一種烏鱧與斑鱧線粒體PCR-RFLP鑒定方法

董傳舉張松皓陳坤慈宋迎楠徐鵬孫效文

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院生物技術(shù)研究中心，北京 100141；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；3.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)院珠江水產(chǎn)研究所，廣州 510380）

一種烏鱧與斑鱧線粒體PCR-RFLP鑒定方法

董傳舉1，2張松皓1陳坤慈3宋迎楠1，2徐鵬1孫效文1

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院生物技術(shù)研究中心，北京 100141；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；3.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)院珠江水產(chǎn)研究所，廣州 510380）

為了高效的鑒別烏鱧與斑鱧，采用PCR-RFLP技術(shù)，對(duì)烏鱧與斑鱧開(kāi)展分子生物學(xué)鑒定方法研究。通過(guò)比對(duì)烏鱧和斑鱧線粒體全序列，發(fā)現(xiàn)1處單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，可以明確區(qū)分兩個(gè)物種。利用1對(duì)引物對(duì)烏鱧與斑鱧線粒體基因組該區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用限制性內(nèi)切酶EcoR I分別對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，并用1.5%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)酶切結(jié)果。PCR-RFLP檢測(cè)結(jié)果顯示，斑鱧的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物被EcoR I酶切后生成兩個(gè)不同大小的片段，分別為315 bp和875 bp，烏鱧則保持不變。由此可將烏鱧與斑鱧在酶切圖譜上鑒別出來(lái)。

烏鱧 斑鱧 線粒體基因組 PCR-RFLP 鑒定

烏鱧（Channa argus），鱸形目（Perciformes）鱧科（Channidae）鱧屬（Channa）魚(yú)類，俗稱黑魚(yú)，又名北方蛇頭魚(yú)、烏魚(yú)、烏棒、蛇頭魚(yú)、文魚(yú)和才魚(yú)，是我國(guó)特有的名特優(yōu)淡水魚(yú)類，在我國(guó)廣泛分布。烏鱧肉質(zhì)細(xì)嫩，口味鮮美，且營(yíng)養(yǎng)價(jià)值頗高，在國(guó)內(nèi)市場(chǎng)廣受歡迎，目前在我國(guó)被廣泛養(yǎng)殖，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。斑鱧（C.maculata）與烏鱧同屬于鱧科鱧屬，從形態(tài)學(xué)方面與烏鱧類似，從形態(tài)學(xué)鑒定有時(shí)并不一定準(zhǔn)確，存在很強(qiáng)的主觀因素，尤其是在苗種期或者食品加工處理后的區(qū)分和鑒定比較困難。由于消費(fèi)習(xí)慣、養(yǎng)殖環(huán)境、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和養(yǎng)殖成本等原因，烏鱧和斑鱧的市場(chǎng)價(jià)值具有較大差異。鑒于此，亟須開(kāi)發(fā)出能夠快速鑒定烏鱧和斑鱧的分子檢測(cè)技術(shù)，用于市場(chǎng)監(jiān)管、種質(zhì)鑒定等用途。

線粒體DNA（Mitochondrial DNA，mtDNA）作為真核細(xì)胞的核外遺傳因子，復(fù)制方式相對(duì)比較簡(jiǎn)單，遵從嚴(yán)格的母系遺傳，在世代傳遞過(guò)程中不發(fā)生重組現(xiàn)象，并且結(jié)構(gòu)基因排列緊湊，沒(méi)有間隔序列和內(nèi)含子，編碼效率高于核DNA。mtDNA的進(jìn)化速率是核DNA的5-10倍，且缺少有效的DNA損傷修復(fù)機(jī)制，還有突變累加效應(yīng)［1］?？截悢?shù)量多，很容易從組織中分離純化。并且基因片段大小適中，種間進(jìn)化速率較快，對(duì)于探索物種系統(tǒng)發(fā)育極為有效［2］。mtDNA序列的差異可以表明遺傳群體在進(jìn)化過(guò)程中的分離，單倍型頻率可以揭示地理種群間的轉(zhuǎn)移［3］。由于線粒體DNA的這些特點(diǎn)，mtDNA序列也更多地用于研究馴養(yǎng)動(dòng)物的親緣關(guān)系、起源及其多樣性，如兔子、豬、山羊、水牛和馬等［4-9］。PCR-RFLP技術(shù)是最早的分子標(biāo)記技術(shù)之一，指基于限制性內(nèi)切酶消化不同長(zhǎng)度的限制片段的多態(tài)現(xiàn)象在mtDNA分析中廣泛使用，由于擴(kuò)增總DNA，所以可以有效避免純化mtDNA的繁瑣步驟，并且可以通過(guò)PCR方法很好地控制DNA片段大小，酶切位點(diǎn)數(shù)及擴(kuò)大模板量，適用于微量組織樣品的分析。由于該技術(shù)結(jié)果可靠、準(zhǔn)確、具有較高的穩(wěn)定性，并且檢測(cè)中僅需要少量的組織材料，所以適用于對(duì)物種各個(gè)發(fā)育階段的鑒別研究［10］。

鱧科魚(yú)類是一種頗受歡迎的淡水名貴經(jīng)濟(jì)魚(yú)類。我國(guó)是一個(gè)盛產(chǎn)烏鱧的國(guó)家，目前對(duì)烏鱧已進(jìn)行了大量的研究，在行為學(xué)、光照對(duì)其攝食的影響、最適溫度、繁殖特性和苗種培育、生活史、組織器官的發(fā)生和發(fā)育、營(yíng)養(yǎng)需求、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值以及核型分析和雜交育種等各個(gè)方面都有所研究［11-21］。而對(duì)斑鱧的研究報(bào)道相對(duì)少得多，僅見(jiàn)人工繁殖和苗種培育、營(yíng)養(yǎng)需求和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值等方面的研究［22，23］。本研究通過(guò)對(duì)烏鱧與斑鱧的線粒體進(jìn)行比對(duì)分析，找出差異位點(diǎn)，利用PCR-RFLP技術(shù)快速鑒定，旨在為瓊脂糖凝膠電泳酶切產(chǎn)物快速準(zhǔn)確的鑒定烏鱧和斑鱧提供方法。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究利用中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所提供的烏鱧和斑鱧，活體剪取尾鰭一小部分放入1.5 mL離心管中，-80℃保存。儀器與試劑：限制性內(nèi)切酶和PCR試劑均購(gòu)置于NEB（北京）有限公司，引物由生工生物工程公司合成，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。PCR儀為Applied Biosystem 9700（Life Technologies）。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 分別剪取10尾烏鱧和10尾斑鱧的尾鰭各0.5 g，剪碎，放入1.5 mL離心管中并分別編號(hào)：1-10為烏鱧，11-20為斑鱧，應(yīng)用酚/氯仿抽提法提取基因組DNA，乙醇沉淀，-20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研和檢索GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)獲取了烏鱧和斑鱧的線粒體基因組序列［24，25］，兩個(gè)基因組序列編號(hào)分別為JX978723（烏鱧）和KC310861（斑鱧）。應(yīng)用MEGA5.1軟件［26］對(duì)烏鱧和斑鱧線粒體基因組序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，在第3 126 bp位置存在單堿基差異，并且該位點(diǎn)為限制性內(nèi)切酶EcoR I識(shí)別位點(diǎn)。基于此，我們?cè)谠撐稽c(diǎn)兩側(cè)相對(duì)保守區(qū)域，利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物序列，對(duì)包含該單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的線粒體基因組序列區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。

1.2.3 線粒體DNA的PCR擴(kuò)增 提取的線粒體DNA使用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為20 μL：0.5 μL 濃度為2 500 U/mL的TaqDNA聚合酶，2 μL 10×PCR緩沖液，3.2 μL濃度為10 pm/μL的dNTPs，1 μL所述基因組DNA，0.5 μL濃度為10 pm/μL的上游引物No.1，0.5 μL濃度為10 pm/μL的下游引物No.2，12.3 μL無(wú)菌水。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)為：94℃預(yù)變性 5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 限制性內(nèi)切酶EcoR I的酶切反應(yīng) 所述酶切反應(yīng)體系為20 μL：2 μL 上述PCR產(chǎn)物，2 μL 10×酶切緩沖液，1 μL濃度為20 000 U/mL 的EcoR I限制性內(nèi)切酶，15 μL無(wú)菌水，所述酶切反應(yīng)體系在37℃反應(yīng)30 min，獲得酶切產(chǎn)物。

1.2.5 瓊脂糖凝膠電泳 將PCR產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，瓊脂糖凝膠濃度為1.5%，電泳結(jié)束后，用凝膠圖像處理系統(tǒng)采集電泳圖，收集數(shù)據(jù)并分析。

2 結(jié)果

2.1 序列比對(duì)結(jié)果和引物設(shè)計(jì)

應(yīng)用MEGA5.1軟件對(duì)烏鱧和斑鱧的線粒體基因組序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)烏鱧與斑鱧的線粒體DNA在第3 126 bp位置存在單核苷酸多態(tài)性。而在斑鱧中，該位置位于限制性內(nèi)切酶EcoR I識(shí)別位點(diǎn)區(qū)域（第3 122 bp和第3 123 bp堿基之間的磷酸二酯鍵為限制性內(nèi)切酶EcoR I酶切位點(diǎn)）；由于單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的差異，烏鱧無(wú)限制性內(nèi)切酶EcoR I酶切位點(diǎn)（圖1），故可以通過(guò)限制性內(nèi)切酶EcoR I對(duì)上述擴(kuò)增片段進(jìn)行酶切，從而對(duì)烏鱧與斑鱧進(jìn)行區(qū)分和鑒別。

通過(guò)Primer5.0設(shè)計(jì)引物（表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可以得到線粒體基因組2 807-3 997 bp之間的區(qū)域。該擴(kuò)增片段位于線粒體DNA的tRNA-Leu和tRNAGln之間，包括部分tRNA-Leu和tRNA-Gln區(qū)域以及全部NADH dehydrogenase subunit I區(qū)域和tRNAIle區(qū)域，酶切位點(diǎn)位于NADH dehydrogenase subunit I上。

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

通過(guò)上述引物的PCR擴(kuò)增，烏鱧與斑鱧線粒體DNA均擴(kuò)增出單一的片段，未發(fā)現(xiàn)其片段長(zhǎng)度多態(tài)性，如圖2所示。

2.3 酶切結(jié)果分析

限制性內(nèi)切酶EcoR I酶切結(jié)果，如圖3所示。

將圖2和圖3進(jìn)行比較，可見(jiàn)圖2中烏鱧樣本（1-10）的條帶經(jīng)過(guò)酶切后在圖3中（1'-10'）沒(méi)有發(fā)生變化，說(shuō)明沒(méi)有發(fā)生酶切，圖2中斑鱧樣本（11-20）的條帶位置和數(shù)量在圖3中（11'-20'）發(fā)生了變化，說(shuō)明發(fā)生了酶切反應(yīng)。上述酶切位點(diǎn)為距離斑鱧擴(kuò)增多核苷酸序列5'的第315和第316個(gè)堿基之間的磷酸二酯鍵，而所述烏鱧擴(kuò)增多核苷酸序列5'的第315和第316個(gè)堿基之間的磷酸二酯鍵不會(huì)發(fā)生酶切。所以通過(guò)酶切反應(yīng)，將斑鱧所述PCR產(chǎn)物（1 190 bp）包含的DNA分子切成了兩段

DNA分子，大小分別為315 bp和875 bp（表2）。

3 討論

基于線粒體序列開(kāi)發(fā)高效準(zhǔn)確的分子鑒定方法也廣泛應(yīng)用于對(duì)許多水產(chǎn)品易混物種的鑒定中。例如，Aoyama等［27］利用線粒體DNA的PCR-RFLP技術(shù)開(kāi)發(fā)了歐洲鰻鱺和亞洲鰻鱺的快速鑒定方法；Karaiskou等［28］利用線粒體DNA的PCR-RFLP技術(shù)對(duì)竹莢魚(yú)屬3個(gè)種進(jìn)行了成功的分子鑒定等；莊怡等［29］利用PCR-RFLP技術(shù)對(duì)鯽魚(yú)6個(gè)不同品系成功的進(jìn)行鑒定；王淞等［30］對(duì)3個(gè)長(zhǎng)江野生群體以及一個(gè)人工繁殖群體，共158尾鰱mtDNA D-loop區(qū)段進(jìn)行PCR-RFLP分析，從而鑒定4個(gè)不同群體的差異；吳海防等［31］采用PCR技術(shù)對(duì)江西瑞昌、湖南長(zhǎng)沙、天津?qū)幒?個(gè)群體的144尾草魚(yú)線粒體DNA（mtDNA）D-Loop區(qū)段的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）進(jìn)行了分析，得出草魚(yú)mtDNA D-Loop區(qū)段的遺傳多樣性較低的結(jié)論；文菁等［32］基于570 bp左右的線粒體16S rRNA基因片段，利用3種核酸內(nèi)切酶（DdeI，HaeIII和StyI）對(duì)16種海參PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，分別產(chǎn)生10種、5種和5種單倍型，通過(guò)單倍型的組合，即能有效區(qū)分16種海參的種類。

僅依據(jù)形態(tài)學(xué)鑒定并不能準(zhǔn)確區(qū)分烏鱧與斑鱧，從而造成相互混雜，直接影響育種效果。烏鱧與斑鱧mtDNA的結(jié)構(gòu)十分簡(jiǎn)單，并且與其它脊椎動(dòng)物的線粒體基因基本相同［33］：一個(gè)mtDNA控制區(qū)（D -Loop區(qū)），13個(gè)蛋白質(zhì)基因，其中一個(gè)是細(xì)胞色素b基因（cyt b）；兩個(gè)是ATP酶亞基的基因（ATPase6, ATPase 8）；3個(gè)是細(xì)胞色素氧化酶的基因（CO I、CO II和CO III）；7個(gè)是呼吸鏈NADH脫氫酶亞基的基因（ND1-6和ND4L），有兩個(gè)rRNA基因，一個(gè)是12S rRNA，一個(gè)是16S rRNA，22個(gè)tRNA基因。因此，本研究利用斑鱧和烏鱧純種資源，通過(guò)線粒體序列的比對(duì)分析，發(fā)掘斑鱧和烏鱧的特異性多態(tài)性標(biāo)簽，開(kāi)發(fā)一種基于PCR-RFLP技術(shù)的快速種質(zhì)鑒別方法。

烏鱧與斑鱧線粒體PCR-RFLP鑒定方法表明：提取待檢測(cè)樣本的DNA，設(shè)計(jì)一對(duì)相同的引物就可以擴(kuò)增出烏鱧與斑鱧的mtDNA片段，并且根據(jù)該區(qū)域mtDNA的一個(gè)SNP位點(diǎn)的不同，通過(guò)限制性內(nèi)切酶EcoR I進(jìn)行酶切，由于斑鱧在該區(qū)域具有限制性內(nèi)切酶EcoR I酶切位點(diǎn)，所以酶切后生成特異的兩條帶；而烏鱧在該區(qū)域不具有酶切位點(diǎn)，故酶切后仍為一條帶，從而瓊脂糖凝膠電泳后便可以把烏鱧與斑鱧鑒別出來(lái)。本方法通過(guò)PCR擴(kuò)增片段的限制性酶切，得到的限制性酶切圖譜，不但為烏鱧與斑鱧的鑒定提供了分子標(biāo)記，同時(shí)也為進(jìn)一步構(gòu)建物理圖譜，進(jìn)化遺傳學(xué)和育種研究打下了基礎(chǔ)；更有利于實(shí)際生產(chǎn)部門(mén)，科研部門(mén)快速鑒定所取樣本，提高了工作效率。

該方法不僅操作簡(jiǎn)單，而且在保證魚(yú)種存活基礎(chǔ)上只需剪取少量鰭條，或者采集少許冷凍魚(yú)肉或魚(yú)糜提取DNA，便可快速準(zhǔn)確的鑒別出烏鱧和斑鱧，鑒定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，在群體遺傳學(xué)、分子生態(tài)學(xué)和水產(chǎn)品質(zhì)量鑒定等方面均有較大的應(yīng)用前景。

4 結(jié)論

本研究利用烏鱧和斑鱧線粒體之間的差異，設(shè)計(jì)引物對(duì)包含該差異位點(diǎn)的區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。對(duì)擴(kuò)增片段應(yīng)用限制性內(nèi)切酶EcoR I酶切，并對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。電泳結(jié)果中，電泳條帶為一條的為烏鱧，兩條的為斑鱧。根據(jù)條帶的數(shù)量，便可以鑒定出烏鱧與斑鱧。

［1］張四明, 吳清江, 張亞平, 等. 中華鱘（Acipensersinensis）及相關(guān)種類的mtDNA控制區(qū)串聯(lián)重復(fù)序列及其進(jìn)化意義［J］. 中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào), 2000, 16（4）：458-461.

［2］Raghava GP, Solanki RJ, Soni V, et al. Fingerprinting method for phylogenetic classification and indentification of microorganisms based on variation in 16S rRNA gene sequences［J］. Biotechniques, 2000, 29（1）：108-112, 114-116.

［3］Moritz C. Applications of mitochondrial DNA analysis in conservation：a critical review［J］. Molecular Ecology, 1994, 3（4）：401-411.

［4］Kierstein GM, Vallinoto M, Silva A, et al. Analysisi of mitochondrial D-loop region casts new light on domestic water buffalo（Bubalus bubalis）phylogeny［J］. Molecular Phylogenetics and Evolution, 2004, 30（2）：308-324.

［5］Kim KL, Lee JH, Li K, et al. Phylogenetic relationships of Asian and European pig breeds determined by mitochondrial DNA D-loop sequence polymorphism［J］. Animal Genetics, 2002, 33（1）：19-25.

［6］Kim KL, Yang YH, Lee SS, et al. Phylogenetic relationships of Cheju horses to other horse breeds as determined by mtDNA D-loop sequence polymorphism［J］. Animal Genetics, 1999, 30（2）：102-108.

［7］Long JR, Qiu XP, Zeng FT, et al. Origin of the rabbit（Oryctolagus cuniculus）in China：evidence from mitochondrial DNA control region sequence analysis［J］. Animal Genetics, 2003, 34（2）：82-87.

［8］Joshi MB, Rout PK, Mandal AK, et al. Phylogeography and origin of Indian domestic goats［J］. Molecular Biology and Evolution, 2004, 21（3）：454-462.

［9］Wang ZP, Jayasanka P, Khoo SK, et al. AFLP fingerprinting reveals genetic variability in common carp stocks from in-donesia［J］. Asian Fisheries Science, 2000, 13：139-147.

［10］王強(qiáng), 劉芳, 郝崇波, 等. 4種海水魚(yú)線粒體 DNA大片段的PCR-RFLP分析［J］. 水產(chǎn)科學(xué), 2006（5）：246-249.

［11］Karaiskou N, Apostolidis AP, Triantafyllidis A, et al. Genetic identification and phylogeny of three species of the genus Trachurus based on mitochondrial DNA analysis［J］. Marine Biotechnology, 2003, 5（5）：493-504.

［11］聶國(guó)興, 傅艷茹, 張浩, 等. 烏鱧肌肉營(yíng)養(yǎng)成分分析［J］. 淡水漁業(yè), 2002, 32（2）：46-47.

［12］謝從新, 熊傳喜, 周潔, 等. 烏鱧仔魚(yú)攝食和消化器官的發(fā)育及其選食行為［J］. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)報(bào), 1997, 16（5）：399-407.

［13］謝從新, 熊傳喜, 周潔, 等. 不同光照強(qiáng)度下烏鰭幼魚(yú)的攝食強(qiáng)度及動(dòng)力學(xué)［J］. 水生生物學(xué)報(bào), 1997, 21（3）：213-221.

［14］周潔, 謝從新, 熊傳喜, 等. 烏鱧仔魚(yú)攝食節(jié)律和日攝食率的初步研究［J］. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 1996, 15（1）：64-66.

［15］魏開(kāi)建, 謝從新, 楊英, 等. 烏鱧早期視網(wǎng)膜發(fā)育的初步研究［J］. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)報(bào), 1997, 16（5）：408-412.

［16］劉家壽, 崔奕波, 劉建康. 鱖和烏鱧最適溫度的研究［J］. 水生生物學(xué)報(bào), 2002, 26（5）：433-436.

［17］陳文銀, 張克儉. 烏鱧卵巢發(fā)育的組織學(xué)［J］. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 2003, 27（2）：183-186.

［18］曹振杰, 楊玲, 鞏俊霞. 烏鱧對(duì)蛋白質(zhì)、脂肪、糖類、混合無(wú)機(jī)鹽的適宜需求量的初步研究［J］. 內(nèi)陸水產(chǎn), 2001, 8：12-14.

［19］Qin JG, Fast AW. Size and feed dependent cannibalism with juvenile snakehead Channa striatus［J］. Aquaculture, 1996, 144：313-320.

［20］Qin JG, Fast AW, De Anda D, et al. Growth and survival of larval snakehead fed different diets［J］. Aquaculture, 1997, 148：105-113.

［21］秦偉, 倪建國(guó), 張學(xué)斌, 等. 烏鱧及鱧科魚(yú)類染色體組型的比較研究［J］. 水利漁業(yè), 2004, 24（5）：14-16.

［22］楊四秀, 蔣艾青. 斑鱧的含肉率及肌肉營(yíng)養(yǎng)成分分析［J］. 河北漁業(yè), 2007（12）：10-12.

［23］陳家友. 斑鱧人工繁殖的初步研究［J］. 集美大學(xué)學(xué)報(bào), 2001, 6（3）：204-208.

［24］ Zhu SR, Ma KY, Xing ZJ, et al. The complete mitochondrial genome of Channa argus, Channa maculate and hybrid snakehead fish［Channa maculata（female symbol）× Channa argus（male symbol）］［J］. Mitochondrial DNA, 2013, 24（3）：217-218.

［25］ Wang K, Wang B, Li J, et al. The complete mitochondrial genome of Channa maculate（Perciformes：Channidae）［J］. Mitochondrial DNA, 2013, 24（4）：362-364.

［26］ Tamura K, Peterson D, Peterson N, et al. MEGA5：molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods［J］. Molecular Biology and Evolution, 2011, 28：2731-2739.

［27］ Aoyama J, Watanabe S, Nishida M, et al. Discrimination of catadromous eel species, genus Anguilla, using PCR-RFLP analysis of the mitochondrial 16SrRNA domain［J］. Trans Am Fish Soc, 2000，129（3）：873-878.

［28］ Karaiskou N, Apostolidis AP, Triantafyllidis A, et al, Genetic identification and phylogeny of three species of the genus Trachurus based on mitochondrial DNA analysis［J］. Marine Biotechnology, 2003, 5（5）：493-504.

［29］ 莊怡, 劉必謙, 唐杰. 利用PCR-RFLP技術(shù)對(duì)鯽魚(yú)6個(gè)不同品系的鑒定［J］. 生物技術(shù)通報(bào), 2012（11）：144-149.

［30］ 王淞, 曹曉霞, 谷口順彥, 董仕.4個(gè)群體鰱mtDNA D-loop的PCR-RFLP分析［J］.淡水漁業(yè), 2010, 40（4）：4-9.

［31］ 吳海防, 董仕, 單淇, 谷口順彥.3個(gè)群體草魚(yú)mtDNA D-Loop的PCR-RFLP分析［J］. 水產(chǎn)科學(xué), 2006, 25（4）：184-188.

［32］ 文菁, 胡超群, 張呂平, 等. 16種商品海參16S rRNA的PCRRFLP鑒定方法［J］.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué), 2011, 18（2）：451-457.

［33］ Miya M, Kawagchi A, Nishida M. Mitogenomic exploration of higher teleostean phylogenies：a case study formoderatescale evolutionary genomics with 38 newly determined complete mitochondrial DNA sequences［J］. Molecular Biology And Evolution, 2001, 18（11）：1993-2009.

（責(zé)任編輯 狄艷紅）

A PCR-RFLP Method for Channa argus and Channa maculate Discrimination

Dong Chuanju1，2Zhang Songhao1Chen Kunci3Song Yingnan1，2Xu Peng1Sun Xiaowen1
（1. The Centre for Applied Aquatic Genomics，Chinese Academy of Fishery Sciences，Beijing 100141；2. College of Life Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306；3. Pearl River Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Guangzhou 510380）

In order to identificate Channa argus and C. maculate efficiently. We developed a PCR-RFLP method to conduct research in molecular biology. Briefly, two genomes of C. argus and C. maculate were aligned and compared, a SNP was identified which can discriminate two Channa species. A pair of primers was designed to amplify the mitochondrial DNA of both species, then digested by restriction enzyme EcoR I and test the digestion result by agarose gel of 1.5%. The result showed that the PCR product of C. maculate was digested by EcoR I that generate two fragments of 315 bp and 875 bp, while the PCR product of C. argus can not be digested by EcoR I. Thus, two Channa species were clearly discriminated.

Channa argus Channa maculate mtDNA PCR-RFLP Identification

2014-01-03

國(guó)家“863計(jì)劃”項(xiàng)目（2011AA100401），農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)科研專項(xiàng)項(xiàng)目（200903045）

董傳舉，男，博士研究生，研究方向：水產(chǎn)基因組學(xué)；E-mail：cjd1989@126.com

徐鵬，男，研究員，研究方向：水產(chǎn)基因組學(xué)；E-mail：xupeng@cafs.ac.cn