非編碼RNA與細(xì)菌耐藥

劉翠翠，魏小娟，周緒正，李冰，牛建榮，王婧，朱陣，張繼瑜

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州畜牧與獸藥研究所獸藥重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730050

近年來(lái)隨著醫(yī)療機(jī)構(gòu)的普及和抗生素的廣泛使用甚至濫用，使得細(xì)菌的耐藥問(wèn)題日益凸現(xiàn)，嚴(yán)重影響人類(lèi)的健康和畜牧業(yè)的發(fā)展。細(xì)菌耐藥性也稱抗藥性，是細(xì)菌在適應(yīng)并抵抗之前可以提供有效治療的抗菌藥物過(guò)程中產(chǎn)生的。細(xì)菌一旦耐藥，它就會(huì)在非抗藥性細(xì)菌被殺死而且沒(méi)有競(jìng)爭(zhēng)的情況下快速繁殖，抗藥基因也會(huì)隨之傳遞給下一代細(xì)菌。因此，我們要高度重視細(xì)菌的耐藥問(wèn)題，積極研發(fā)新型抗菌藥物，并建立全球藥物開(kāi)發(fā)和利用的監(jiān)管體系。非編碼RNA在細(xì)菌的生命活動(dòng)中發(fā)揮著極為廣泛的調(diào)控作用，它們涉及到的功能包括從結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)到催化作用，影響各種各樣的加工過(guò)程，如質(zhì)粒復(fù)制、噬菌體發(fā)育、細(xì)菌毒性、壓力反應(yīng)、發(fā)育控制、RNA剪切和修飾、mRNA穩(wěn)定性及蛋白質(zhì)降解等[1-2]。近年來(lái)，非編碼RNA的疾病耐藥機(jī)制也正在被闡明。

1 細(xì)菌非編碼RNA

細(xì)菌基因組中存在一類(lèi)新型RNA，它們的分子大小為50～500核苷酸（nt），開(kāi)始于一段能折疊成穩(wěn)定莖環(huán)結(jié)構(gòu)的序列，終止于不依賴Rho的轉(zhuǎn)錄終止子[3]，能夠影響生物體內(nèi)的多種生理功能，被廣泛稱為非編碼RNA。迄今在細(xì)菌中已發(fā)現(xiàn)了百余種非編碼RNA，不同的非編碼RNA發(fā)揮功能的機(jī)制不同。根據(jù)其生物學(xué)功能及作用機(jī)制，可將非編碼RNA分為3類(lèi)，即具有持家功能的非編碼RNA、與蛋白質(zhì)相互作用影響蛋白質(zhì)功能的非編碼RNA、與目標(biāo)mRNA配對(duì)結(jié)合調(diào)控基因表達(dá)的非編碼RNA[3]；根據(jù)其基因與靶標(biāo)的位置關(guān)系可分為2類(lèi)，即正義編碼的與反義編碼的非編碼RNA。其中，正義編碼的非編碼RNA基因與靶標(biāo)基因重疊，并且它們的轉(zhuǎn)錄體之間存在良好的堿基配對(duì)；而反義編碼的非編碼RNA基因與靶標(biāo)基因是分離的，通常轉(zhuǎn)錄體之間不存在良好的堿基配對(duì)[4]。

2 非編碼RNA與細(xì)菌耐藥

2.1 大腸桿菌

大腸桿菌的MicF是一個(gè)93 nt的非翻譯轉(zhuǎn)錄子，其5'端可與ompF mRNA的5'端結(jié)合形成RNA雙聚體，干擾ompF基因的轉(zhuǎn)錄，降低ompF mRNA量，從而導(dǎo)致OmpF蛋白低表達(dá)，影響抗菌藥物通過(guò)細(xì)胞膜，從而導(dǎo)致耐藥。膜孔蛋白OmpF是重要的抗菌藥物通透蛋白。李俐[5]等對(duì)臨床菌株進(jìn)行了MicF的檢測(cè)，分析其與耐藥的相關(guān)性，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組的MicF轉(zhuǎn)錄水平普遍高于對(duì)照組，說(shuō)明MicF通過(guò)干擾膜孔蛋白的表達(dá)對(duì)細(xì)菌耐藥起著調(diào)控作用。Warner等[6]也證實(shí)MicF與大腸桿菌的抗生素耐藥有關(guān)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)大腸桿菌中的marRAB操縱子可以通過(guò)調(diào)節(jié)多藥耐藥泵AcrAB-TolC的表達(dá)來(lái)使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。

大腸桿菌的DsrA是一個(gè)87 nt的非編碼RNA，可以通過(guò)反作用H-NS調(diào)節(jié)因子的轉(zhuǎn)錄抑制和激發(fā)RpoS σ因子的合成來(lái)調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)[7]。盡管對(duì)DsrA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的主要部分已進(jìn)行了研究，但它與耐藥性之間的關(guān)系仍然未知。2010年，Nishino等[8]證實(shí)，大腸桿菌中DsrA通過(guò)上調(diào)mdtEF外排泵的表達(dá)，降低了大腸桿菌對(duì)苯唑西林、氯唑西林、紅霉素、羅丹明6G和新生霉素的敏感性；DsrA的過(guò)表達(dá)使得mdtE的表達(dá)明顯上調(diào)，而由DsrA調(diào)節(jié)的多藥耐藥性的降低也依賴于mdtEF外排泵。

2.2 伯克霍爾德菌

伯克霍爾德菌（Burkholderia cepacia）是一種廣泛存在于水、土壤、植物和人體中的革蘭陰性細(xì)菌。Ramos[9]等運(yùn)用生物信息學(xué)技術(shù)，對(duì)伯克霍爾德菌中的非編碼RNA MtvR（136 nt）進(jìn)行了靶基因預(yù)測(cè)，顯示它共有309個(gè)mRNA靶標(biāo)，當(dāng)MtvR沉默或過(guò)表達(dá)時(shí)，17～19個(gè)mRNA基因受到影響。研究證實(shí)，MtvR在抗生素耐藥性方面有重要的調(diào)節(jié)作用。MtvR沉默的伯克霍爾德菌株與正常菌株相比，最低抑菌濃度（MIC）略有不同，但這些微小的變化沒(méi)有改變細(xì)菌的耐藥或敏感狀態(tài)。與此不同的是，MtvR過(guò)表達(dá)的伯克霍爾德菌株能夠改變菌株的易感性，尤其是對(duì)氨基甙類(lèi)的慶大霉素、阿米卡星和β-內(nèi)酰胺類(lèi)的頭孢他啶、亞胺培南的易感性。

2.3 沙門(mén)菌

沙門(mén)菌是革蘭陰性腸道桿菌，能夠引起人和動(dòng)物的胃腸炎、傷寒及敗血癥等。Yu等[10]用老虎霉素和四環(huán)素誘導(dǎo)沙門(mén)菌，發(fā)現(xiàn)有4個(gè)非編碼RNA（sYJ5、sYJ20、sYJ75和sYJ118）明顯上調(diào)，而且當(dāng)老虎霉素存在時(shí)，sYJ20缺失可以導(dǎo)致細(xì)菌生存能力降低，補(bǔ)充sYJ20之后恢復(fù)。說(shuō)明非編碼RNA可以影響細(xì)菌對(duì)抗生素的反應(yīng)?；蚪M分析顯示，sYJ5和sYJ118在16S和23S rRNA基因間區(qū)編碼；sYJ20（也稱作SroA）在tbpAyabKyabJ操縱子的上游編碼，是一類(lèi)核糖開(kāi)關(guān)；sYJ75也在基因間區(qū)編碼，與腸桿菌素的運(yùn)輸和代謝有關(guān)。

2.4 金黃色葡萄球菌

宋娟等[11]分別在不同抑菌濃度左氧氟沙星干擾情況下培養(yǎng)金黃葡萄球菌實(shí)驗(yàn)株RN6390和RN1HG001，提取RNA，用實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（qRT-PCR）檢測(cè)不同菌株中5種小分子RNA（sRNA）（RNAⅢ、RsaA、RsaE、RsaG、RsaH）的含量，發(fā)現(xiàn)不同濃度的左氧氟沙星對(duì)金黃葡萄球菌sRNA的表達(dá)具有抑制或促進(jìn)作用。Benjamin等[12-13]采用萬(wàn)古霉素、利奈唑胺、頭孢吡普和老虎霉素誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，并以未添加抗生素的細(xì)菌為對(duì)照，然后進(jìn)行RNA-seq和非負(fù)矩陣分解（non-negative ma?trix factorization，NMF）分析。結(jié)果顯示5個(gè)sRNA有差異表達(dá)，包括基因調(diào)節(jié)系統(tǒng)的效應(yīng)分子RNAⅢ下調(diào)表達(dá)，還有假定的sRNA260和通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的RNA131（也稱RsaOI）都上調(diào)表達(dá)。這些數(shù)據(jù)為sRNA與葡萄球菌抗生素耐藥性的關(guān)系研究提供了一個(gè)框架，同時(shí)探索了一條新的與sRNA相關(guān)的抗菌療法。

2.5 鼠疫耶爾森菌

鼠疫耶爾森菌是鼠疫的病原，為革蘭染色陰性的短小桿菌，能引起淋巴腺鼠疫（黑死?。?，病亡率高達(dá)90%。鄧仲良等[14]對(duì)腸桿菌科基因組序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)基因組內(nèi)只存在1個(gè)RyhB，只有耶爾森菌和沙門(mén)菌基因組內(nèi)存在2個(gè)RyhB同源拷貝，其中一個(gè)拷貝可能是進(jìn)化分支過(guò)程中獲得的。鼠疫耶爾森菌的RyhB1和RyhB2都位于染色體上，且相距較遠(yuǎn)。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析表明RyhB1和RyhB2在調(diào)控中的作用是不同的，RyhB2發(fā)揮主要的調(diào)控作用，并且主要調(diào)控小分子代謝物（8個(gè)），如糖酵解、丙酮酸脫氧酶和鐵攝取等，占到總蛋白的50%。令人感興趣的是，RyhB2還能上調(diào)一個(gè)多耐藥相關(guān)的蛋白acrA，acrA是多耐藥流出泵家族一員，而多耐藥流出泵在參與革蘭陰性菌耐藥中發(fā)揮重要作用。

3 結(jié)語(yǔ)

細(xì)菌耐藥性是細(xì)菌對(duì)抗生素不敏感的現(xiàn)象，是細(xì)菌在自身生存過(guò)程中的一種特殊表現(xiàn)形式，有些細(xì)菌甚至攜帶數(shù)種耐藥基因，被稱作多重耐藥菌或超級(jí)細(xì)菌，這使得開(kāi)發(fā)新型藥物迫在眉睫[15-16]。非編碼RNA作為一種新的調(diào)控子，不僅在個(gè)體發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用，也在疾病發(fā)生和治療中擔(dān)任著不可忽視的角色，已成為國(guó)際上的研究熱點(diǎn)。目前有關(guān)抗生素與細(xì)菌非編碼RNA相互作用與影響的研究報(bào)道較少。我們初步總結(jié)了幾種細(xì)菌的非編碼RNA與其耐藥性之間的關(guān)系，為探索非編碼RNA功能和解決耐藥問(wèn)題奠定基礎(chǔ)。

[1]宋蘭,周先禮,岳俊杰,等.細(xì)菌中的小RNA[J].生物技術(shù)通訊,2008,19(4):587-590.

[2]Romby P,Vandenesch F.The role of RNAs in the regulation of virulence gene expression[J].Curr Opin Microbiol,2006,9:229-236.

[3]生秀梅,徐順高,張海方,等.細(xì)菌小RNA的研究[J].生命的化學(xué),2010,30(6):815-820.

[4]Li W,Ying X,Lu Q,et al.Predicting sRNAs and their tar?gets in bacteria[J].Genomics Proteomics Bioinformatics,2012,10(5):276-284.

[5]李俐,蔣燕群.大腸埃希菌臨床菌株中MicF的轉(zhuǎn)錄情況檢測(cè)及分析[J].中國(guó)感染與化療雜志,2011,11(3):191-194.

[6]Warner D M,Yang Q,Duval V,et al.Involvement of MarR and YedS in carbapenem resistance in a clinical isolate of Escherichia coli from China[J]. Antimicrob Agents Chemoth?er,2013,57(4):1935-1937.

[7]Sledjeski D D,Whitman C,Zhang A.Hfq is necessary for regulation by the untranslated RNA DsrA[J].J Bacteriol,2001,183(6):1997-2005.

[8]Nishino K,Yamasaki S,Hayashi-Nishino M,et al.Effect of over-expression of small non-coding DsrA RNA on multidrug ef fl ux in Escherichia coli[J].J Antimicrob Chemother,2011,66:291-296.

[9]Ramos C G,Grilo A M,da Costa P J P,et al.MtvR is a global regulatory sRNA in Burkholderia cenocepacia[J].J Bac?teriol,2013,195:3514-3523.

[10]Yu J,Schneiders T.Tigecycline challenge triggers sRNA pro?duction in Salmonella enterica serovar Typhimurium[J].BMC Microbiol,2012,12:195.

[11]宋娟,楚雍烈.左氧氟沙星對(duì)金黃葡萄球菌小RNA表達(dá)的影響[J].中國(guó)病原生物學(xué)雜志,2012,7(2):94-97.

[12]Howden B P,Beaume M,Harrison P F,et al.Analysis of the small RNA transcriptional response in multidrug resistant Staphylococcus aureus after antimicrobial exposure[J].Antimi?crob Agents Chemother,2013,57:3864-3874.

[13]Tomasini A,Fran?ois P,Howden B P,et al.The importance of regulatory RNAs in Staphylococcus aureus[J].Infect Genet Evol,2014,21:616-626.

[14]鄧仲良.鼠疫耶爾森氏菌小RNA RyhB1和RyhB2調(diào)控和生理比較研究[D].廣州:南方醫(yī)科大學(xué),2012.

[15]周顯鳳,倪賢生,吳越.細(xì)菌耐藥性機(jī)制研究進(jìn)展[J].熱帶醫(yī)學(xué)雜志,2011,11(3):356-357.

[16]Hunter P A,Reeves D S.The current status of resistance to antimicrobialagents:reporton a meeting[J].JAntimicrob Chemother,2002,49(1):17-23.