基因rpsL 發(fā)生突變，突變株K88E ACT 的產量增加［35］。在S. coelicolor A3（2）用積累濃度誘變中發(fā)現，突變株核糖體蛋白S12 有新的突變位點，在核糖體蛋白S12 92 位插入一個甘氨酸殘基，突變株GI92 賦于paromomycin（巴尤霉素）抗性，在三突變株SGR K88E 基礎上引入GI92 突變，顯著的提高了ACT 的產量（K88E OD640/450=0.8，K88E GI92 OD640/450=1.7）［36］。

2.3 累加突變

核糖體蛋白的突變不斷增加，可以提高抗生素產量。S. coelicolor 引入3 個藥物抗性突變SGR 逐步的提高了ACT 的產量［37］。Wang 等［38］在三突變株SGR 基礎上引入突變，其中發(fā)生7 個和8 個突變的突變株C7、C8 分別產ACT 0.51 g/L 和0.55 g/L，與野生型S. coelicolor 1147（ACT 產量5.8 mg/L）相比，產量分別提高88 和95 倍。在GYM33 培養(yǎng)基上培養(yǎng)，C7 和C8 分別產ACT 1.63 g/L 和1.22 g/L，與ACT 產量為9 mg/L 的野生型相比，產量分別提高180 倍和136 倍。

3 異源表達

隨著基因測序技術的不斷發(fā)展，基因組測序變得方便快捷。已發(fā)表的鏈霉菌基因組序列分析結果發(fā)現，每株菌不止產一種次級代謝產物，除了一些主要的抗生素基因簇有表達之外，還有許多沉默的基因簇未得到表達，或者轉錄水平低未被檢測到［33］。由于某些野生型本身性質的限制以及復雜的代謝網絡，中間產物復雜不穩(wěn)定或者終產物表達量低，限制了在體內研究抗生素合成途徑［39］。構建背景清晰的易操作的異源表達的宿主，有利于發(fā)掘與研究新抗生素。較為常用并容易進行基因操作的異源表達宿主有S. coelicolor、S. avermitilis、S. lividans 等［39-41］。

3.1 Streptomyces coelicolor

S. coelicolor 產多種抗生素其中4 種：由Type II PKS 合成的ACT，由非核糖體多肽合成酶（NRPS）和PKS 雜合作用合成的RED，由NRPS 合成的鈣依賴抗生素（Calcium-dependent antibiotic，CDA）和Type I PKS 合成的coelimycin（CPK）［42］。Gomez-Escribano 等［43］在Streptomyces coelicolor M145 基 礎 上刪除以上4 個大的基因簇，并對核糖體蛋白S12 以及RNA 聚合酶β 亞基進行定點突變，構建了系列異源表達宿主。來自S. venezuelae 的氯霉素（Chloramphenicol）生物合成基因簇和來自S. ambofaciens ATCC23877 的 紡 錘 菌 素（Congocidine） 生 物 合成基因簇及S. coelicolor M145 自身的放線紫紅素（Actinorhodin）生物合成基因簇分別在S. coelicolor系列改造宿主中表達。HPLC 檢測發(fā)酵產物，結果表明在含有一個rpoB 突變的S. coelicolor M1154 以及含有rpoB 和rpsL 雙突變的S. coelicolor M1152 宿主中表達的發(fā)酵產物色譜峰比較單一，背景清晰。還有研究人員［44］將S. coelicolor 的線性染色體的兩個臂、所有的PKS、NRPS 基因以及900 kb 的亞著絲粒端一起敲除，縮小基因組大小，構建一系列突變宿主。ACT 基因簇導入不同突變宿主中表達，篩選能表達ACT 且產量有提高的異源表達宿主突變株。只有幾株突變株能表達ACT，其中突變株ZM10ACT，ZM11ACT 產量比野生型M145T 高，在OD640下檢測放線紫紅素產量，M145T ACT 的OD640值為0.07，ZM10ACT ACT 的OD640值 為0.3，ZM11ACT ACT 的OD640值為0.15。

3.2 Streptomyces avermitilis

Streptomyces avermitilis 是可高效表達阿維菌素的工業(yè)菌株。Komatsu 等［45］為了讓S. avermitilis廣泛應用于表達其他不同結構類型次級產物基因簇，對S. avermitilis 基因組進行縮小。將超過1.4 Mb 的內源基因通過同源重組逐步地從S. avermitilis 9.02 Mb 的線性染色體中敲除，產生不同基因缺失突變株。Komatsu 選擇不同結構類型的生物合成基因簇驗證S. avermitilis 突變株異源表達效果。S. avermitilis 野生型基因組中不含有氨基糖苷類抗生素的合成基因簇，Komatsu 等［45］將氨基糖苷類抗生素鏈霉素（Streptomycin）生物合成基因簇與整合質粒pKU465cos 連接形成質粒pSM1，pSM1 導入S. avermitilis 野生型及缺失最大片段的突變株SUKA4及SUKA5 中表達，突變株SUKA5（pSM1）的鏈霉素產量為200 μg/mL，比S. avermitilis（pSM1）（<100 μg/mL）及產鏈霉素的野生型S. griseus IFO13350（<50 μg/mL）高。S. avermitilis 基因組中至少有8 個不同的NRPS 生物合成基因簇，但產物中未檢測到任何的多肽衍生物。Komatsu 等［45］選擇由S. clavuligerus合成的β 內酰胺類抗生素頭霉素（Cephamycin C）的生物合成基因簇在S. avermitilis 突變株中異源表達驗證，S. avermitilis 的突變株可以利用NRPS 合成多肽化合物。結果接合子SUKA17（pCEF2）在SA 培養(yǎng)基上合成Cephamycin C，但產量比S. clavuligerus低。替換培養(yǎng)基并過表達ccaR 基因（負責激活Cephamycin C 生物合成基因簇表達），突變株Cephamycin C 的產量達130 μg/mL，比野生型S. clavuligerus（50 μg/mL）高。S. avermitilis 能合成工業(yè)水平的聚酮化合物，Komatsu 等［45］選擇S. platensis Mer-11107 合成的大環(huán)內酯pladienolide 抗生素基因簇在S. avermitilis 突變株中表達。結果突變株SUKA5不表達pladienolide，過表達pladienolide 的轉錄激活子pldR 后，突變株合成pladienolide。結果表明，合成聚酮類化合物有時還需要結合調節(jié)因子的表達。S. avermitilis 由于缺乏單萜環(huán)化酶且操縱子被IS 插入失活或者刪除，適合表達外源單萜類基因。Komatsu 等［46］將單萜環(huán)化酶基因與甲基轉移酶基因克隆后拼接一起插入到啟動子rpsJ（在S. avermitilis中具有強轉錄活性的啟動子）下游，通過接合轉移到突變株SUKA16 中表達，突變株合成三倍萜2-methylisoborneol（2-MIB，2-甲基異莰醇）。試驗證明S. avermitilis 突變株可以表達不同類型的次級代謝產物，包括氨基糖苷類、非核糖體多肽類、聚酮類和萜類化合物。

3.3 Streptomyces lividans

殺稻瘟菌素（blasticidin S）是具有強抑制真菌活性的肽核苷類抗生素，由于殺稻瘟菌素產生菌S. griseochromogenes 的遺傳操作難以進行，無法研究殺稻瘟菌素體內的生物合成。Li 等［39］將包含有殺稻瘟菌素基因簇（bls）嫁接到Streptomyces lividans HXY16 的染色體上表達，發(fā)酵結果，突變株S. lividans LL2 沒有產生殺稻瘟菌素而產生去氨基羥化殺稻瘟菌素（Deaminohydroxymildiomycin，OHBS）。生物信息學分析發(fā)現，S. lividans 本身存在殺稻瘟菌素脫氨酶（SLBSD），基因敲除S. lividans LL2 中SLBSD 產生突變株S. lividans WJ2 能夠合成完整的殺稻瘟菌素，并可對殺稻瘟菌素生物合成基因簇關鍵基因進行體內功能研究。與殺稻瘟菌素有相似性結構的肽核苷類抗生素米多霉素（Mildiomycin）具有強抑制植物白粉病的生物活性。在發(fā)酵液中發(fā)現Streptoverticillium rimofaciens ZJU5119 除產米多霉素外還產3 種衍生物［2］，在產生菌Streptoverticillium rimofaciens ZJU5119 中做敲除試驗不利于分析米多霉素合成途徑。為研究米多霉素的合成途徑，Li 等［47］構建Streptoverticillium rimofaciens ZJU5119 基因組文庫，利用殺稻瘟菌素胞嘧啶核苷單磷酸水解酶基因blsM 設計兼并引物，篩選到6 個cosmid。6 個cosmid 在Streptomyces lividans 1326 中異源表達，其中cosmid 14A6 在Streptomyces lividans 1326 中異源表達合成米多霉素，即cosmid 14A6 包含合成米多霉素所必須的完整基因簇［48］。結合異源表達及體外研究確定米多霉素基因簇邊界，并研究milA、milB 及milC 的功能，推測整個米多霉素的合成途徑［47，48］。信息學分析結合敲除實驗確定了參與米多霉素生物合成的基因，其中milO 基因編碼LuxR 家族轉錄因子可能是途徑特異性調節(jié)因子，milK 基因編碼Major Facilitator Superfamily（MFS）。MilO、milK 可能是正調節(jié)子基因，過表達這兩個基因可能提高米多霉素的產量［49］。

4 小結

放線菌的次級代謝產物具有重要的藥用價值，聚酮化合物的多種生物活性及合成規(guī)律性，使其具有巨大的潛在的藥物開發(fā)及商業(yè)價值?，F今抗藥性病原菌的增加，新型細菌病毒的不斷出現，提高抗生素產量和尋找新藥是人們在藥物開發(fā)過程中的長期目標。利用基因技術改變生物合成途徑，在轉錄和翻譯水平上調節(jié)基因簇的轉錄表達，核糖體相關蛋白的定點突變與隨機突變相結合，構建異源表達宿主及外源基因簇的表達等方法提高目的產物產量。異源表達以及關鍵基因的調節(jié)等方法的研究為組合生物學奠定基礎，通過組合生物學合成一些非天然次級代謝產物，利用基因技術改造聚酮化合物的基因簇以產生更多不同的活性化合物，組合生物學為新藥的研發(fā)提供豐富的資源［50］。

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