煙粉虱全基因組DNA四種提取方法的比較

戴恬美呂志創(chuàng)萬方浩，2

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所 植物病蟲害生物學(xué)國家重點研究室，北京 100193；2.農(nóng)業(yè)部外來入侵生物預(yù)防與控制研究中心，北京 100193）

煙粉虱全基因組DNA四種提取方法的比較

戴恬美1呂志創(chuàng)1萬方浩1，2

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所 植物病蟲害生物學(xué)國家重點研究室，北京 100193；2.農(nóng)業(yè)部外來入侵生物預(yù)防與控制研究中心，北京 100193）

獲得大量、高質(zhì)量的全基因組DNA是在DNA水平上研究許多生物的分子機制的基本前提。微小昆蟲由于其體型微小，單頭提取DNA濃度低，無法滿足部分試驗所需。為尋找一種方便、快捷、高效的全基因組提取方法，參考國內(nèi)外單頭微小昆蟲基因組DNA提取常用方法，以煙粉虱為研究材料，選取醋酸鉀（KAc）法、鹽析法、氯仿-異戊醇法和苯酚提取法四種方法進行多頭煙粉虱的全基因組DNA提取。通過微量核酸蛋白分析儀、基因組DNA直接瓊脂糖凝膠電泳、甲基化敏感擴增多態(tài)性（Methylation sensitive amplification polymorphism，MSAP）引物擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳對DNA樣品進行檢測，比較提取DNA的產(chǎn)量、質(zhì)量，并綜合分析各提取方法所需時間及所用試劑的毒性大小。結(jié)果表明，鹽析法提取的DNA平均濃度為521 ng/μL，純度能滿足分子檢測要求，用MSAP引物能得到較好的擴增結(jié)果，相比其它方法，鹽析法更簡便、快速且無毒。因此鹽析法是多頭煙粉虱全基因組DNA提取的最佳方法。

DNA提取 煙粉虱 KAc法 氯仿-異戊醇法 鹽析法 苯酚法

煙 粉 虱Bemisia tabaci（Gennadius） 屬 半 翅目（Hemiptera），粉虱科（Aleyrodidae），小粉虱屬Bemisia，是多食性的刺吸性害蟲，主要分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)［1］。煙粉虱是一個包含30個以上隱種的物種復(fù)合體［2-5］，其中Middle East-Asia Minor1（MEAM1）隱種和 Mediterranean（MED）隱種入侵我國后憑借其寄主范圍廣、產(chǎn)卵量大、溫度耐受性強、抗藥性強、傳播病毒等特點，迅速擴散到我國絕大部分省份，并逐漸取代本地隱種，占據(jù)優(yōu)勢地位［6］。煙粉虱主要通過取食植物韌皮部汁液、引起植物生理混亂、傳播植物病毒、分泌蜜露誘發(fā)真菌病害等方式，成為為害我國蔬菜、花卉等作物上的主要害蟲，對我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失［7］。

煙粉虱遺傳結(jié)構(gòu)復(fù)雜且多樣性高，但其個體微小，各隱種在形態(tài)上無法鑒別［3，6］，故利用分子生物學(xué)技術(shù)從核酸水平對其進行物種鑒定、分類［8］以及研究其種間親緣關(guān)系、生物學(xué)特性［9］等已成為研究其生物系統(tǒng)學(xué)和生物進化學(xué)的重要手段之一，而核酸水平研究的第一步最關(guān)鍵的步驟是獲得物種的DNA。目前，煙粉虱DNA提取方法一般都是針對單頭昆蟲，但由于單頭煙粉虱提取的DNA濃度低，低濃度的DNA無法滿足對部分試驗研究的要求。因此，尋找既能滿足研究所用的需求，同時又簡便、快捷、有效，且能降低對操作人員的毒害等的進行多頭、大量提取全基因組DNA的提取方法，成為試驗中首要解決的問題。

本研究借鑒國內(nèi)外應(yīng)用較多的提取昆蟲DNA的4種方法，即KAc法、鹽析法、氯仿-異戊醇法和苯酚法，對各提取方法稍作改動或改進，以煙粉虱為材料，通過微量核酸蛋白分析儀、基因組DNA直接瓊脂糖凝膠電泳和甲基化敏感擴增多態(tài)性（Methylation sensitive amplification polymorphism，MSAP）引物擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，對4種方法所提取的基因組DNA質(zhì)量和產(chǎn)量進行了比較，并結(jié)合DNA提取所需時間、操作難易程度和所用試劑的毒性大小進行綜合比較，旨在尋找最佳的煙粉虱全基因組DNA提取方法，為今后廣泛開展煙粉虱親緣關(guān)系分析、基因組比較、遺傳多樣性和某些特定基因的標(biāo)記等分子生物學(xué)研究提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試蟲源 煙粉虱MED（Mediterranean）隱種采自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所生物入侵研究室長期飼養(yǎng)的種群，寄主植物為番茄Lycopersicon lycopersicumMill（Solanales：Solanaceae）（中雜9號）（購自北京中蔬園藝良種研究開發(fā)中心），無用藥史，飼養(yǎng)溫度為（26±1）℃，相對濕度為60%-80%，光周期為16L∶8D。

1.1.2 主要試劑、溶液及儀器 試驗所用PCR儀為美國MJ公司的PTC-200，凝膠成像分析系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司，小型臺式高速冷凍離心機為德國Eppendorf公司的5424R，超微量核酸蛋白分析儀為德國IMPLEN公司的P330。

主要試劑有蛋白酶K、Taq酶（購自全式金生物技術(shù)（北京）有限公司），T4連接酶（購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司），EcoRⅠ酶、HpaⅡ酶和MseⅠ酶（購自紐英倫生物技術(shù)（北京）有限公司），其余試劑為國產(chǎn)分析純。引物由上海生工生物公司合成。

1.2 方法

1.2.1 全基因組DNA的提取方法

1.2.1.1 KAc法 參照呂志創(chuàng)［10］的方法，稍加改進。提 取 緩 沖液（pH8.0）：1 mol/L Tris-HCl，5 mol/L NaCl，0.5 mol/L EDTA，10% SDS。（1）取約100頭煙粉虱成蟲，液氮冷凍3 min后，加入50 μL提取緩沖液研磨勻漿；（2）吸取250 μL提取緩沖液分3次清洗研棒并混勻；（3）向管中加入5 μL蛋白酶K（20 mg/mL），充分混勻，60℃水浴2 h（中途混勻1次），100℃沸水浴5 min；（4）向管中加入1倍體積KAc（3 mol/L）抽提，冰浴2 h，4℃、12 000 r/min、離心15 min，重復(fù)此步驟一次；（5）取上清液，加入2倍體積預(yù)冷無水乙醇，冰浴2 h，4℃、12 000 r/min、離心15 min，小心棄去上清液；（6）加入2倍體積預(yù)冷75%乙醇洗滌，4℃、12 000 r/min、離心15 min，自然干燥沉淀，溶于30 μL滅菌ddH2O，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 KAc改良法 將1.2.1.1中步驟（3）改為：向管中加入5 μL濃度為20 mg/mL的蛋白酶K，充分混勻，60℃水浴1 h，中途混勻1次；步驟（4）改為：100℃沸水浴5 min后加入1倍體積KAc（3 mol/L）抽提1次，冰浴1 h，4℃、12 000 r/min、離心15 min；步驟（5）取上清液，加入 2倍體積預(yù)冷無水乙醇，冰浴1 h，4℃、12 000 r/min、離心15 min，小心棄去上清液；其余步驟同1.2.1.1。

1.2.1.3 鹽析法 參照滕希等［11］的方法，稍加改進。提取緩沖液：50 mmol/L Tris-Cl，pH7.5，400 mmol/L NaCl，20 mmol/L EDTA，0.5% SDS。（1）取約100頭煙粉虱成蟲，液氮冷凍3 min后，加入20 μL提取緩沖液，研磨棒研磨；（2）吸取280 μL提取緩沖液分3次清洗研棒后混勻，再加入5 μL蛋白酶K，輕搖混勻，60℃水浴1 h（中間混勻1次）；（3）加入100 μL 5 mol/L NaCl，充分震蕩15 s，4℃、14 000 r/min、離心10 min，棄蛋白質(zhì)沉淀，移上清液到另一離心管中；（4）加入400 μL預(yù)冷的無水乙醇，輕輕混勻，-20℃放置30 min；（5）4℃、14 000 r/min、離心10 min，棄上清液；加入400 μL預(yù)冷的75% 乙醇洗滌，4℃、14 000 r/min、離心10 min，棄上清液；（6）在室溫下干燥，然后加30 μL滅菌ddH2O，充分溶解后，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.4 氯仿-異戊醇法 參照周志湘等［12］的方法。提取緩沖液：50 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，1% SDS，20 mmol/L NaCl，pH8.0。

（1）取約100頭煙粉虱成蟲，液氮冷凍3 min后，加入50 μL提取緩沖液研磨勻漿；（2）吸取250 μL緩沖液分3次清洗勻漿液并混勻，加入5 μL蛋白酶K，充分混勻，于60℃水浴1 h（中間取出搖動混勻1次），然后沸水浴5 min；（3）加入300 μL氯仿∶異戊醇24∶1抽提液，輕柔混勻數(shù)十次，冰上放置40 min，4℃、14 000 r/min、離心10 min，移上清液到另一離心管中；（4）加入600 μL預(yù)冷的無水乙醇，輕輕混勻，-20℃放置1 h；（5）4℃、12 000 r/min、離心15 min，小心棄去上清液，加入600 μL預(yù)冷的75% 乙醇洗滌，4℃、12 000 r/min、15 min，小心棄去上清液；（6）室溫下干燥，加30 μL滅菌ddH2O，充分溶解后于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.5 酚提取法 參照Bender等［13］的方法。提取液：100 mmol/L NaCl，200 mmol/L蔗糖，50 mmol/L EDTA，0.5% SDS，100 mmol/L Tris-HCl pH9.1。（1）取約100頭煙粉虱成蟲，液氮冷凍3 min后，加入100 μL提取液，5 μL蛋白酶K。（2）研磨棒充分研磨后，300 μL提取液沖洗研磨棒；將管（共含400 μL提取液）置于65℃下培養(yǎng)30 min。（3）在管仍保持余熱時加入56 μL 8 mol/L醋酸鉀，顛倒混勻，冰浴30 min。（4）室溫下14 000 r/min離心15 min，轉(zhuǎn)移上清液至干凈的離心管內(nèi)。（5）室溫下14 000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液至干凈的離心管內(nèi)。（6）加入5 μL 10 mg/mL RNaseA，37℃保溫培養(yǎng)30 min。（7）加入400 μL苯酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1），渦旋混勻。（8）室溫下14 000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上清至新離心管。（9）向管內(nèi)加入400 μL氯仿∶異戊醇（24∶1），渦旋混勻，室溫下14 000 r/min離心10 min。（10）移上清至新管內(nèi)，加入200 μL 7.5 mol/L醋酸銨和800 μL預(yù)冷的無水乙醇，輕輕混勻。（11）室溫下靜置10 min，室溫下14 000 r/min離心15 min，倒掉上清。（12）用500 μL 75%乙醇洗滌沉淀，室溫下14 000 r/min離心5 min，倒掉上清。（13）洗掉管內(nèi)殘余乙醇，空氣干燥4-5 min后加入30 μL ddH2O 溶解DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 基因組DNA的檢測

1.2.2.1 微量核酸蛋白分析儀檢測 以ddH2O作為空白對照，取所提DNA樣品0.3 μL，微量核酸蛋白分析儀測定其OD260/OD280、OD260/OD230值及DNA樣品的純度。OD260/D280比值在1.8左右表明DNA優(yōu)質(zhì)，低值表明蛋白污染，數(shù)值越高，表明RNA污染。OD260/OD230比值一般大于2，小于2說明去鹽不充

分［14，15］。

1.2.2.2 瓊脂糖凝膠電泳檢測 取所提DNA樣品1 μL稀釋4倍，上樣于0.8%瓊脂糖凝膠電泳，100 V，30 min電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)觀察條帶的清晰度和完整度。

1.2.2.3 MSAP擴增檢測 參照文獻［16］，選用EcoRⅠ酶切接頭序列為5'-CTCGTAGACTGCGTACC-3'，5'-AATTGGTACGCAGTCTAC-3'，基本引物序列為5'-GTAGACTGCGTACCAATTCA-3'；HpaⅡ-MspⅠ酶切接頭序列為5'-GACGATGAGTCCTGAG-3'，5'-CGTTCTAGACTCATC-3'，其擴增引物為5'-GATGAGTCTAGAACGGT-3'。

酶切反應(yīng)體系為50 μL：其中1 μg DNA，7.5 UEcoR I，7.5 UHpaⅡ/MspⅠ酶，5 μL Buffer，加ddH2O至50 μL。反應(yīng)混合物混合均勻后，37℃酶切8 h后進行連接反應(yīng)，反應(yīng)總體積為25 μL：其中5 μL酶切產(chǎn)物，5 pmolEcoR I接頭，50 pmolHpaⅡ/MspⅠ接頭，2.5 U T4連接酶，2.5 μL 10×連接buffer，12 μL ddH2O。反應(yīng)混合物混合均勻后，16℃過夜，取出65℃滅活10 min，稀釋10倍后，-20℃保存。

擴增反應(yīng)體系為20 μL：其中5 μL連接產(chǎn)物，30 pmolEcoR I引物和30 pmolHpaⅡ/MspI引物，1 UTaq酶，2 μL 10×ExTaq酶buffer，2 μL dNTP，6.5μL ddH2O。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min；94℃30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，25個循環(huán)；72℃延伸7 min。

取PCR產(chǎn)物1 μL稀釋4倍，1%瓊脂糖凝膠電泳進行電泳檢測，100 V，30 min，凝膠成像系統(tǒng)觀察條帶的清晰度和完整度。

2 結(jié)果

2.1 DNA純度檢測

如表1所示，4種方法提取的煙粉虱基因組DNA的純度與比值各不相同。其中，KAc法、KAc改良法、氯仿-異戊醇法提取效果最好，得到的DNA顏色潔白透明，OD260/OD280值在1.8左右，OD260/OD230值在2.0左右，基本無蛋白質(zhì)和RNA污染，但氯仿-異戊醇法提取的DNA濃度比KAc法提取的低。鹽析法得到的DNA顏色也潔白透明且濃度較高，但樣品OD260/OD280值均在1.900以上，表明樣品存在一定的RNA污染。苯酚法提取的效果最差，OD260/OD230值在1.000左右，表明含有較高雜質(zhì)，苯酚法提取的第3組重復(fù)得到的DNA顏色呈黃色，難溶解，DNA濃度也偏低。

2.2 瓊脂糖凝膠電泳檢測

4種方法提取的DNA樣本直接在0.8%瓊脂糖上電泳的分離效果（圖1）顯示，煙粉虱的基因組大小在23 kb以上。不同方法提取的基因組DNA電泳條帶差別較大。其中氯仿-異戊醇法提取的DNA電泳條帶最明亮清晰，表明提取的DNA完整性較高，且濃度較純。其次是鹽析法，但鹽析法在底部顯示出彌散的一團，可能是試驗中RNA沒有除凈或DNA降解了。KAc法、KAc改良法在23 kb處有較模糊的條帶，同時底部也顯示出彌散的一團，且較明亮，結(jié)合微量核酸蛋白分析儀檢測結(jié)果，可能是DNA大部分降解的緣故。苯酚法提取的DNA電泳條帶顯示，沒有得到完整的基因組DNA條帶。

2.3 MSAP擴增檢測

4種方法提取的DNA樣本MSAP引物的擴增產(chǎn)物在1%瓊脂糖上電泳的分離效果（圖2）顯示，煙粉虱全基因組酶切后擴增產(chǎn)物片段集中在500 bp-2 kb。不同方法提取的全基因組DNA均有擴增產(chǎn)物。鹽析法和氯仿-異戊醇法均得到較明亮且集中的片段區(qū)域，擴增效果高效，表明所提取的全基因組DNA能酶切完全并可用作PCR模板，且所含蛋白質(zhì)、多糖類等雜質(zhì)少，其純度完全能達到RFLP、AFLP、ISSR、RAPD、COI分析等分子生物學(xué)的研究。KAc改良法和苯酚法得到的片段區(qū)域亮度相對較弱，KAc法得到的片段區(qū)域亮度非常低，整體結(jié)果與基因組DNA電泳圖結(jié)果相似，即提取全基因組DNA時的降解程度對DNA擴增效率有直接影響，降解程度過高可能導(dǎo)致得不到擴增產(chǎn)物。

3 討論

昆蟲DNA提取與植物DNA提取不同，植物細胞有細胞壁且富含多種次生代謝產(chǎn)物，提取時主要雜質(zhì)為蛋白質(zhì)、多糖、多酚、單寧等，一般通過SDS和CTAB法去除，而昆蟲DNA提取時，蛋白質(zhì)、脂類物質(zhì)是影響DNA提取的主要障礙，目前國內(nèi)去除此類雜質(zhì)通常采用的方法是氯仿-異戊醇法和KAc法，而鹽析法和苯酚法是國外用分子標(biāo)記技術(shù)研究蚜蟲等小型昆蟲種群遺傳結(jié)構(gòu)時使用較多的方法。本研究使用以上4種有代表性的昆蟲DNA提取方法對大量煙粉虱全基因組DNA進行提取，并對其提取效果進行了比較。在提取純度方面，KAc法、KAc改良法、氯仿-異戊醇法提取純度最高，基本無蛋白質(zhì)和RNA污染，鹽析法得到的DNA可能存在輕微的RNA污染，苯酚法得到的DNA樣品含較多其它雜質(zhì)，純度最低；在提取完整性方面，鹽析法和氯仿-異戊醇法提取質(zhì)量最高，其次是KAc改良法，KAc法和苯酚法存在不同程度的降解；在PCR擴增試驗中，鹽析法和氯仿-異戊醇法均能得到有效的擴增產(chǎn)物，雖然鹽析法中存在的輕微雜質(zhì)殘留但不影響其后續(xù)的擴增。綜合比較鹽析法和氯仿-異戊醇法提取效果最佳，但氯仿-異戊醇法提取過程中，所使用的氯仿極易揮發(fā)，對皮膚、眼睛、黏膜和呼吸道有刺激作用，是一種致癌劑，異戊醇亦可因吸入或皮膚吸收而受害并有嚴(yán)重損傷眼睛的危害［17］。

4 結(jié)論

遵循簡便、經(jīng)濟、有效、無毒的原則，鹽析法提取的全基因組DNA不僅提取量大、濃度高，得到的昆蟲全基因組DNA樣本的質(zhì)量能滿足PCR等分子生物學(xué)分析的要求，且操作簡單，耗時較短，能避免使用對人體損傷較大的有機溶劑，故而是一種值得推廣的煙粉虱全基因組DNA提取方法。此外，氯仿-異戊醇法獲得的基因組DNA雖然濃度低，但質(zhì)量非常好，因此，其在對DNA質(zhì)量要求高的試驗中具有很大的應(yīng)用價值。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Comparison of Four Methods for Whole Genomic DNA Extraction from Bemisia tabaci

Dai Tianmei1Lü Zhichuang1Wan Fanghao1，2
（1. State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests，Institute of Plant Protection，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193；2. Center for Management of Invasive Alien Species Ministry of Agriculture，Beijing 100193）

Obtaining high-quality DNA is a prerequisite to study the molecular mechanisms of many organisms. For tiny insects, low DNA concentration（from one single insect）is unable to meet the need of some experiments. To find a convenient and efficient method for whiteflies genome extraction, KAc, salting-out, chloroform-isoamylol and phenol methods were used to extract bull whiteflies genome DNA, respectively. The efficiency of different DNA extraction methods were evaluated by comparing the concentration, purity, PCR products of DNA, extraction time and the toxicity of the reagents, respectively. The results showed that the average concentration of DNA extraction of salting-out method was 521 ng/μL, and the purity could meet the experiment requirements, and the PCR product brand of MSAP primer amplification was bright. Compared to other methods, salting-out method was more simple, rapid and non-toxic. Therefore, salting-out method was the best ideally method to extract the whole genomic DNA from whiteflies.

DNA extraction Bemisia tabaci KAc method Chloroform-isoamylol method Salting-out method Phenol method

2014-01-24

國家自然科學(xué)基金項目（31100269），“973”計劃（2009CB119200），公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201303019）

戴恬美，女，碩士研究生，研究方向：入侵生物學(xué)；E-mail：dai.tian.mei@163.com

萬方浩，男，博士，研究員，研究方向：入侵生物學(xué)；E-mail：wanfanghao@caas.cn