TAP親和標簽選擇及其在植物蛋白互作研究中的應用

張志飛 趙志麗 文昭竹

（湖南農(nóng)業(yè)大學草業(yè)科學研究所，長沙 410128）

TAP親和標簽選擇及其在植物蛋白互作研究中的應用

張志飛 趙志麗 文昭竹

（湖南農(nóng)業(yè)大學草業(yè)科學研究所，長沙 410128）

串聯(lián)親和純化法（TAP）是一種純化生理條件下蛋白復合物的技術，已廣泛應用于鑒定蛋白相互作用和揭示蛋白復合物互作網(wǎng)絡。近年來，隨著TAP新型標簽的不斷出現(xiàn)以及與其他技術的聯(lián)用，TAP技術正逐漸應用于植物蛋白質(zhì)互作研究中。綜述了TAP親和標簽選擇，并介紹其在植物蛋白互作研究中的成功應用。

串聯(lián)親和純化 親和標簽 植物 蛋白質(zhì)相互作用

生物體通過各種蛋白互作（Protein-protein interactions，PPIs）來傳遞信息，PPIs是生物體每個細胞生命活動的基礎和特征［1，2］，研究PPIs有助于揭示在分子水平上蛋白質(zhì)的未知功能以及深入了解復雜的蛋白互作網(wǎng)絡。該研究已成為蛋白組學研究的重要內(nèi)容之一，也是蛋白質(zhì)功能分析研究領域的熱點。目前已建立多種研究方法用于探索PPIs，包括串聯(lián)親和純化法（Tandem affinity purification，TAP）、免疫共沉淀法（Immunoprecipitation，IP）、酵母雙雜交（Yeast Two-Hybrid，Y2Z）、噬菌體展示（Phage display）、親和印跡（Affinity blotting）、表面等離子共振技術（Surface plasmon resonance technology，SPR）和蛋白質(zhì)芯片（Protein array）等［1-5］。隨著超靈敏和高通量的質(zhì)譜（Mass spectrometry，MS）技術的出現(xiàn)，蛋白復合物的原位親和純化方法逐漸得到應用，特別是基于融合親和標簽（Affinity tag）誘餌蛋白表達的TAP技術。

1999年，TAP蛋白質(zhì)復合物純化技術最早應用于酵母細胞中蛋白質(zhì)復合物的純化［6］。目前，由TAP技術產(chǎn)生的PPIs實驗數(shù)據(jù)正在不斷填充或更新蛋白質(zhì)生物信息學數(shù)據(jù)庫，TAP與MS組合分析已成為鑒定蛋白質(zhì)復合物和解析其作用特性的一個標準方法，也常用于蛋白質(zhì)組裝的系統(tǒng)研究［7，8］。TAP兼有標準親和純化和免疫共沉淀兩種生化方法的優(yōu)點［9，10］，已成功應用于各種細胞和生物體［11-15］。研究證明TAP靈敏度較高、錯誤率低，其主要特點表現(xiàn)為［8，11，16］：TAP 確保高度特異性的蛋白復合物分離，非特異蛋白量很低，有助于簡化后續(xù)共純化蛋白的鑒定和驗證；兩步洗脫純化法允許蛋白質(zhì)復合物在溫和條件洗脫，不需要強烈沖洗。因此，可

更好地保持蛋白復合物的自然修飾和結(jié)合狀態(tài)，有利于保持蛋白質(zhì)成分的天然構象和蛋白復合物的完整性及下游的蛋白組成和功能分析。利用TAP技術大規(guī)模分析不同物種（如酵母和哺乳動物細胞等）PPIs的報道很多，但植物蛋白質(zhì)復合物純化的報道相對較少。本文重點闡述TAP親和標簽的選擇、與其他技術聯(lián)用及其在植物PPIs研究中的應用。

1 TAP的原理

TAP從內(nèi)源性蛋白中分離純化蛋白復合物，借助MS技術研究PPIs。TAP標簽融合蛋白的設計和創(chuàng)建步驟包括親和標簽的選擇、標簽的相對順序和純化方式等。經(jīng)典TAP標簽由3部分組成：金黃色葡萄球菌Protein A（蛋白A的IgG結(jié)合域）、煙草蝕紋病毒蛋白酶（Tobacco etch virus，TEV）可剪切序列和鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽（Calmodulin-binding peptide，CBP）［17］。TAP技術通過兩個連續(xù)的親和純化步驟來減少非特異性蛋白的結(jié)合［8，15］（圖 1）。先將靶蛋白和TAP標簽（Protein A 和CBP）融合表達為標簽靶蛋白（CBP 端與靶蛋白相連），在溫和條件下標簽靶蛋白與內(nèi)源蛋白質(zhì)互作形成蛋白復合物。然后TAP標簽蛋白復合物通過第1個標簽Protein A 特異性結(jié)合到IgG 瓊脂珠，并滌除大部分污染物，再用TEV 蛋白酶切割蛋白復合物的標簽識別位點，以釋放結(jié)合的蛋白復合物。隨后該蛋白復合物通過第2個標簽 CBP結(jié)合到鈣調(diào)蛋白瓊脂珠（Calmodulin beads），經(jīng)進一步洗滌，用EGTA（乙二胺四乙酸）鈣螯合劑溶出鈣調(diào)蛋白瓊脂珠結(jié)合的蛋白復合物。最后分離純化的蛋白通過串聯(lián)質(zhì)譜（Tandem MS）、雙向電泳（2D-PAGE）或免疫雜交等方法鑒定分析。

2 TAP親和標簽的選擇

各種TAP標簽性質(zhì)和純化介質(zhì)各異，應根據(jù)自身研究對象選擇和設計合適的TAP標簽。早期TAP技術采用基于Protein A的親和標簽，這允許融合蛋白通過IgG的親和層析進行一步法純化［16］。此后，逐漸開發(fā)出利用不同親和作用模式的各種TAP標簽，相應的親和純化方法已被證明是有效的捕獲重組蛋白的方法。其中，短肽標簽（Flag、HA、Myc和V5等）有效地降低了TAP 標簽在與目的蛋白連接時對靶蛋白結(jié)構和功能的干擾的可能性，可以被其特異性抗體識別。而大片段TAP標簽（如GST和MBP等）可扮演雙重角色：除了作為親和標簽外，標簽與誘餌蛋白融合，增強的表達蛋白的溶解性和/或促進標簽融合蛋白質(zhì)的正確折疊。根據(jù)親和標簽的特異性，溶解度和結(jié)合/洗脫的條件會有不同。此外，不同標簽的純化效率及相關成本差異顯著［18，19］。很多研究指出，沒有完全滿意的通用理想標簽，特定標簽的好壞取決于實際應用效果。當為某個特定蛋白互作研究項目選擇親和標簽時，目標蛋白特性（如穩(wěn)定性和溶解性）、生產(chǎn)規(guī)模和所需純度是首要考慮的主要因素［16］。所以通常情況下，標簽選擇依賴于TAP純化蛋白復合物的研究經(jīng)驗。

截止目前，關于通過TAP技術從植物中純化蛋白復合物的報道數(shù)量有限，一些已用于植物PPIs研究的親和標簽，見表1。植物TAP標簽經(jīng)常采用經(jīng)典的酵母TAP標簽或其對應的植物改良TAP標簽（Improved TAP tag，TAPi）［13］。后者以經(jīng)典的酵母TAP標簽為基礎，加入植物優(yōu)化的密碼子序列和基因高表達的內(nèi)含子，沒有隱秘性核定位信號（Nuclear localization signals，NLS）。經(jīng)典酵母TAP標簽和改良TAP標簽已成功應用于擬南芥［20-22］和水稻［23］的蛋白質(zhì)復合物純化。研究發(fā)現(xiàn)［24］，替代的TAP標簽（Alternative TAP tag，TAPa）可以純化擬南芥的蛋白復合物，TAPa 的CBP域被9 × Myc和6 × His序列替換，從而防止內(nèi)源性鈣調(diào)蛋白結(jié)合蛋白的非特異性純化，并允許陽離子依賴型酶（Cationdependent enzyme）復合物的純化。Rubio等［24］用TAPa 與擬南芥CSN3（COP9 Signalosome complex subunit 3）融合表達，純化出多亞基蛋白COP9復合體，而 TEV切割位點被替換成特異性更強，并具有低溫活性的人鼻病毒3C蛋白酶（Human rhinovirus 3C protease，HRV 3C Protease）切割位點。TAPa標簽僅能純化單個蛋白質(zhì)復合物，常被用在蛋白質(zhì)凝膠印跡和免疫共沉淀或染色質(zhì)免疫沉淀實驗中［24］。

引入TAP標簽會影響靶蛋白與親和配基的結(jié)合，從而影響蛋白質(zhì)的表達，干擾靶蛋白的結(jié)構和功能，給標簽融合蛋白的鑒定帶來一定的困難。TAP標簽細胞內(nèi)源蛋白與TAP標簽的CBP結(jié)合影響第2次親和純化效率；純化試劑影響蛋白復合物的完整性和活性。通過選擇合適的標簽、調(diào)整標簽的位置和研發(fā)標簽純化新方法等使TAP技術不斷完善。TAP標簽已被成功地應用于純化擬南芥抗病性［29］、細胞周期［20］、線粒體生物合成［30］、鹽脅迫耐受性［31］、核質(zhì)運輸［21］、胚胎發(fā)育［32］、蛋白磷酸酶抑制因子［33］和水稻蛋白激酶［34］和開花基因［23］的相關PPIs。近幾年陸續(xù)有新的標簽組合和方法應用于植物PPIs研究。Zenser等［28］利用Flag和HA親和標簽組合到誘餌蛋白的新TAP系統(tǒng)，成功驗證植物蛋白質(zhì)復合物的分離。這個系統(tǒng)的主要優(yōu)點是：Flag-HA短肽標簽減少了蛋白質(zhì)功能的干擾；標簽與抗體親和組合的高特異性適用于各種植物物種；不使用蛋白酶消化，也不需要EGTA作螯合劑，兼容質(zhì)譜的洗脫條件。Stoppel等［26］通過質(zhì)體核糖核酸酶（RNase E，RNE）在擬南芥RNE突變體與TAP標簽3 × HA或Strep-tag III蛋白融合表達，并與質(zhì)譜聯(lián)用成功發(fā)現(xiàn)維管植物特有的調(diào)控互作蛋白RHON1（光合自養(yǎng)生長的關鍵因子），RHON1與RNE形成獨特的蛋白復合體（800 kD）。Jeong等［27］通過TAP標簽ProtACBP或FSG（3 × Flag-Strep-Protein G）與CPL1（Carboxyl-terminal domain phosphatase-like 1）融合表達，在擬南芥懸浮培養(yǎng)細胞中純化出RCF3（Regulator of Cbf Gene Expression 3），而且先后被酵母雙雜交、熒光素酶互補成像和雙分子熒光互補分析證實了CPL1和RCF3在體內(nèi)強烈互作。

3 TAP與其他技術的聯(lián)用

TAP 技術適用于生理條件下PPIs的分離及蛋白質(zhì)復合物活性檢測。但與其他生物體相比，TAP技術在植物PPIs的應用上存在一定局限性。與酵母不同，高等植物的高效同源重組是不可行的，內(nèi)源性蛋白質(zhì)會在一定程度上干擾 TAP標簽融合蛋白與其互作蛋白的結(jié)合，從而降低了融合蛋白與其互作蛋白的結(jié)合效率，導致提取率降低。因此，內(nèi)源性蛋白會在復雜的裝配中與其對應的TAP標簽融合蛋白競爭。為了盡量避免此缺陷，TAP標簽蛋白可以引入植物突變體，該突變體通過RNA干擾（RNA interference）抑制或轉(zhuǎn)移DNA（T-DNA）插入消除內(nèi)源基因［1，3］。TAP與這些技術聯(lián)用能為標簽蛋白提供更多可利用的互作蛋白，增加純化的成功率，從而更準確地鑒定標簽蛋白質(zhì)的功能。此外，過表達標簽誘餌蛋白增強與內(nèi)源性蛋白結(jié)合的競爭力，也是植物TAP成功報道的常用方法［16，17］。但標簽誘餌蛋白的過量表達經(jīng)常會導致蛋白的非特異性變化或者蛋白與非自然蛋白的互作。所以最好使用目的蛋白的自有啟動子來控制其在宿主細胞中的表達。

該技術與大多數(shù)研究PPIs的技術一樣，存在假陽性的問題，需要在實驗中仔細驗證，尤其在低豐度蛋白復合物和瞬時或微弱的PPIs研究中容易出現(xiàn)。核苷酸可通過PCR擴增控制量的變化，使其量與細胞蛋白質(zhì)量一致，保持在10-100拷貝至107拷貝的動態(tài)變化中，TAP純化成功率依賴于蛋白質(zhì)復合物的量和MS的靈敏度。多個洗脫組合或者增加植物性樣品的起始蛋白量可以減少假陽性干擾［1，16］。另外，與整株植物相比，植物細胞懸浮液可以快速增長，并提供無限量供應的同步生物材料，這意味著提供更多的蛋白質(zhì)給復雜的蛋白或復合物裝配，可以提高植物樣品的起始蛋白量，并廣泛用于參與初級代謝、基因表達或細胞壁合成等生物過程的植物蛋白復合物分離。低豐度蛋白質(zhì)（如膜蛋白等）形成的靶蛋白復合物量較少，有時很難通過TAP技術檢測。膜相關的抗病性蛋白（Membrane-associated disease resistance protein）RPS2是質(zhì)膜低豐度蛋白，利用TAP與交聯(lián)試劑DSP（Dithiobis succinimidyl propionate）聯(lián)用純化RPS2的PPIs時發(fā)現(xiàn)，與交聯(lián)試劑聯(lián)用純化獲得的RPS2相互作用蛋白RIN4比單獨使用TAP獲得的量更大，而且交聯(lián)試劑在純化過程中使蛋白復合物更加穩(wěn)定，此法可用于純化膜蛋白的相互作用蛋白或瞬時結(jié)合蛋白［35，36］。

新親和標簽的出現(xiàn)和質(zhì)譜等技術聯(lián)用的快速發(fā)展，植物TAP將不斷的快速“更新升級”，從而推動植物生物大分子復合體結(jié)構及蛋白質(zhì)相互作用的深入研究。理想的蛋白質(zhì)相互作用研究方法應該能夠具有高特異性，高度真實性和高分辨率等特點，目前僅依靠單一研究方法很難實現(xiàn)。今后TAP會與各種方法技術并存，相互間交叉互補聯(lián)用，將成為研究植物蛋白質(zhì)相互作用的主要技術手段。

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（責任編輯 狄艷紅）

Tag Selection of Tandem Affinity Purification and Its Application in Plant Protein-Protein Interactions

Zhang Zhifei Zhao Zhili Wen Zhaozhu
（Grassland Science Institute，Hunan Agricultural University，Changsha 410128）

Tandem affinity purification（TAP）is a technology for the purification of protein complex under the normal physiological conditions, which has been extensively utilized to identify protein-protein interactions（PPIs）and reveal interaction network of protein complexes. In recent years, TAP technology has been improving in the PPIs study, with the development of new labels, TAP method improvements and jointed use with other technologies associated. TAP technology is also being increasingly used in the studies of plant PPIs. This paper reviews the selection of TAP affinity tag and advance of research that TAP has been successful used in the study of plant PPIs.

Tandem affinity purification Tag Plant Protein-protein interactions

2014-01-03

張志飛，女，博士，副教授，研究方向：牧草及草坪草抗性分子生物學；E-mail：zzf0917@ aliyun.com