紫色色桿菌苯丙氨酸羥化酶的異源表達(dá)及重組酶學(xué)性質(zhì)研究

曹淑慧 周麗 崔文璟 劉中美 周哲敏

（江南大學(xué)生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無(wú)錫 214122）

紫色色桿菌苯丙氨酸羥化酶的異源表達(dá)及重組酶學(xué)性質(zhì)研究

曹淑慧 周麗 崔文璟 劉中美 周哲敏

（江南大學(xué)生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無(wú)錫 214122）

來(lái)源于紫色色桿菌（Chromobacterium violaceum）的苯丙氨酸羥化酶結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，性質(zhì)更接近于人的苯丙氨酸羥化酶，具有潛在的醫(yī)藥應(yīng)用價(jià)值。從紫色色桿菌基因組中克隆得到苯丙氨酸羥化酶基因pah。構(gòu)建重組表達(dá)載體pET24a-pah，并在Escherichia coliBL21（DE3）中實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)。離子層析純化后，重組蛋白比酶活高達(dá)503.2 U/mg。酶學(xué)性質(zhì)研究顯示，該重組酶的最適溫度為40℃左右，50℃時(shí)PAH的半衰期為15 min；最適pH在7.5左右，在pH6-8范圍內(nèi)較穩(wěn)定。37℃，pH7.5條件下，Km值為1.5 mmol/L，Vmax為0.5 mmol/min，kcat為5.05/s，催化效率kcat/Km為3.37 L/mmol·s。

苯丙氨酸羥化酶 紫色色桿菌 表達(dá) 純化 酶學(xué)性質(zhì)

苯丙氨酸作為一種必需氨基酸主要從食物中攝取，而人體內(nèi)75%以上的苯丙氨酸代謝是靠苯丙氨酸羥化酶（Phenylalanine Hydroxylase，PAH，EC1.14.16.1）來(lái)完成的。哺乳動(dòng)物體內(nèi)的苯丙氨酸羥化酶主要存在于肝臟中［4］，若肝臟內(nèi)的苯丙氨酸羥化酶表達(dá)異常就會(huì)造成苯丙氨酸代謝紊亂，從而引起苯丙酮尿癥（PKU）的發(fā)生。目前，對(duì)于PKU的治療主要通過(guò)控制飲食中苯丙氨酸的攝入量來(lái)減緩癥狀。但苯丙氨酸本身作為人體必需氨基酸之一是不可或缺的，長(zhǎng)期的飲食限制可能增加飲食治療后期并發(fā)癥出現(xiàn)的危險(xiǎn)，如骨質(zhì)疏松、微量元素缺失。因此，如能將苯丙氨酸羥化酶通過(guò)口服或注射的方式輸送到體內(nèi)發(fā)揮作用就可以有效治療由于苯丙氨酸羥化酶異常而引起的PKU。Yew等［14］通過(guò)將治療分子封裝到紅細(xì)胞的臨床手段構(gòu)建PAH-RBCs，成功實(shí)現(xiàn)活性酶在血液中代謝苯丙氨酸。與直接靜脈注射PAH酶相比，PAH-紅細(xì)胞被消融時(shí)間顯著延長(zhǎng)。同時(shí)小鼠試驗(yàn)證實(shí)，PAH-RBCs的注入能使小鼠體內(nèi)的苯丙氨酸下降80%。這為研究苯丙酮尿癥的治療方法指明了方向，同時(shí)也為該疾病的患者帶來(lái)新的福音。

苯丙氨酸羥化酶是一種非血紅素鐵單加氧酶［1］。該酶與酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase）、色氨酸羥化酶（tryptophan hydroxylase）同為芳香族氨基酸羥化酶（Aromatic amino acid hydroxylases，AAAHs）家族的成員，它們均能利用分子氧和來(lái)源于四氫生物蝶呤的電子對(duì)相應(yīng)的芳香族氨基酸底物進(jìn)行羥基化［3］。在苯丙氨酸羥化酶催化過(guò)程中，苯丙氨酸利用一分子氧和一分子四氫生物蝶呤，在PAH的催化下生成產(chǎn)物酪氨酸和一分子水，四氫生物蝶呤轉(zhuǎn)化為二氫生物蝶呤（圖1）。此外，鐵離子是該反應(yīng)的一種非必須的輔助因子。當(dāng)亞鐵離子不存在時(shí)，四氫生物蝶呤與氧氣作用的產(chǎn)物過(guò)氧化氫就會(huì)積累，嚴(yán)重影響酶活，可通過(guò)添加過(guò)氧化氫酶來(lái)去除這種影響。當(dāng)亞鐵離子存在時(shí)，就會(huì)通過(guò)形成高價(jià)鐵（Ⅳ）的形式留住一個(gè)氧分子，使過(guò)氧化氫不再產(chǎn)生，從而保障催化過(guò)程的順利進(jìn)行［6］。而高鐵離子在最終將其攜帶的一個(gè)氧分子通過(guò)羥基的形式置換給苯丙氨酸使其變成產(chǎn)物酪氨酸，自身還原回亞鐵離子的形式?，F(xiàn)有PAH酶活測(cè)定體系添加了上述所有的輔助因子以及過(guò)氧化氫酶，使得該反應(yīng)過(guò)程復(fù)雜，而精簡(jiǎn)反應(yīng)體系，可便于其后續(xù)研究和應(yīng)用。

苯丙氨酸羥化酶廣泛存在于植物、動(dòng)物和微生物中。紫色色桿菌苯丙氨酸羥化酶（CvPAH）結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，空間構(gòu)象與人類苯丙氨酸羥化酶催化區(qū)域幾乎完全一樣，并且空間結(jié)構(gòu)比人苯丙氨酸羥化酶更為松散，利于底物分子與活性中心的結(jié)合，同時(shí)熱穩(wěn)定性更好［5］，所以應(yīng)用前景更為廣闊。雖然早在1978年，Nakata等［10］就從紫色色桿菌中分離純化出苯丙氨酸羥化酶，但只測(cè)得其沉降系數(shù)、斯托克斯半徑、摩擦比、等電點(diǎn)等一些物理參數(shù)。Onishi等［12］通過(guò)抗原抗體相互作用的原理分離得到重組的CvPAH，純化過(guò)程復(fù)雜，蛋白損失較高，不能滿足其應(yīng)用需求。同時(shí)，目前尚無(wú)系統(tǒng)性的CvPAH酶學(xué)性質(zhì)方面研究的報(bào)道，該酶的測(cè)定過(guò)程也相對(duì)復(fù)雜。

由于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)開(kāi)發(fā)成熟、表達(dá)量高、效果穩(wěn)定、表達(dá)產(chǎn)物分離純化相對(duì)簡(jiǎn)單、是原核生物來(lái)源基因表達(dá)的首選宿主，本研究將來(lái)源于紫色色桿菌的苯丙氨酸羥化酶在大腸桿菌中進(jìn)行高效表達(dá)，對(duì)重組酶進(jìn)行分離純化，高效制備該酶，并測(cè)定其酶學(xué)性質(zhì)和酶學(xué)常數(shù)，優(yōu)化酶反應(yīng)體系，旨在為后續(xù)研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 紫色色桿菌（Chromobacterium violaceum）購(gòu)自Sigma（ATCC12540）（國(guó)藥代理）公司。宿主菌Escherichia coliBL21（DE3）、克隆載體pUC19、表達(dá)載體pET-24a（+）為Novagen公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要試劑與儀器 DNA聚合酶、各種限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶等均購(gòu)自日本寶生物工程（大連）有限公司，基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒和 PCR 產(chǎn)物純化試劑盒均購(gòu)自上海生物工程公司。AKTAXPRESS蛋白純化系統(tǒng)（通用電氣醫(yī)療器械集團(tuán)）；DEAE，通用電氣（中國(guó)）醫(yī)療器械集團(tuán)。

1.1.3 培養(yǎng)基 2YT培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨16，酵母提取物10，氯化鈉5。營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10，牛肉膏3，氯化鈉5。

1.2 方法

1.2.1 紫色色桿菌基因組DNA的提取 將紫色色桿菌接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，26℃、150 r/min培養(yǎng) 25h 后收集菌體，用試劑盒（上海生工生物工程公司的EZ-10 spin column Genomic DNA Isolation Kit）提取基因組 DNA。

1.2.2pah基因的克隆

1.2.2.1 引 物 設(shè) 計(jì) 根 據(jù)GenBank提 供 的C. violaceum苯丙氨酸羥化酶基因序列（GeneID：AF146711）設(shè)計(jì)引物。用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，并在其上下游引入酶切位點(diǎn)BamHⅠ和Hind Ⅲ（下劃線部分所示）：Forward primer：5'-CGGGATCCATGAACGACCGCGCCGACTTTGTGG-3'；Reverse primer：5'-CCAAGCTTTCAGACGTCTTCGGTATC-3'。

1.2.2.2pah基因的擴(kuò)增和克隆 PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性10 min；94℃變性1 min，56℃退火35 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min。純化后的PCR產(chǎn)物經(jīng)BamHⅠ和Hind Ⅲ雙酶切后連接到用同樣限制性內(nèi)切酶酶切的質(zhì)粒載體pUC19上，轉(zhuǎn)化E. coliJM109感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落提質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證獲得陽(yáng)性克隆，并經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.3 PAH表達(dá)載體的構(gòu)建 pUC19-PAH和pET-24a（+）通過(guò)BamHⅠ與Hind Ⅲ雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，回收目的片段，16℃連接過(guò)夜后轉(zhuǎn)化E. coliJM109感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)酶切驗(yàn)證，最終得到表達(dá)載體pET24a-pah。

1.2.4 PAH重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將重組質(zhì)粒pET24a-pah轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞E. coliBL21（DE3），獲得PAH表達(dá)型重組大腸桿菌 BL21/pET24a-pah。挑取 BL21/pET24a-pah平板單菌落，接種于5 mL含100 μg/mL卡那霉素的2YT培養(yǎng)基，37℃、200 r/min過(guò)夜培養(yǎng)。取1 mL 上述過(guò)夜培養(yǎng)菌液接種于100 mL含100 μg/mL卡那霉素的2YT培養(yǎng)基，37℃、200 r/min培養(yǎng)至菌液 OD600=0.6，加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。1.2.4.1 IPTG誘導(dǎo)濃度優(yōu)化 接菌至5 mL含100 μg/mL卡那霉素的2YT培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600=0.6，加入IPTG濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.6和0.8 mmol/L，24℃誘導(dǎo)24 h。

1.2.4.2 誘導(dǎo)時(shí)間優(yōu)化 接菌至5 mL含100 μg/mL卡那霉素的2YT培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600=0.6，加入0.6 mmol/L IPTG，24℃誘導(dǎo)6、12、18、24、30和36 h。

1.2.4.3 最佳誘導(dǎo)溫度 最佳誘導(dǎo)溫度測(cè)定：接菌至5 mL含100 μg/mL卡那霉素的2YT培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600=0.6，加入0.6 mmol/L IPTG，分別在12℃、18℃、24℃、30℃和36℃下誘導(dǎo)24 h。

1.2.5 離子層析純化 離心收集菌體，重懸于20 mmol/L Tris-HCl中，冰浴超聲破碎，離心收集上清用0.45 μm濾膜過(guò)濾。用HisTrap DEAE FF column 1 mL（GE公司）于AKTA AVANT層析系統(tǒng)中純化上清中的重組蛋白［6］。

1.2.6 PAH重組酶的酶學(xué)性質(zhì)分析 反應(yīng)所得產(chǎn)物L(fēng)-Tyr用 HPLC進(jìn)行檢測(cè)。色譜柱為L(zhǎng)a Chrom C18（5 μm，4.6×250 mm）；流動(dòng)相為 10%（V/V）甲醇水溶液，洗脫10 min。熒光檢測(cè)激發(fā)波波長(zhǎng)為265 nm，發(fā)射波波長(zhǎng)為315 nm，柱溫40℃。所測(cè)得的產(chǎn)物峰面積換算為標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)物濃度，從而計(jì)算酶活［7］。

酶活定義：在 37℃，pH7.5的條件下，1 min轉(zhuǎn)化底物 L-苯丙氨酸生成1 μmol L-酪氨酸所需的酶量為一個(gè)酶活力單位 1 U。

1.2.6.1 蛋白濃度測(cè)定 蛋白質(zhì)定量采用常規(guī)的Bradford法［8］。

1.2.6.2 酶活測(cè)定體系確立 初始反應(yīng)體系如表 1所示。在37℃下分別不添加苯丙氨酸（Phenylalanine）、PAH重組酶、DMPH4、過(guò)氧化氫酶（Catalase）、DTT、Fe2+檢測(cè)其對(duì)酶活力的影響。以所有因子同時(shí)添加時(shí)的酶活為100%，作反應(yīng)因子對(duì)酶活影響的柱狀圖［9］。

1.2.6.3 最適溫度及溫度穩(wěn)定性 最適溫度測(cè)定：分別測(cè)定在10℃、20℃、30℃、40℃、50℃和60℃下重組酶的酶活力（pH7.5反應(yīng)10 min），以反應(yīng)溫度對(duì)所測(cè)得酶活作圖。

溫度穩(wěn)定性測(cè)定：在最適pH下，將50 μg的酶分別于20℃、30℃、40℃、50℃和 60℃下金屬浴保溫0、15、30、45和60 min 后，加入底物于37℃，pH7.5測(cè)定殘留酶活，作溫度穩(wěn)定性曲線。

1.2.6.4 最適pH及pH穩(wěn)定性 最適pH測(cè)定：在最適溫度下，分別測(cè)定pH4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0下的酶活，以最高活力為100%，以各反應(yīng)pH對(duì)所測(cè)得的相對(duì)酶活作圖。

pH穩(wěn)定性測(cè)定：在 25℃條件下將酶在不同 pH值（pH4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和 11.0）的緩沖液中處理12 h，然后在最適溫度和pH下測(cè)定酶活，以最高顯示的酶活力為100%，計(jì)算相對(duì)酶活，并對(duì)pH值作圖。

1.2.6.5 酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定 以不同濃度（0.2、0.4、0.8和1.0 mmol/L）的L-苯丙氨酸為底物，在最適條件下反應(yīng)10 min，測(cè)定初始速率。采用雙倒數(shù)作圖法（Line weaver-Burk）計(jì)算Km及kcat值。

2 結(jié)果

2.1pah基因的克隆

通過(guò)PCR 方法擴(kuò)增到紫色色桿菌pah的結(jié)構(gòu)基因，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，可見(jiàn)一條約 900 bp的 DNA條帶（圖2-A），該片段大小與預(yù)期長(zhǎng)度一致，說(shuō)明已成功擴(kuò)增出目的基因。連接pUC19載體后的重組質(zhì)粒經(jīng)DNA測(cè)序鑒定，序列與GenBank 所報(bào)道的紫色色桿菌來(lái)源的pah基因完全相同。將pah基因克隆于pET-24a載體BamHⅠ和Hind Ⅲ位點(diǎn)，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET24a-pah。重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切得到大小約為5.3 kb的pET-24a線性片段和大小約為900 bp的插入片段，證明原核表達(dá)載體pET24a-pah已成功構(gòu)建（圖2-B）。將pET24apah轉(zhuǎn)入E. coliBL21（DE3），獲得PAH表達(dá)型重組大腸桿菌BL21/pET24a-pah。

2.2 PAH在大腸桿菌中的表達(dá)與表達(dá)條件的優(yōu)化

對(duì)誘導(dǎo)培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，SDS-PAGE電泳結(jié)果表明，最佳IPTG誘導(dǎo)濃度為0.6 mmol/L（圖3-A），最佳誘導(dǎo)時(shí)間為24 h（圖3-B），最佳誘導(dǎo)溫度為24℃（圖3-C）。所獲得的蛋白分子量約為34 kD，與PAH（33 kD）加上T7-tag（pET-24a載體上共表達(dá)的標(biāo)簽）的理論值相符。

2.3 重組PAH的分離純化

PAH重組酶經(jīng)HisTrap DEAE FF column 1 mL陰離子柱純化，SDS-PAGE凝膠電泳分析結(jié)果（圖4）表明，一步純化獲得了較純的目的蛋白，純化后的比酶活相較純化前提高了5倍左右，高達(dá)503.2 U/mg。各步的純化效率如表2所示。

2.4 重組PAH的酶學(xué)性質(zhì)

2.4.1 酶活測(cè)定體系的優(yōu)化 通過(guò)37℃下對(duì)反應(yīng)體系中各反應(yīng)因子缺失后酶活力變化的檢測(cè)可知：過(guò)氧化氫酶缺失對(duì)酶活幾乎沒(méi)有造成影響，F(xiàn)e2+的缺失會(huì)對(duì)酶活造成一定的影響，而二硫蘇糖醇DTT和輔因子四氫生物蝶呤DMPH4一旦缺失則會(huì)造成酶活完全喪失（圖5）。優(yōu)化后的反應(yīng)體系為：1 mmol/L苯丙氨酸、50 μg PAH、200 μmol/L DMPH4、5 mmol/L DTT、5 μmol/L Fe2+，后續(xù)研究中采用該反應(yīng)體系測(cè)定酶活。

2.4.2 最適溫度及溫度穩(wěn)定性 重組酶在不同溫度下的酶活（圖6-A）顯示，該酶的最適反應(yīng)溫度為40℃左右，超過(guò)50℃酶活有所降低，但是當(dāng)溫度低于20℃時(shí)則會(huì)引起酶活的急劇下降。為方便起見(jiàn)，后續(xù)反應(yīng)中采用37℃作為PAH酶的反應(yīng)溫度。

20℃處理1 h酶活幾乎沒(méi)有變化；40℃熱處理1 h后酶活殘存85%左右。而50℃處理時(shí)間僅15 min就會(huì)造成酶活50%左右的損失（圖6-B）。

2.4.3 pH對(duì)酶活力的影響 以100 mmol/L 的乙酸-乙酸鈉體系作為pH4.0-6.0的緩沖體系，HEPES體系作為pH7.0-8.0的緩沖體系，碳酸鈉-碳酸氫鈉體系作為pH9.0-11.0的緩沖體系。不同pH的酶活測(cè)定結(jié)果（圖7-A）表明，在最適反應(yīng)溫度下該酶的最適pH在7.5左右。pH穩(wěn)定性分析（圖7-B）顯示，該酶在pH值6.0-8.0 范圍內(nèi)較穩(wěn)定。

2.4.4 酶動(dòng)力學(xué)參數(shù) 以L-苯丙氨酸為底物，在不同濃度下測(cè)定苯丙氨酸羥化酶的活性，從而計(jì)算出該酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。該酶的米氏常數(shù)Km為1.5 mol/L，最大反應(yīng)速率Vmax為0.5 mmol/min，轉(zhuǎn)化數(shù)kcat為5.05/s，催化效率kcat/Km為3.37 L/mmol·s。

3 討論

紫色色桿菌PAH催化區(qū)域的空間構(gòu)象與來(lái)源于哺乳動(dòng)物的來(lái)源幾乎完全一樣，由于細(xì)菌酶所特有的高活性、高溫度耐受性，使得其應(yīng)用前景更為廣闊。但目前該酶的表達(dá)量及制備水平遠(yuǎn)不能達(dá)到應(yīng)用的需求。本研究將該酶在大腸桿菌中進(jìn)行異源表達(dá)，獲得了高表達(dá)量的PAH。純化后PAH比酶活達(dá)到503.2 U/mg，比從原始菌中純化出PAH的比酶活提高了近8倍，比Nakata等［10］的純化更為簡(jiǎn)單。比Onishi等［12］通過(guò)抗原抗體相互作用分離出PAH的比酶活提高了3倍。

本研究發(fā)現(xiàn)反應(yīng)過(guò)程中不添加過(guò)氧化氫酶對(duì)PAH酶活沒(méi)有產(chǎn)生顯著影響。而從已知的報(bào)道中可推測(cè)：在之前的反應(yīng)體系中之所以添加過(guò)氧化氫酶是因?yàn)楫?dāng)亞鐵離子不存在時(shí)，四氫生物蝶呤與氧氣反應(yīng)后會(huì)產(chǎn)生過(guò)氧化氫，過(guò)氧化氫酶的主要作用是將產(chǎn)生的過(guò)氧化氫分解以防過(guò)氧化氫對(duì)PAH酶產(chǎn)生毒害作用而使反應(yīng)不能朝著正確的方向進(jìn)行［6］。當(dāng)亞鐵離子存在時(shí)就可以阻止過(guò)氧化氫的產(chǎn)生，因而本研究在添加了亞鐵離子的情況下，不需添加過(guò)氧化氫酶，從而使反應(yīng)體系得到精簡(jiǎn)。這一結(jié)果對(duì)同類酶的測(cè)定過(guò)程也有一定的借鑒意義。

本研究將紫色色桿菌來(lái)源PAH的酶學(xué)背景研究的更為透徹。發(fā)現(xiàn)其最適反應(yīng)溫度為40℃左右，且在該溫度下具有較好的熱穩(wěn)定性，雖然后續(xù)試驗(yàn)采用37℃作為PAH的酶的反應(yīng)溫度，仍可比Pember等［11］在25℃下進(jìn)行反應(yīng)獲得更高的酶活和催化效率?？赡苁禽^高的溫度有利于分子擴(kuò)散。其最適pH在7.5左右，在pH6.0-8.0范圍內(nèi)酶活較穩(wěn)定。重組酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)與從紫色色桿菌中純化出的野生型PAH的相一致。本研究為苯丙氨酸羥化酶進(jìn)一步的理論研究和在PKU治療中的應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究實(shí)現(xiàn)了紫色色桿菌pah基因在大腸桿菌中的高效表達(dá)（比酶活達(dá)到503.2 U/mg，比從原始菌中純化出PAH的比酶活提高了近8倍）。通過(guò)對(duì)重組酶酶學(xué)性質(zhì)及動(dòng)力學(xué)分析，獲得該酶的最適溫度40℃左右、最適 pH7.5左右，重組酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)與從紫色色桿菌中純化出的野生型PAH的相似，kcat和Km的變化都不大。在pH6.0-8.0范圍內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性。

［1］ Ronau JA, Paul LN, Fuchs JE, et al. An additional substrate binding site in a bacterial phenylalanine hydroxylase［J］. Eur Biophys J, 2013, 42（9）：691-708.

［2］ Erlandsen H, Kim JY, Patch MG, et al. Structural comparison of bcterial and human iron-dependent phenylalanine hydroxylases：similar fold, different stability and reaction rates［J］. J Mol Bio, 2002, 320（3）：645-661.

［3］ Fitzpatrick PF. Mechanism of aromatic amino acid hydroxylation［J］. Biochemistry, 2003, 42（48）：14083-14091.

［4］ 王芳, 奚耕思, 劉麗萍, 等.苯丙氨酸羥化酶的研究進(jìn)展［J］.生命科學(xué), 2013, 25（4）：372-377.

［5］ Loaiza A, Armstrong KM, Baker BM, et al. Kinetics of thermal unfolding of phenylalanine hydroxylase variants containing different metal cofactors（FeII, CoII, and ZnII）and their isokinetic relationship［J］. Inorg Chem, 2008, 47（11）：4877-4883.

［6］ Chen D, Frey PA. Phenylalanine hydroxylase from Chromobac-terium violaceum uncoupled oxidation of tetrahydropterin and the role of iron in hyroxylation［J］. J Biol Chem, 1998, 273（40）：25594-25601.

［7］ 林琳, 張可, 錢和.輻照雞肉鄰位酪氨酸含量檢測(cè)方法的研究［J］.食品科學(xué), 2010, 31（10）：188-191.

［8］ Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding［J］. Anal Biochem, 1976, 72（3）：248-254.

［9］ Pember SO, Benkovic SJ, Villafranca JJ, et al. Adduct formation between the cupric site of phenylalanine hydroxylase from Chromobacterium violaceum and 6, 7-Dimethyltetrahydropterin［J］. Biochemistry, 1987, 26（14）：4477-4483.

［10］ Nakata H, Yamauchi T, Fujisawa H. Phenylalanine hydroxylase from Chromobacterium violaceum purification and characterization［J］. J Biol Chem, 1979, 254（6）：1829-1833.

［11］ Pember SO, Villafranca JJ, Benkovic SJ. Phenylalanine hydroxylase from Chromobacterium violaceum is a copper-containing monooxygenase. kinetics of the reductive activation of the enzyme［J］. Biochemistry, 1986, 25（21）：6611-6619.

［12］ Onishi A, Liotta LJ, Benkovic SJ. Cloning and expression of Chromobacterium violaceurnphenylalanine hydroxylase inEscherichiacoli and comparison of amino acid sequence with mammalian aromatic amino acid hydroxylas［J］. J Biol Chem, 1991, 266（28）：18454-18459.

［13］ Koehntop KD, Emerson JP, Que L Jr. The 2-his-1-carboxylate facial triad：a versatile platform for dioxygen activation by mononuclear non-heme iron（II）enzymes［J］. J Biol Inorg Chem, 2005, 10（2）：87-93.

［14］ Yew NS, Dufour E, Przybylska M, et al. Erythrocytes encapsulated with phenylalanine hydroxylase exhibit improved pharmacokinetics and lowered plasma phenylalanine levels in normal mice［J］. Mol Genet Metab, 2013, 109（4）：339-344.

（責(zé)任編輯 馬鑫）

Heterologous Expression and Characterization of Phenylalanine Hydroxylase from Chromobacterium violaceum

Cao Shuhui Zhou Li Cui Wenjing Liu Zhongmei Zhou Zhemin
（The Key Laboratory of Industrial Biotechnology of the Ministry of Education，School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122）

Phenylalanine hydroxylase（PAH）derived fromChromobacterium violaceumhas potential pharmaceutical value due to its simple structure and the closer property to human PAH. We cloned thepahgene fromC. violaceumand constructed recombinant expression vcectors pET24a-pah, finally, thepahgene was efficiently expressed inEscherichia coliBL21（DE3）. The specific activity of recombination protein was 503.2 U/mg after purification. The studies of enzymatic properties showed that the enzyme displayed maximum activity at 40℃, and its half-life was 15 min at 50℃. The optimal pH was pH7.5, and the enzyme activity was stable at the range of pH6-8. Under the conditions of 37℃ and pH7.5, itsKmwas 1.5 mmol/L,Vmaxwas 0.5 mmol/min,kcatwas 5.05/s, and the catalytic efficiency（kcat/Km）was 3.37 L/mmol·s.

Phenylalanine hydroxylaseChromobacterium violaceumExpression Purification Enzymatic properties

2014-01-23

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31070711，31300087），新世紀(jì)優(yōu)秀人才項(xiàng)目（NCET-10-0461），江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（BK20130131）

曹淑慧，女，碩士研究生，研究方向：發(fā)酵工程；E-mail：elizabethcsh@sina.com

周哲敏，男，教授，研究方向：生物酶學(xué)、發(fā)酵工程；E-mail：zhmzhou@jiangnan.edu.cn