小RNA病毒3C蛋白酶及其裂解底物

劉艷李冰清孟紅

（1.山東省醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所微生物學研究室，濟南 250000；2.濟南大學 山東省醫(yī)學科學院醫(yī)學與生命科學學院，濟南 250022）

小RNA病毒3C蛋白酶及其裂解底物

劉艷1，2李冰清1孟紅1

（1.山東省醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所微生物學研究室，濟南 250000；2.濟南大學 山東省醫(yī)學科學院醫(yī)學與生命科學學院，濟南 250022）

小RNA病毒科是一類大的動物病毒科，小RNA病毒蛋白的合成需要自身蛋白酶裂解形成多個結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白，3C蛋白酶是一些小RNA病毒的自身蛋白水解酶之一，3C蛋白酶還可以裂解一些宿主的蛋白，利于病毒的復制。3C蛋白酶結(jié)構(gòu)特點、活性中心、酶切位點如何，裂解的底物功能怎樣，是進一步了解3C蛋白酶作用機制的關鍵。就這些問題進行綜述。

小RNA病毒 3C蛋白酶 裂解底物

小RNA病毒科包含5個屬：腸道病毒屬、鼻病毒屬、心病毒屬、口蹄疫病毒屬和肝病毒屬。小RNA病毒含有開放性讀碼框架，指導病毒利用宿主蛋白合成系統(tǒng)轉(zhuǎn)編碼一個大的多聚蛋白，經(jīng)過自身蛋白酶的切割，將蛋白前體水解為4個衣殼蛋白和多個功能蛋白。3C蛋白就是一些小RNA病毒的自身蛋白水解酶之一，它雖然不直接參與病毒RNA的復制，但是它對多種前體蛋白的正確水解有力的保證了衣殼的形成和病毒的復制。3C蛋白酶不僅裂解自身蛋白，也可以裂解宿主的細胞內(nèi)的蛋白，包括一些轉(zhuǎn)錄因子、翻譯因子、固有免疫信號分子及細胞的骨架蛋白，能夠抑制宿主蛋白的合成或功能的發(fā)揮、保證病毒的復制，還能使病毒逃避宿主的固有免疫，細胞骨架蛋白的重組有利于病毒的擴散及釋放。據(jù)文獻報道，3C蛋白存在于以下小RNA病毒中，如腸道病毒71型（Enterovirus 71，EV71）、脊髓灰質(zhì)炎病毒（Poliovirus，PV）、柯薩奇病毒（Coxsackievirus，CV）、人鼻病毒（Human rhinovirus，HRV）、腦心肌炎病毒（Encephalo myocarditis virus，ECMV）、口蹄疫病毒（Foot and mouth disease virus，F(xiàn)MV）、甲肝病毒（Hepatitis A virus，HAV）等。在以上病毒中，3C蛋白酶結(jié)構(gòu)特點、活性中心、酶切位點如何，裂解的底物的名稱及功能怎樣，是進一步了解3C蛋白酶作用機制的關鍵。以下就這些問題進行綜述。

1 3C蛋白酶的特點

小RNA病毒的3C蛋白酶是分子量約為20 kD的蛋白酶。氨基酸鏈先形成6個β折疊片，進而折疊成2個β折疊桶的結(jié)構(gòu)域（Domain），底物結(jié)合存在于這兩個domain結(jié)合的凹槽中。3C蛋白酶是具有S（絲氨酸）/C（半胱氨酸）性質(zhì)的蛋白酶，它們都是以Cys-His為活性中心，主要區(qū)別在于活性中心第3個氨基酸不同。其中，EV71、CVB、PV、HRV的活性中心是Cys-His-Glu，HAV的活性中心是Cys-His-Tyr，F(xiàn)MDV的活性中心是Cys-His-Asp，3C蛋白酶的結(jié)構(gòu)和活性中心，如圖1所示［1-9］。

2 3C蛋白酶裂解的底物

2.1 3C蛋白酶裂解的底物介紹

已有文獻報道3C裂解的宿主底物有近19種，這些底物多為轉(zhuǎn)錄和翻譯過程中的轉(zhuǎn)錄因子、翻譯因子及固有免疫信號通路中的某些關鍵蛋白，還涉及到一種細胞骨架蛋白。

2.1.1 轉(zhuǎn)錄因子 真核生物在轉(zhuǎn)錄的起始階段，需要RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ依賴于轉(zhuǎn)錄因子與啟動子結(jié)合，形成轉(zhuǎn)錄起始復合物。TBP、TFⅡD、PARP、TFⅢC分別是RNA聚合酶Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ的轉(zhuǎn)錄因子，據(jù)文獻報道，PV的3C裂解上述轉(zhuǎn)錄因子，阻止轉(zhuǎn)錄復合物的形成，進而影響宿主蛋白的合成［10-13］。H3作為真核生物染色體的基本結(jié)構(gòu)蛋白，組蛋白的乙酰化修飾能招募RNA聚合酶Ⅱ到啟動子上輔助RNA轉(zhuǎn)錄，Tesar等［14］研究發(fā)現(xiàn)FMDV的3C裂解H3，導致宿主轉(zhuǎn)錄的關閉。Oct-1也是一個負性調(diào)節(jié)DNA依賴的基因轉(zhuǎn)錄、RNA聚合酶III啟動子的轉(zhuǎn)錄因子。有研究發(fā)現(xiàn)，PV的3C能裂解Oct-1，機制是Qct-1-DNA復合物丟失Oct-1，Oct-1結(jié)合到SV40B增強子的八聚體上，抑制SV40B增強子的轉(zhuǎn)錄激活、Sph介導的下游TATA啟動子等轉(zhuǎn)錄［15］。CREB能與結(jié)合在啟動子和增強子的cAMP反應元件結(jié)合，作為一種轉(zhuǎn)錄增強子，PV的3C裂解CREB，使其喪失了結(jié)合DNA和轉(zhuǎn)錄活性，RNA聚合酶II等轉(zhuǎn)錄受到抑制［16，17］。眾所周知，P53是一個細胞癌抑制基因，它也作用于RNA多聚酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄，Weidman等［18］研究報道，P53是3C的間接裂解產(chǎn)物，P53的裂解不僅導致轉(zhuǎn)錄的關閉，還導致凋亡的延遲，有利于確保病毒顆粒的加工和釋放。

2.1.2 mRNA的加工因子 真核生物在mRNA的加工過程中涉及到5'端加帽、3'端加尾、mRNA前體的剪切及編輯。CstF64與3'末端的polyA尾斷裂有關，Weng等［19］研究發(fā)現(xiàn)EV71的3C裂解此蛋白抑制了宿主的多聚腺苷酸化，mRNA的加尾信號受到影響。FBP2是宿主細胞中含有內(nèi)部核糖體進入位點（Internal ribosome entry site，IRES）的反式作用因子，也具有mRNA的剪切功能，IRES是EV71翻譯的起始位點，F(xiàn)BP2能下調(diào)病毒的IRES活動［20］。Chen等［21］研究發(fā)現(xiàn)，EV71的3C裂解掉FBP2的C端，導致FBP2不能發(fā)揮原有的負向調(diào)節(jié)功能，反而將FBP2變?yōu)檎蛘{(diào)節(jié)功能，此裂解過程有力的保證了IRES有效指導病毒基因組翻譯的功能發(fā)揮。

2.1.3 翻譯因子 真核生物的翻譯起始階段是先形成起始復合物，起始復合物的形成需要eIF2（GTP結(jié)合蛋白）、eIF4A（依賴于RNA的ATP酶）、eIF4G（起連接組合作用的亞基）、eIF4E（帽結(jié)合蛋白）和PABP等幫助下形成40S亞基-Met-tRNAiMet復合物，沿著mRNA向3'端方向滑動掃描。eIF5是ATP水解酶，它還促使eIF2和eIF3從核糖體40S亞基解離，隨后60S核糖體亞基與40S-mRNA-Met-tRNAiMet結(jié)合形成80S起始復合物，起始蛋白的合成。

目前有很多關于小RNA病毒，如FMDV、HRV、CVB3的3C裂解一些翻譯因子，如eIF5B、eIF4GⅠ、eIF4AⅠ及PABP的報道。Li等［22］報道，F(xiàn)MDV 3C裂解eIF4AⅠ，影響eIF4AⅠ的ATPase功能的發(fā)揮，阻礙了其ATP結(jié)合活動和解旋酶活動。Strong等報道FMDV 3C裂解了eIF4G不僅抑制了蛋白合成，且eIF4G的C端的片段裂解下來后能與病毒的IRES結(jié)合，可用于指導病毒的翻譯［23，24］。PV、CVB、HRV的3C將eIF5B的N端和中央GTPase及C端的domain裂解，不僅導致eIF5B在核糖體亞基中GTP依賴的活動受抑制，還影響它與48S復合物的結(jié)合和從組裝好的80S核糖體的釋放［25］。Kuyumcu-Martinez 等［26-28］發(fā)現(xiàn)，EV和杯狀病毒的3C裂解PABP，關閉了宿主的翻譯過程，作者將裂解位點定位于C端。Zhang等［29］研究認為，3C裂解PABP，由于PABP的N端的裂解產(chǎn)物含有IRES的負向調(diào)節(jié)組分，因而抑制了HAV的IRES介導的帽依賴的翻譯。Bonderoff 等［30］也指出，PABP能與PV的PolyA 尾結(jié)合，刺激IRES依賴的翻譯，3C裂解PABP將導致病毒丟失這種刺激IRES翻譯的功能，影響病毒RNA復制的起始。2012年，Kobayashi等［31］鑒定出EMCV的3C 裂解PABP位點位于Q437G。

2.1.4 固有免疫信號分子 3C還裂解固有免疫的信號分子，如TRIF、IRF7，NEMO和MAVS等，減少了Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生，使病毒逃避宿主固有免疫。Lei等［32］發(fā)現(xiàn)，EV71的3C通過裂解TRIF削弱Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生，抑制TLR3介導的抗病毒反應，其裂解位點位于N端Q312S，此位置的附近是腫瘤壞死因子受體相關因子6（Tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6） 結(jié) 合 區(qū)域。NEMO是眾多信號通路的泛素聯(lián)結(jié)分子，Wang等［33］發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MDV的3C將其C端鋅指結(jié)構(gòu)裂解下來，抑制了干擾素等產(chǎn)生。MAVS是定位于線粒體內(nèi)膜上的抗病毒蛋白，N端CARD結(jié)構(gòu)域和RIG-I的CARD結(jié)構(gòu)域結(jié)合，傳遞下游信號。研究報道CVB 3C裂解MAVS的脯氨酸豐富區(qū)和TRIF，影響I型IFN產(chǎn)生［34］。EV71的3C還可以直接裂解IFR7，使得病毒逃避了宿主的固有免疫［35］。

2.1.5 細胞骨架蛋白 3C蛋白裂解一種細胞骨架蛋白MAP4。MAP4在微管的滑行、有絲分裂紡錘體的定向和組織、細胞分化中起作用。Joachims等［36］研究PV的3C蛋白酶介導MAP4的裂解，使得細胞骨架重組，有利于增加細胞溶解，病毒釋放。

2.2 3C裂解宿主底物和自身底物的特點

2.2.1 3C裂解宿主底物的特點 宿主底物現(xiàn)在已知有明確裂解位點的宿主底物有11種，如表1所示。分析裂解位點，很容易發(fā)現(xiàn)3C切割的位點具有特異性，EV71、PV、CVB3、EMCV和HRV的特異裂解位點都位于Q-G/S之間，切割位點前第4位氨基酸大部分是A。而FMDV的裂解位點位于Glu-Val/Pro、Gln-Arg、Leu-Ala之間?？梢姡珽V71與FMDV差別較大。EV71與PV、CVB3、EMCV、FMDV、HRV和HAV的3C蛋白的同源性，分別為：72%、57%、99%、40%、62%和50%，與EV71的3C蛋白同源性最高的是EMCV，最低的是FMDV，這也恰好解釋了EV與FMDV的裂解位點差別最大的現(xiàn)象。

2.2.2 3C蛋白酶裂解自身底物的特點 那么3C裂解自身的蛋白是否也是集中于以上幾個位點，表2列出差別較大的EV71和FMDV的3C裂解的自身蛋白的序列，EV71的自身裂解位點仍舊是Q-G/S，而FMDV的自身裂解位點則集中于E-G/S/T或者Q-L/I/T。目前還未明確裂解位點的底物有8種，大部分報道是有關腸道病毒屬的3C蛋白裂解底物，如表3所示。

3 總結(jié)

小RNA病毒感染給國民生命財產(chǎn)安全和畜牧業(yè)發(fā)展帶來的重大損害不容忽視，EV71、PV、EMCV等病毒感染機體后嚴重者可導致引起神經(jīng)系統(tǒng)的并發(fā)癥；HRV常常是病毒性感冒的病原體之一；FMDV是引起口蹄疫的主要病原體。3C蛋白酶存在于小RNA病毒科的上述多個病毒屬中，尤其裂解宿主蛋白的功能對于抑制宿主蛋白的合成和功能發(fā)揮、保證病毒蛋白有效翻譯、逃避固有免疫的監(jiān)控，病毒顆粒的穿入和釋放中有重要的意義。雖然仍有一些3C裂解的宿主蛋白尚未被發(fā)現(xiàn)特異的裂解位點，如FBP2、MAVS、PARP、TFⅢC、TFⅡD、CREB、Oct-1、MAP4，這些蛋白需要我們進一步通過體內(nèi)外實驗驗證3C蛋白與它們的裂解關系是直接的還是間接的，并尋找出裂解的特異位點，但是3C蛋白酶作為病毒自身蛋白和宿主多個蛋白的關鍵蛋白水解酶，在小RNA病毒致病機制中的意義是不容置疑的。作為小RNA病毒中的眾多病毒屬中的共同蛋白水解酶，研究抑制3C蛋白酶的藥物應用前景廣闊?？梢灶A見的是，3C蛋白酶的研究將會在重大病毒性疾病的攻克方面，如手足口病、口蹄疫、病毒性心肌炎、甲型肝炎、病毒性感冒、病毒性咽峽炎等有重要的指導價值。相信在未來的發(fā)展中，小RNA病毒的蛋白酶學研究領域和應用前景將更加廣泛和深入。

［1］Cui S, Wang J, Fan T, et al. Crystal structure of human enterovirus 71 3C protease［J］. J Mol Biol, 2011, 408（3）：449-461.

［2］Qiu J. Enterovirus 71 infection：a new threat to global public health［J］. Lancet Neurol, 2008, 7：868-869.

［3］秦咸蘊, 林霖, 楊燕, 等. EV71 非結(jié)構(gòu)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能及其為靶點的藥物研究進展［J］. 藥學學報, 2011, 46（7）：753-761.

［4］Li ML, Hsu TA, Chen TC, et al. The 3C protease activity of enterovirus 71 induces human neural cell apoptosis［J］. Virology, 2002, 293（2）：386-395.

［6］ Wang QM. Protease inhibitors as potential antiviral agents for the treatment of picornaviral infections［M］. Birkh?user Basel：Antiviral Agents， 2001：229-253.

［7］ 周建華, 叢國正, 高閃電, 等.口蹄疫病毒株OA/583C蛋白酶的結(jié)構(gòu)模擬和功能分析［J］. 華北農(nóng)學報, 2007, 22（6）：9-13.

［8］ Parks GD, Baker JC, Palmenberg AC. Proteolytic cleavage of encephalomyocarditis virus capsid region substrates by precursors to the 3C enzyme［J］. J Virol, 1989, 63（3）：1054-1058.

［9］Lu G, Qi J, Chen Z, et al. Enterovirus 71 and coxsackievirus A16 3C proteases：binding to rupintrivir and their substrates and anti-hand, foot, and mouth disease virus drug design［J］. Journal of Virology, 2011, 85（19）：10319-10331.

［10］Kundu P, Raychaudhuri S, Tsai W, et al. Shutoff of RNA polymerase II transcription by poliovirus involves 3C proteasemediated cleavage of the TATA-binding protein at an alternative site：incomplete shutoff of transcription interferes with efficient viral replication［J］. J Virol, 2005, 79（15）：9702-9713.

［11］Nakajima N, Horikoshi M, Roeder RG. Factors involved in specific transcription by mammalian RNA polymerase II：purification, genetic specificity, and TATA box-promoter interactions of TFIID［J］. Mol Cell Biol, 1988, 8（10）：4028-4040.

［12］ Calandria C, Irurzun A, Barco á, et al. Individual expression of poliovirus 2A pro and 3C pro induces activation of caspase-3 and PARP cleavage in HeLa cells［J］. Virus Res, 2004, 104（1）：39-49.

［13］ Clark ME, H?mmerle T, Wimmer E, et al. Poliovirus proteinase 3C converts an active form of transcription factor IIIC to an inactive form：a mechanism for inhibition of host cell polymerase III transcription by poliovirus［J］. EMBO J, 1991, 10（10）：2941.

［14］ Tesar M, Marquardt O. Foot-and-mouth disease virus protease 3C inhibits cellular transcription and mediates cleavage of histone H3［J］. Virology, 1990, 174（2）：364-374.

［15］ Yalamanchili P, Weidman K, Dasgupta A. Cleavage of transcriptio-nal activator Oct-1 by poliovirus encoded protease 3Cpro［J］. Virology, 1997, 239（1）：176-185.

［16］ Kliewer S, Muchardt C, Gaynor R, Dasgupta A. Loss of a phosphorylated form of transcription factor CREB/ATF in poliovirus-infected cells［J］. J Virol, 1990, 64（9）：4507-4515.

［17］ Yalamanchili P, Datta U, Dasgupta A. Inhibition of host cell transcription by poliovirus：cleavage of transcription factor CREB by poliovirus-encoded protease 3Cpro［J］. Journal of Virology, 1997, 71（2）：1220-1226.

［18］ Weidman MK, Yalamanchili P, Ng B, et al. Poliovirus 3C proteasemediated degradation of transcriptional activator p53 requires a cellular activity［J］. Virology, 2001, 291（2）：260-271.

［19］ weng KF, Li ML, Hung CT, et al. Enterovirus 71 3C protease cleaves a novel target CstF-64 and inhibits cellular polyadenylation［J］. PLoS Pathogens, 2009, 5（9）：e1000593.

［20］ Lin JY, Li ML, Shih SR. Far upstream element binding protein 2 interacts with enterovirus 1 internal ribosomal entry site and negatively regulates viral translation［J］. Nucleic Acids Res, 2009, 37：47-59.

［21］ Chen LL, Kung YA, Weng KF, et al. Enterovirus 71 infection cleaves a negative regulator for viral internal ribosomal entry sitedriven translation［J］. J Virol, 2013, 87（7）：3828-3838.

［22］ Li W, Ross-Smith N, Proud CG, et al. Cleavage of translation initiation factor 4AI（eIF4AI）but not eIF4AII by foot-and-mouth disease virus 3C protease：identification of the eIF4AI cleavage site［J］. FEBS Letters, 2001, 507（1）：1-5.

［23］ Belsham GJ, McInerney GM, Ross-Smith N. Foot-and-mouth disease virus 3C protease induces cleavage of translation initiation factors eIF4A and eIF4G within infected cells［J］. Journal of Virology, 2000, 74（1）：272-280.

［24］ Strong R, Belsham GJ. Sequential modification of translation initiation factor eIF4GI by two different foot-and-mouth disease virus proteases within infected baby hamster kidney cells：identification of the 3Cpro cleavage site［J］. Journal of General Virology, 2004, 85（10）：2953-2962.

［25］Breyne S, Bonderoff JM, Chumakov KM, et al. Cleavage of eukaryotic initiation factor eIF5B by enterovirus 3C proteases［J］. Virology, 2008, 378（1）：118-122.

［26］Kuyumcu-Martinez NM, Joachims M, Lloyd RE. Efficient cleavage of ribosome-associated poly（A）-binding protein by enterovirus 3C protease［J］. Journal of Virology, 2002, 76（5）：2062-2074.

［27］Kuyumcu-Martinez M, Belliot G, Sosnovtsev SV, et al. Calicivirus 3C-like proteinase inhibits cellular translation by cleavage of poly（A）-binding protein［J］. J Virol, 2004, 78（15）：8172-8182.

［28］Kuyumcu-Martinez NM, Van Eden ME, Younan P, et al. Cleavage of poly（A）-binding protein by poliovirus 3C protease inhibits host cell translation：a novel mechanism for host translation shutoff［J］. Mol Cell Biol, 2004, 24（4）：1779-1790.

［29］Zhang B, Morace G, Gauss-Muller V, Kusov Y. Poly（A）binding protein, C-terminally truncated by the hepatitis A virus proteinase 3C, inhibits viral translation［J］. Nucleic Acids Res, 2007, 35：5975-5984.

［30］Bonderoff JM, LaRey JL, Lloyd RE. Cleavage of poly（A）-binding protein by poliovirus 3C proteinase inhibits viral internal ribosome entry site-mediated translation［J］. J Virol, 2008, 82：9389-9399.

［31］Kobayashi M, Arias C, Garabedian A, et al. Site-specific cleavage of the host poly（A）binding protein by the encephalomyocarditis virus 3C proteinase stimulates viral replication［J］. J Virol, 2012, 86（19）：10686-10694.

［32］Lei X, Sun Z, Liu X, et al. Cleavage of the adaptor protein TRIF by enterovirus 71 3C inhibits antiviral responses mediated by Toll-like receptor 3［J］. Journal of Virology, 2011, 85（17）：8811-8818.

［33］Wang D, Fang L, Li K, et al. Foot-and-mouth disease virus 3C protease cleaves NEMO to impair innate immune signaling［J］. Journal of Virology, 2012, 86（17）：9311-9322.

［34］Mukherjee A, Morosky SA, Delorme-Axford E, et al. The coxsackievirus B 3Cproprotease cleaves MAVS and TRIF to attenuate host type I interferon and apoptotic signaling［J］. PLoS Pathogens, 2011, 7（3）：e1001311.

［35］Lei X, Xiao X, Xue Q, et al. Cleavage of interferon regulatory factor 7 by enterovirus 71 3C suppresses cellular responses［J］. Journal of Virology, 2013, 87（3）：1690-1698.

［36］Joachims M, Harris KS, Etchison D. Poliovirus protease 3C mediates cleavage of microtubule-associated protein 4［J］. Virology, 1995, 211（2）：451-461.

（責任編輯 狄艷紅）

Research of 3C Protease Picornaviruses and Its Cleavage Substrates

Liu Yan1，2Li Bingqing1Meng Hong1
（1. Department of Microbiology，Institue of Basical Medicine，Shangdong Academy of Medical Sciences，Ji'nan 250000；2. School of Medicine and Life Sciences，Shangdong Academy of Medical Sciences and Ji'an University，Ji'nan 250022）

Picornavirus is a big family of animal viruses, viral protein synthesis needs its own proteases’ cleavage to form sructural and functional proteins. 3C protease is one of picornaviruses’ own proteases. 3C can also cleave some host proteins to benifit viral replication. 3C protease’s structural characteristics, active center, cleavage sites and cleavage substrates’ functions are key of further understanding 3C protease mechanism. Here follows the review on these issues.

Picornavirus 3C protease Cleavage substrates

2014-01-28

國家自然科學基金項目（81000720）

劉艷，女，研究方向：病原生物學；E-mail：lychasedream@163.com

孟紅，女，教授，研究方向：病原生物學；E-mail：menglc@163.com