北方白菜型冬油菜F2主要生理生化特性的變異與抗寒性相關分析

孔德晶，王月，孫萬倉＊，曾秀存，2，方彥，魯美宏，楊寧寧

（1.甘肅省干旱生境作物學重點實驗室，甘肅 蘭州730070；2.河西學院，甘肅 張掖734000；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學測試研究中心，甘肅 蘭州730070）

白菜型油菜（Brassicarapa）是蕓薹屬6個栽培物種之一，也是世界上廣泛栽培的3大類型油菜之一，其栽培歷史悠久，不僅是重要的油料作物，而且是極其重要的蔬菜作物［1－3］。目前，我國油菜的栽培面積約700萬hm2，其中，白菜型油菜面積15%左右［4］。中國是世界公認的白菜型油菜起源地之一［2］，具有包括農(nóng)家品種和推廣栽培品種在內(nèi)的豐富資源，它們在我國各地具有悠久的栽培歷史。其中，白菜型冬油菜具有耐遲播、生育期短，耐貧瘠、抗寒性強的突出優(yōu)點。在長期的自然和栽培條件的選擇下，白菜型冬油菜表現(xiàn)出較好的抗寒性和適應性，具有甘藍型油菜和芥菜型油菜所不可替代的作用。近年來，由于較好地解決了品種的抗寒問題［5－6］，白菜型冬油菜已經(jīng)成功引入甘肅河西走廊、新疆阿勒泰、塔城、烏魯木齊、青海、寧夏、北京等地，擴大了冬油菜在我國的種植范圍，使種植區(qū)域向北推進緯度約13°，海拔提高到2300m左右，取得了顯著經(jīng)濟效益、生態(tài)效益與社會效益［7－11］。由于白菜型冬油菜可以有效的減少我國北方春季沙塵源，保護環(huán)境，同時對改革北方傳統(tǒng)的一年一熟種植制度為兩年三熟制或一年兩熟制，提高復種指數(shù)，增加單位土地面積經(jīng)濟效益具有重要意義。北方冬油菜研究愈來愈引起人們的廣泛關注［10，12］。

目前，對白菜型冬油菜抗寒性的研究主要集中在冬油菜品種的適應性［8］、生長發(fā)育特性［13］、產(chǎn)量及經(jīng)濟特性方面［14－15］、相關抗寒基因克隆及表達分析［16－17］，如孫萬倉等［5］對不同冬油菜類型在西北地區(qū)的越冬性等進行了分析比較，認為不同白菜型冬油菜品種（系）抗寒性存在巨大差異；魏文慧等［14］對冬油菜的越冬率、產(chǎn)量及經(jīng)濟性狀的影響進行了分析研究；張騰國等［17］從油菜中克隆了抗寒基因BnICE1，并分析了其在油菜適應低溫脅迫中發(fā)揮的重要作用。此外也有對構(gòu)建白菜型油菜連鎖圖譜［18－19］和白菜型油菜幼苗絨霉病的基因定位研究，如Su和Graham［18］利用分子標記技術(shù)對白菜型油菜連鎖圖譜的構(gòu)建，為白菜型油菜基因序列和遺傳信息的研究提供依據(jù)；Yu和Zhang［20］利用分子標記技術(shù)對白菜型油菜幼苗絨霉病進行QTL定位的研究。而目前對白菜型冬油菜F2群體生理生化的變異與抗寒性相關分析及抗寒性遺傳的研究鮮見報道。研究表明，植物的抗寒性狀常是由微效多基因或由具有加性效應的主基因與微效基因所控制［21－22］的，表現(xiàn)為數(shù)量性狀，蓋鈞鎰等［23］提出了針對植物數(shù)量性狀分析的一整套方法，被廣泛應用于植物各類數(shù)量性狀，包括產(chǎn)量［24］、品質(zhì)［25］、抗病蟲性［26－27］和耐逆性［28－30］等的遺傳分析，確定控制目標性狀主基因的數(shù)目及它們的基因效應，為植物目標性狀的遺傳改良提供了指導。本研究對103株F2代白菜型冬油菜抗寒性相關的8個生理生化指標的變異進行了統(tǒng)計與測定，分析各指標在群體中的遺傳變異及分布情況，以期為白菜型冬油菜的抗寒性遺傳研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及試驗區(qū)自然概況

供試品種為白菜型冬油菜，利用親本隴油7號、隴油9號雜交配制F1代，以及F1代自交得到的103株F2代個體為材料。母本隴油7號抗寒性超強，為國內(nèi)外最優(yōu)抗寒品種，父本隴油9號抗寒性較弱。試驗設于甘肅農(nóng)業(yè)大學試驗基地甘肅省蘭州沙井驛試驗田，2012年8月，將親本、F1代和F2代分別種植于4個小區(qū)，小區(qū)長為2.5 m，寬1.4m，小區(qū)面積3.5m2，每小區(qū)8行，小區(qū)間距為40cm。試驗地前茬為小麥（Triticumaestivum），施農(nóng)家肥60000kg/hm2、磷酸二銨300kg/hm2。田間管理按大田常規(guī)生產(chǎn)進行。

1.2 生理生化指標的測定

在2012年11月，在親本和F1代種植小區(qū)內(nèi)，各處理隨機取樣10株，對F2代單株定株、取樣，各取樣植株進行生理生化指標測定，設3次重復。超氧化物歧化酶（SOD）活性的測定采用氮藍四唑（NBT）光還原法［31］，過氧化物酶（POD）活性測定采用愈創(chuàng)木酚比色法［32］，過氧化氫酶（CAT）活性測定采用紫外吸收法［31］，丙二醛含量測定采用硫代巴比妥酸（TBA）顯色法［32］，游離脯氨酸含量測定采用甲苯萃取法［31］，可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍 G－250 法［31］。

1.3 幼苗習性調(diào)查與越冬率的統(tǒng)計

對幼苗生長習性進行目測評定，1級（匍匐型）：葉片全部匍匐在地面；2級（半匍匐型）：葉片的葉尖著地面，而葉身還是離開地面；3級（半直立型）：葉片全部離開地面，但沒完全直立；4級（直立型）：葉片全部直立。

調(diào)查各處理小區(qū)越冬前苗數(shù)，返青期苗數(shù)，計算各處理越冬率（返青期苗數(shù)與越冬前苗數(shù)的百分比）。另外，對103株F2群體進行單株定株，存活植株記為1，死亡植株記為0。

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析

利用Microsoft Office Excel 2010對數(shù)據(jù)進行處理并作圖；利用SPSS軟件［33］對數(shù)據(jù)進行方差分析，全子集回歸分析，相關分析，通徑分析；利用DPS 3.01對數(shù)據(jù)進行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 F2群體主要生理生化特性的分離分析

由親本（P1、P2）的主要生理生化特性的表現(xiàn)（表1）看出，兩親本之間8個指標均達極顯著差異，除隴油7號（P1）的MDA含量小于隴油9號（P2）外，其余指標值均表現(xiàn)為P1大于P2。親本隴油7號和隴油9號的SOD活性分別為318.49和240.57U/mg，F(xiàn)2群體SOD活性出現(xiàn)較大變異，在40.37～325.34，平均為254.35U/mg。F2群體的POD活性變異范圍在18.35～187.55U/g，介于雙親之間，平均為63.70U/g。F2群體的平均CAT活性為8.73U/g，高于雙親值，變異范圍為1.30～27.05U/g。F2群體的平均 MDA含量為23.22μmol/g，介于雙親之間，變異范圍在9.98～48.36μmol/g。游離脯氨酸含量在雙親之間存在極顯著差異，而且在F2群體中變化也較大，為95.94～906.01μg/g。兩親本的可溶性蛋白含量相差約3.5mg/g，F(xiàn)2群體的可溶性蛋白含量平均值介于雙親之間，平均值為14.68mg/g，變異范圍在8.08～21.90mg/g。越冬率統(tǒng)計結(jié)果P1為95.2%，P2為45.8%，F(xiàn)2群體的越冬率為66.1%。隴油7號（P1）幼苗生長習性為匍匐性或半匍匐性，隴油9號（P2）的幼苗習性主要表現(xiàn)為直立型或半直立型，而在F2群體中出現(xiàn)了性狀分離，變異范圍在1～4級。

表1 親本和F2群體的主要生理指標表現(xiàn)及分布Table 1 Performance and distributions of physiological indicators in the F2population and its parents

2.2 F2群體主要生理生化特性的分布

如圖1所示，以各生理指標分布范圍為橫坐標，頻率為縱坐標，以F2群體同一指標的次數(shù)分布進行作圖，可以看出，F(xiàn)2群體間存在著較大的遺傳差異，各生理指標的測定值均呈不同程度的連續(xù)分布，它們的偏度和峰度見表1，除SOD活性的偏度外都小于1，分布頻率大致接近正態(tài)分布，且存在明顯的雙向超親分離。大多數(shù)指標在F2群體中的平均值介于雙親之間，只有CAT活性和游離脯氨酸含量在F2群體中的平均值超過雙親。

圖1 F2群體相關指標的次數(shù)分布Fig.1 Frequency distribution of related indicators for F2population

2.3 F2群體的聚類分析

利用DPS對各個性狀值進行標準化轉(zhuǎn)換后，計算歐氏遺傳距離，進行 UPGMA 聚類分析（圖2）。從圖中可以看出，在聚類距離約為4.78處，F(xiàn)2群體分為3個類群，其中第1亞群包括38個F2個體，第2亞群包含64個F2個體，第3亞群包含1個F2個體，在聚類距離為3.58處，F(xiàn)2群體分為8個類群，其中第1亞群包括29個F2個體，第2亞群包含9個F2個體，第3亞群包含56個F2個體，第4亞群包含1個F2個體，第5亞群包含2個F2個體，第6亞群包含4個F2個體，第7亞群包含1個F2個體，第8亞群包含1個F2個體。

圖2 F2群體的聚類分析Fig.2 Dendrogram of F2population

2.4 F2單株的主要生理生化特性與抗寒性相關分析

本研究中，白菜型冬油菜F2群體的各個指標間不是相互獨立的，而是存在著一定的相關關系（表2）。從表中可以看出，越冬率與SOD活性、POD活性、CAT活性、游離脯氨酸含量和可溶性蛋白含量呈顯著或極顯著正相關，相關系數(shù)分別為0.512，0.472，0.444，0.550，0.250；與幼苗習性和 MDA 含量呈極顯著負相關，其相關系數(shù)為－0.863和－0.562，說明白菜型冬油菜在低溫脅迫下通過增加SOD活性、POD活性、CAT活性、游離脯氨酸含量和可溶性蛋白含量，降低MDA含量，提高抗寒性。由表2還可以看出，白菜型冬油菜所有指標與越冬率的相關系數(shù)均達到顯著或極顯著水平，說明幼苗習性，SOD活性，POD活性，CAT活性，MDA含量，游離脯氨酸含量和可溶性蛋白含量在一定程度上均可作為白菜型冬油菜單一指標進行抗寒性鑒定［34］。

2.5 F2群體主要生理生化特性的回歸分析

對幼苗習性，SOD活性，POD活性，CAT活性，MDA含量，游離脯氨酸含量，可溶性蛋白含量等7個性狀，通過SAS用全子集法計算所有可能的回歸［35］，經(jīng)過共線性診斷后挑出最好的回歸結(jié)果。Y＝0.899－0.299X1＋0.001X2＋0.001X3＋0.015X4－0.01X5＋0.014X6。其中Y為越冬率，X1為幼苗習性，X2為SOD活性，X3為POD活性，X4為CAT活性，X5為MDA含量，X6為可溶性蛋白含量。其中，X1，X5對Y的偏回歸系數(shù)分別為－0.299，－0.01，與越冬率呈負相關，該方程R＝0.912＊＊。

2.6 F2群體主要生理生化特性的通徑分析

2.6.1 主要生理生化指標的直接通徑關系 表3為7個指標對越冬率影響的通徑系數(shù)，從表中可以看到各指標對越冬率的直接通徑系數(shù)從大到小分別為：－0.689，0.304，－0.293，0.218，0.176，0.138，0.115（正號是指促進作用，負號是指抑制作用）。由此可以看出，幼苗習性和SOD活性對越冬率的直接影響較大，CAT活性和可溶性蛋白含量對越冬率的直接影響較小。

2.6.2 主要生理生化指標的間接通徑關系 從表3中可以看出，各指標對越冬率的總間接通徑系數(shù)分別為：－0.1706，0.2070，0.2960，0.3052，－0.2685，0.3319，0.1347。通過與直接通徑系數(shù)相比較，可以看出，幼苗習性對越冬率的相關系數(shù)為r＝－0.863，直接通徑系數(shù)為－0.689，可見，幼苗習性對越冬率主要是通過直接影響起作用，而通過其他指標的間接影響較小。CAT活性與越冬率的相關系數(shù)為r＝0.444，間接通徑系數(shù)為0.3052，可以看出，CAT活性對越冬率的影響主要是通過間接影響起作用的。其余各指標對越冬率的影響均是通過直接和間接影響共同起作用的，其中，SOD活性通過POD活性對越冬率的間接影響較大，間接通徑系數(shù)分別為0.0630；POD活性通過SOD活性對越冬率的間接影響較大，間接通徑系數(shù)為0.1088；MDA含量通過游離脯氨酸含量對越冬率的間接影響最大，間接通徑系數(shù)為－0.0983；脯氨酸含量通過MDA含量對越冬率的間接影響最大，間接通徑系數(shù)為0.1321；可溶性蛋白含量通過SOD活性和游離脯氨酸含量對越冬率的間接影響最大，間接通徑系數(shù)分別為0.0608和0.0606。

表2 越冬率與相關指標在F2群體中的相關分析Table 2 Correlation analysis among overwintering rates and related indicators in the F2population

表3 各指標對越冬率的通徑分析Table 3 Path analysis of overwintering rates and its indicators

3 討論

本文對103份冬油菜F2群體的SOD活性、POD活性和CAT活性等指標進行分析，系統(tǒng)地評價了各指標在群體中的表現(xiàn)。試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)2群體的6個指標均呈不同程度連續(xù)變異，分布頻率大致接近正態(tài)分布（圖1），表現(xiàn)出數(shù)量性狀遺傳的特點。聚類分析中，在聚類距離為4.78處，F(xiàn)2群體分為3個類群，第1亞群是未能安全越冬植株，第2亞群和第3亞群為基本可以安全越冬植株，比例約為1∶2，與F2群體越冬情況的田間統(tǒng)計值較一致；在聚類距離為3.58處，F(xiàn)2群體分為8個類群，以聚類結(jié)果來看，F(xiàn)2群體間存在著較大的遺傳差異，例如在第2亞群中，此亞群包含9個F2個體，該亞群的性狀中包含的幼苗習性表現(xiàn)為直立型，SOD活性、POD活性、CAT活性和游離脯氨酸含量等4個指標接近最小值，MDA含量接近最大值；在第8亞群中，此亞群只包含1個F2個體，但該亞群的性狀中包含的幼苗習性表現(xiàn)為匍匐型，另有SOD活性、POD活性、CAT活性和游離脯氨酸含量等4個指標接近最大值，MDA含量接近最小值。

在本研究中，通過對白菜型冬油菜F2群體的供試指標間進行相關分析，發(fā)現(xiàn)各性狀間不是相互獨立的，而是存在著一定的相關關系。結(jié)果分析表明，白菜型冬油菜F2群體的越冬率與幼苗習性、MDA含量間呈極顯著負相關，與SOD活性、POD活性、CAT活性、游離脯氨酸含量、可溶性蛋白含量呈極顯著或顯著性正相關，可見，幼苗越匍匐，低溫逆境下MDA積累少，膜質(zhì)過氧化程度小，冬油菜的越冬情況越好；反之，幼苗越直立，MDA含量較高，低溫逆境下MDA積累多，膜質(zhì)過氧化程度大，越冬情況越差，與此同時，植株通過增加SOD活性、POD活性、CAT活性以及低溫逆境下積累游離脯氨酸含量和可溶性蛋白的含量增強其抗寒性。這與之前的研究結(jié)果較一致［8，36－44］。

通徑系數(shù)就是標準化的偏回歸系數(shù)，表示變數(shù)間的直接關系。從所得通徑系數(shù)的大小可以知道自變數(shù)對依變數(shù)作用的大小，通過對白菜型冬油菜F2群體各指標的通徑分析，發(fā)現(xiàn)各生理生化指標對越冬率的相關系數(shù)與直接通徑系數(shù)方向一致，但通徑系數(shù)更能體現(xiàn)其本質(zhì)，因此得出各指標對白菜型冬油菜越冬率相對重要性從大到小的順序是：幼苗習性，SOD活性，MDA含量，游離脯氨酸含量，POD活性，CAT活性，可溶性蛋白含量；除直接通徑系數(shù)外的通徑系數(shù)為間接通徑系數(shù)，它反映的是某一性狀對越冬率的影響是通過對其他組分的影響而間接影響到越冬率的，幼苗習性對越冬率主要是通過直接影響起作用，影響率達79.8%，CAT活性對越冬率的影響主要是通過間接影響起作用的，間接影響率達68.7%，而其余各指標對越冬率的影響均是通過直接和間接影響共同起作用的。通徑分析更直觀、具體的解釋了各生理生化特性之間的相互關系。

Zhu等［45］認為性狀間顯著相關暗示相應性狀的部分QTL間可能存在連鎖或一因多效。所以對上述生理生化指標進行相關分析可以進一步了解指標間的相互關系，從而為今后的白菜型冬油菜抗寒性遺傳分析提供科學依據(jù)。

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