• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    醇類保護(hù)劑對(duì)豬軟骨低溫膨脹過程的作用

    2014-04-09 01:20:28余華星李代禧
    制冷學(xué)報(bào) 2014年4期
    關(guān)鍵詞:丙二醇冰晶保護(hù)劑

    余華星 李代禧 胥 義 劉 立 翟 振 張 燕

    (上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院 上海 200093)

    在對(duì)關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行低溫保存時(shí),常常會(huì)觀察到低溫?cái)嗔熏F(xiàn)象[1-3],然而其生物力學(xué)性能的低溫?fù)p傷機(jī)理至今仍不甚明確[4]。從現(xiàn)有文獻(xiàn)來(lái)看,有關(guān)細(xì)胞低溫保存凍結(jié)損傷影響機(jī)制的研究,主要集中在懸浮細(xì)胞領(lǐng)域,研究方法比較成熟。對(duì)于懸浮細(xì)胞,由于在冰晶生成時(shí),細(xì)胞可以自由移動(dòng)[5],胞外冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷程度比對(duì)粘附細(xì)胞的損傷小,此時(shí)胞內(nèi)冰對(duì)細(xì)胞的損傷起主導(dǎo)作用。然而黏附細(xì)胞(包括組織內(nèi)的細(xì)胞)是固定的,生成的冰晶與其剛性接觸產(chǎn)生擠壓、剪切作用較大,其受到胞外冰機(jī)械損傷增加,甚至更為嚴(yán)重[6]。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞外基質(zhì)主導(dǎo)了軟骨細(xì)胞的生物力學(xué)特性,軟骨細(xì)胞的外基質(zhì)生物力學(xué)特性的改變可能會(huì)改變軟骨細(xì)胞的應(yīng)力,應(yīng)變環(huán)境[7]。關(guān)于胞外冰晶對(duì)黏附細(xì)胞的研究目前還較少,所以胞外冰晶對(duì)細(xì)胞機(jī)械損傷的檢測(cè)和研究對(duì)解釋組織細(xì)胞的低溫?fù)p傷機(jī)理是非常必要的。文獻(xiàn)[4]利用熱機(jī)械分析儀研究了豬軟骨在凍結(jié)過程的熱膨脹行為和熱應(yīng)變值,認(rèn)為關(guān)節(jié)軟骨至今不能成功保存的重要原因是在低溫凍結(jié)時(shí),關(guān)節(jié)軟骨中存在非均勻熱膨脹現(xiàn)象,從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)部產(chǎn)生熱應(yīng)力,并損傷關(guān)節(jié)軟骨中的膠原纖維等成分。同時(shí)提出了在一定降溫速率下,添加適宜的冷凍保護(hù)劑有利于保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的力學(xué)性能。

    本文采用降溫梯度為1 ℃/min、3 ℃/min、5 ℃/min的慢速降溫方式,通過分別添加四種醇類低溫保護(hù)劑,系統(tǒng)考察軟骨低溫保存過程中細(xì)胞外發(fā)生的生物力學(xué)性能變化,研究降溫速率和低溫保護(hù)劑對(duì)軟骨在凍結(jié)過程熱膨脹行為的影響情況,希望為工程化軟骨組織的低溫保存提供有效的依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    選取上海本地成年豬身上的整根有兩瓣半月板覆蓋的白色軟骨的豬大骨。用手術(shù)剪將半月板剪去,選取受力負(fù)荷相對(duì)集中的中央軟骨,用專用采樣工具制備直徑為5 mm厚度為3~4 mm的軟骨測(cè)試樣品。本實(shí)驗(yàn)為了便于討論,采用摩爾濃度標(biāo)定保護(hù)劑,從而減小了分子量差異對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。因?yàn)楦邼舛缺Wo(hù)劑的添加存在玻璃化現(xiàn)象,并且會(huì)對(duì)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞以及其他活性物質(zhì)造成不可逆損傷[4],實(shí)驗(yàn)采用較小摩爾濃度(1.5 mol/L、4.5 mol/L)的乙醇、乙二醇、1,2-丙二醇、甘油(四種試劑均為分析純,購(gòu)置于上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),分別進(jìn)行2.5 h的充分滲透并放在4 ℃冰箱貯存以備實(shí)驗(yàn)時(shí)取用。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    使用熱機(jī)械分析儀 (TMA Q400, TA, USA) 作為測(cè)試儀器(壓縮模式)。測(cè)試方法如下:將樣品置于壓縮夾具中心位置;加載0.005N的微小載荷,讀取此時(shí)樣品的厚度為初始厚度。針對(duì)黏附成骨細(xì)胞的前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明[8-10],在慢速降溫時(shí)沒有胞內(nèi)冰的生成,即胞外水分凍結(jié)膨脹所致的熱應(yīng)力是軟骨組織內(nèi)部損傷的主要因素。因此,本實(shí)驗(yàn)選擇分別以1 ℃/min、3 ℃/min、5 ℃/min的降溫速率從0 ℃開始程序降溫至-60 ℃,并記錄整個(gè)過程樣品的熱應(yīng)變曲線。通過最終分析該熱應(yīng)變曲線,研究關(guān)節(jié)軟骨凍結(jié)過程的低溫?fù)p傷機(jī)理和低溫保護(hù)劑對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的低溫保護(hù)機(jī)理。

    2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

    2.1 降溫速率對(duì)凍結(jié)過程熱膨脹的影響

    2.1.1降溫速率對(duì)添加乙醇、乙二醇的豬軟骨熱應(yīng)變的影響

    添加乙醇和乙二醇時(shí),在不同降溫速率和濃度作用下,豬軟骨的低溫?zé)崃髑€如圖1所示,其中曲線相對(duì)應(yīng)的相變溫度、豬軟骨最大熱應(yīng)變變化值見表1。

    表1 添加乙醇和乙二醇時(shí)不同降溫速率和濃度的相變溫度、豬軟骨最大熱應(yīng)變變化值

    圖1表明,添加乙醇和乙二醇保護(hù)劑時(shí),降溫速率對(duì)關(guān)節(jié)軟骨凍結(jié)過程的熱膨脹有非常顯著的影響。結(jié)合表1及圖1(a)、(c)可以發(fā)現(xiàn),當(dāng)添加乙醇、乙二醇濃度為1.5 mol/L時(shí),樣品在三種降溫速率下,3 ℃/min時(shí)的熱應(yīng)變變化值是最小的。可能是因?yàn)樵诮禍剡^程中, 細(xì)胞外局部結(jié)冰,細(xì)胞內(nèi)未結(jié)冰處于過冷狀態(tài),水分開始滲出細(xì)胞,導(dǎo)致細(xì)胞外的冰晶不斷生長(zhǎng)。在濃度為1.5 mol/L時(shí),由于保護(hù)劑濃度較低,滲透進(jìn)入軟骨組織的保護(hù)劑分子較少,其對(duì)水分子的結(jié)合作用較弱,所以胞內(nèi)有大量的自由水可以外滲。當(dāng)降溫速率較快時(shí),胞外水的過冷度高,突然結(jié)晶導(dǎo)致膨脹應(yīng)力來(lái)不及釋放,然而此時(shí)細(xì)胞內(nèi)的水來(lái)不及外滲,因此冰晶的生長(zhǎng)有限;降溫速率較慢時(shí),雖然冰晶的成核率較低,胞外基質(zhì)對(duì)應(yīng)力具有一定的緩沖作用,然而隨著胞內(nèi)水分不斷外滲,冰晶不斷生長(zhǎng)增大,總體應(yīng)變變化值依舊較大。因此,當(dāng)降溫速率為3 ℃/min時(shí),存在最佳降溫速率,胞內(nèi)水外滲不致過多,細(xì)胞外冰的生長(zhǎng)又不至于過快,胞外蛋白具有一定的緩沖作用,膨脹產(chǎn)生的熱應(yīng)力得以及時(shí)釋放。

    由圖1(b)、(d)可以看出,對(duì)于添加濃度為4.5 mol/L保護(hù)劑的豬軟骨,降溫速率越快,其熱應(yīng)變變化值越大。此時(shí),保護(hù)劑濃度相對(duì)較高,滲透進(jìn)入軟骨細(xì)胞的保護(hù)劑分子較多,其對(duì)水分子的結(jié)合作用較強(qiáng),胞內(nèi)水的外滲作用對(duì)于整個(gè)組織的膨脹效應(yīng)貢獻(xiàn)已經(jīng)不大,胞外自身水膨脹應(yīng)力對(duì)于整個(gè)組織的膨脹起主導(dǎo)作用。軟骨胞外基質(zhì)中存在大量的膠原和蛋白多糖,對(duì)冰晶的膨脹效應(yīng)具有緩沖效應(yīng)。隨著降溫速度的增加,胞外基質(zhì)來(lái)不及調(diào)整形態(tài),導(dǎo)致由于膨脹所產(chǎn)生的應(yīng)力來(lái)不及釋放。

    圖1 乙醇和乙二醇保護(hù)下的豬軟骨的熱應(yīng)變曲線

    2.1.2降溫速率對(duì)添加乙1,2-丙二醇和甘油的豬軟骨熱應(yīng)變的影響

    添加1,2-丙醇和甘油時(shí),不同降溫速率和濃度作用下,豬軟骨的低溫?zé)釕?yīng)變曲線如圖2所示,其中曲線相對(duì)應(yīng)的相變溫度、豬軟骨最大熱應(yīng)變變化值列于表2。

    通過圖2發(fā)現(xiàn),丙二醇以及甘油在濃度為1.5 mol/L時(shí),應(yīng)變隨溫度的變化情況與乙醇及乙二醇相同。然而在濃度為4.5 mol/L時(shí)依舊存在最佳降溫速度,即3 ℃/min時(shí),豬軟骨應(yīng)變最小。出現(xiàn)這種情況的最可能原因是三碳醇對(duì)水的結(jié)合性更優(yōu),此時(shí)軟骨熱應(yīng)力的大小主要取決于冰晶自身的形成機(jī)制。原因可以用結(jié)晶理論來(lái)解釋:慢速降溫的成核率較低,而冰晶生長(zhǎng)快,生成少但較大的冰晶;快速降溫的成核率高,但冰晶生長(zhǎng)慢,因而生成多但較小的冰晶[11]。二者的拮抗作用結(jié)果為存在最佳降溫速度,使得此時(shí)的冰晶形成率最低。

    由圖1、2可以看出,在凍結(jié)相變發(fā)生前的熱應(yīng)變首先快速減小,隨著降溫速率的增大,熱收縮幅度越小。原因是在凍結(jié)發(fā)生前,關(guān)節(jié)軟骨中的水分子雖然受降溫的影響而縮短彼此間的距離,在當(dāng)快速降溫時(shí),達(dá)到凍結(jié)相變點(diǎn)溫度的時(shí)間短,水分子之間的距離還沒有來(lái)得及減小到穩(wěn)定狀態(tài),就發(fā)生了凍結(jié)相變過程,因而凍結(jié)發(fā)生前的熱收縮越小[4];還能發(fā)現(xiàn)保護(hù)劑濃度為4.5 mol/L時(shí),膨脹產(chǎn)生的熱應(yīng)力要顯著小于1.5 mol/L。其主要原因有兩個(gè)方面:一是高濃度低溫保護(hù)劑(溶質(zhì))占據(jù)了本該參與相變的純水份額較多,二是有一部分水與低溫保護(hù)劑之間以氫鍵的形式相聯(lián)系,成為不凍水(未凍水)。未凍水含量的高低反映了保護(hù)劑結(jié)合水能力的強(qiáng)弱[12]。

    表2 添加1,2-丙醇和甘油時(shí)不同降溫速率和濃度的相變溫度、豬軟骨最大熱應(yīng)變變化值

    圖2 1,2-丙二醇和甘油保護(hù)下的豬軟骨的熱應(yīng)變曲線

    2.2 低溫保護(hù)劑對(duì)凍結(jié)膨脹的影響

    圖3給出了樣品經(jīng)過乙醇、乙二醇、1,2-丙醇、甘油處理后的凍結(jié)過程熱應(yīng)變變化情況(降溫速率3 ℃/min)。從圖中不難發(fā)現(xiàn),與其他三種醇類相比,1,2-丙二醇的保護(hù)效果最優(yōu)。其可能原因是在物質(zhì)的量濃度相同的情況下,1,2-丙二醇也要強(qiáng)于其他三種醇類,這與胡桐記等[13]使用DSC研究不同醇類水和性質(zhì)的研究結(jié)果一致。Fahy等[14]認(rèn)為諸多低溫保護(hù)劑結(jié)合水能力的高低,除了部分與本身所含有的羥基個(gè)數(shù)有關(guān),還與是否含有甲基以及甲基的個(gè)數(shù)有關(guān),這就是所謂的“甲基化效應(yīng)”。甲基的存在降低了羥基之間鍵合的可能性,切斷了溶質(zhì)之間羥基鏈的鍵合,增大了與水分子之間鍵合的可能性[15]。由于甘油分子中有較長(zhǎng)的羥基鏈,大大增加了保護(hù)劑自身或者保護(hù)劑之間的鍵合的概率,從而弱化了對(duì)水束縛的能力,造成了結(jié)合水能力弱于1,2-丙二醇,同樣的道理適用于乙二醇和甘油的比較。在1,2-丙二醇和乙二醇的比較中,1,2-丙二醇的結(jié)合水能力也是強(qiáng)于乙二醇,兩者的分子中雖然都只有兩個(gè)羥基基團(tuán),但是1, 2-丙二醇分子中多了一個(gè)碳原子,減少了保護(hù)劑之間的鍵合的概率,使得1,2-丙二醇自身鍵合的概率降低,與水鍵合的可能性也就增加了。

    圖3 3 ℃/min的降溫速率下四種保護(hù)劑不同濃度下的豬軟骨的熱應(yīng)變曲線

    3 結(jié)論

    1) 關(guān)節(jié)軟骨低溫凍結(jié)保存時(shí),細(xì)胞外存在熱膨脹現(xiàn)象,導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)部熱應(yīng)力的產(chǎn)生,并損傷關(guān)節(jié)軟骨中的膠原纖維等成分。影響該熱應(yīng)力大小的因素有很多,如降溫速率,添加保護(hù)劑的濃度和種類。

    2) 降溫速率對(duì)胞外膨脹所產(chǎn)生的應(yīng)力的影響機(jī)制復(fù)雜:隨著速度的增加,未凍水的過冷度增加,成核率較高,保外基質(zhì)難以起到緩沖效果,導(dǎo)致膨脹熱應(yīng)力較大;然而此時(shí),胞內(nèi)水的外滲作用弱,未凍水含量較少,同時(shí)冰晶的生長(zhǎng)速率也較低。一定濃度冷凍保護(hù)劑的添加,可以影響降溫過程的主導(dǎo)因素,進(jìn)而找到最佳降溫速率。

    3) 由于甲基對(duì)于關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的力學(xué)性能保護(hù)要好于羥基,與乙醇、乙二醇、甘油相比,1,2-丙二醇更適合保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨。

    [1] 胥義,周國(guó)燕,高才.兔主動(dòng)脈凍結(jié)膨脹行為及其影響因素的研究[J].工程熱物理學(xué)報(bào),2005,26(6):1013-1015.(Xu Yi,Zhou Guoyan,Gao Cai,et al. Study on the Thermal Expansion Behaviors of Rabbit Artery during Freezing and Affecting Factors [J].Journal of Engineering Thermophysics,2005,26(6):1013-1015.)

    [2] Shi X L,Dalta A K. Thermal stresses from large volumetric expansion during freezing of biomaterials [J]. Transaction of the ASME,1998,120:720-726.

    [3] Xu Yi, Hua Z Z, Sun Dawen, et al. Effects of freezing rates and dimethyl sulfoxide concentrations on thermal expansion of rabbit aorta during freezing phase change as measured by thermo mechanical analysis [J]. Journal of Biomechanics,2007,40:3201-3206.

    [4] 胥義,孫慧君,呂婭.關(guān)節(jié)軟骨凍結(jié)過程中的熱膨脹行為及其影響因素研究[J].中國(guó)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)報(bào),2012,31(5):742-748. (Xu Yi,Sun Huijun,Lü Ya.Thermal Expansion Behaviors of Articular Cartilage during Freezing and Affecting Factors [J].Chinese Journal of Biomedical Engineering,2012,31(5):742-748.)

    [5] Ishiguro H,Rubinsky B.Mechanical interactins between ice crystals and red blood cells during directional solidification [J]. Cryobiology,1994,31:483-500.

    [6] Ishine N,Rubinsky B,Lee C Y. A histoligical analysis of liver injury in freezing storage [J]. Cryobiology,1999,39:271-277.

    [7] Mow V C,Ateshian G A,Spilker R L.Biomechanics of diarthrodial joints:a review of twenty years of progress [J].J Biomech Eng 1993,115(4B):460-467.

    [8] 劉寶林,McGrath John,華澤釗.低溫保存過程中老鼠成骨細(xì)胞胞內(nèi)冰的研究[J]. 制冷學(xué)報(bào),2007,28(2):22-25.(Liu Baolin,John M G,Hua Zezhao. The study on the intracellular ice formation of osteoblast cells in cryopreservation [J]. Journal of Refrigeration,2007,28(2):22-25.)

    [9] Liu Baolin,McGrath J. Freezing osteoblast cells attached to hydroxyapatite discs and glass coverslips: Mechanisms of damage [J]. Science in China Series E: Technological Sciences,2007,50(1):1-9.

    [10] Liu Baolin,McGrath J. Effects of two-step freezing on the ultra-structural components of murine osteoblast cultures [J]. Cryo-Letters,2006,27(6):369-374.

    [11] 華澤釗,任禾盛.低溫生物醫(yī)學(xué)技術(shù)[M].北京:科學(xué)出版社,1994.

    [12] 高才,王文華,胡桐記,等.不同結(jié)晶度的乙二醇及其水溶液玻璃化轉(zhuǎn)變與焓松弛[J].物理化學(xué)學(xué)報(bào),2004,20 (7):701-707.(Gao Cai,Wang Wenhua,Hu Tongji,et al. Glass Transition and Enthalpy Relaxation Behavior of Ethylene Glycol and Its Aqueous Solution with Different Crystallinity[J]. Physico-Chimica Sinica,2004,20 (7):701-707.)

    [13] 胡桐記,高才,周國(guó)燕,等.常用醇類低溫保護(hù)劑水溶液的DSC研究[J].低溫工程,2005(1):38-43.(Hu Tongji,Gao Cai,Zhou Guoyan,et al. Thermal property of polyalcohols aqueous solution used as cryoprotectants studied by DSC[J]. Cryogenics,2005(1):38-43.)

    [14] Fahy G M,Levy D I. Some emerging principle underlying the physical property, biologicalaction and utility of vitrification solution. [J].Cryobiology,1987,24:196-214.

    [15] DeVisser C,Somsen G. Molar heat capacities of binary mixtures of water and some amides a 298.15K.Z.Phys. Chem[J].NeueFolge,1974,92:159-170.

    猜你喜歡
    丙二醇冰晶保護(hù)劑
    陶氏推出可持續(xù)丙二醇生產(chǎn)技術(shù)
    冰晶世界,凝凍微觀的美麗
    凍干益生菌微膠囊保護(hù)劑及抗性研究
    雪為什么只在冬天下
    微流控法低溫保護(hù)劑添加及去除線型優(yōu)化研究
    小泥人冰晶畫 蘊(yùn)藏大商機(jī)
    冰晶奇域
    琴童(2016年5期)2016-05-14 15:43:58
    丙二醇頭孢曲嗪的有關(guān)物質(zhì)檢查
    用濕巾擦手后吃東西等于吃毒,是真的嗎?
    低溫保護(hù)劑熱物性分析與冰晶的顯微研究
    国产精品免费视频内射| 91国产中文字幕| 亚洲国产av影院在线观看| 国产亚洲欧美精品永久| 国产熟女午夜一区二区三区| 中文字幕色久视频| 久久久久久久久免费视频了| 久久久久久久精品精品| 精品久久久久久电影网| 在线观看免费日韩欧美大片| 交换朋友夫妻互换小说| 国产一区二区 视频在线| 亚洲精品乱久久久久久| 国产精品一区二区在线不卡| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 亚洲伊人色综图| 两个人免费观看高清视频| a级片在线免费高清观看视频| 日本免费在线观看一区| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 波多野结衣一区麻豆| xxx大片免费视频| 国产成人av激情在线播放| 99久久精品国产国产毛片| 亚洲精品第二区| 2021少妇久久久久久久久久久| 人妻人人澡人人爽人人| 亚洲欧美一区二区三区国产| 热99国产精品久久久久久7| 美女国产高潮福利片在线看| 人妻系列 视频| 男人舔女人的私密视频| 一区二区日韩欧美中文字幕| 亚洲,欧美精品.| 国产欧美亚洲国产| 亚洲第一区二区三区不卡| 免费高清在线观看视频在线观看| 久久久亚洲精品成人影院| 青草久久国产| 26uuu在线亚洲综合色| 桃花免费在线播放| 我要看黄色一级片免费的| 国产深夜福利视频在线观看| 午夜福利在线免费观看网站| 色吧在线观看| 亚洲一区中文字幕在线| 国产精品国产av在线观看| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 少妇精品久久久久久久| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 在线观看免费高清a一片| 婷婷成人精品国产| 国产日韩欧美在线精品| 大陆偷拍与自拍| 精品福利永久在线观看| 国产男女内射视频| 午夜激情av网站| 秋霞伦理黄片| 伊人亚洲综合成人网| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 亚洲精品国产av成人精品| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 国产av精品麻豆| 又大又黄又爽视频免费| 在线观看免费高清a一片| 飞空精品影院首页| 久久久久久久久久人人人人人人| 最新的欧美精品一区二区| 国产精品欧美亚洲77777| 亚洲av免费高清在线观看| 少妇精品久久久久久久| 国产成人精品久久二区二区91 | 免费av中文字幕在线| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 国产日韩欧美亚洲二区| 黄频高清免费视频| 多毛熟女@视频| 下体分泌物呈黄色| 热99久久久久精品小说推荐| 亚洲熟女精品中文字幕| 黄色毛片三级朝国网站| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 看免费成人av毛片| 色婷婷av一区二区三区视频| 最近手机中文字幕大全| 成年女人在线观看亚洲视频| 中文字幕人妻丝袜制服| 国产激情久久老熟女| 97人妻天天添夜夜摸| h视频一区二区三区| 久久久国产精品麻豆| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 9色porny在线观看| 亚洲精品国产av蜜桃| 精品少妇黑人巨大在线播放| 最新中文字幕久久久久| 久久国产亚洲av麻豆专区| 成人二区视频| 叶爱在线成人免费视频播放| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 欧美日韩精品网址| 精品少妇黑人巨大在线播放| 性少妇av在线| 亚洲一区中文字幕在线| a级片在线免费高清观看视频| 国产精品一国产av| 一区二区三区乱码不卡18| 丁香六月天网| 1024视频免费在线观看| 91精品国产国语对白视频| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 天堂中文最新版在线下载| 日韩中字成人| www日本在线高清视频| 美女午夜性视频免费| 日韩av不卡免费在线播放| 久久久久人妻精品一区果冻| 久久久久国产精品人妻一区二区| 在线精品无人区一区二区三| 日韩精品有码人妻一区| 春色校园在线视频观看| 尾随美女入室| 极品人妻少妇av视频| 国产精品久久久久成人av| 美女午夜性视频免费| 亚洲av中文av极速乱| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 波多野结衣av一区二区av| 老鸭窝网址在线观看| 丰满迷人的少妇在线观看| 另类精品久久| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 久久久精品94久久精品| 久久久久久人人人人人| 夫妻性生交免费视频一级片| 国产男人的电影天堂91| 国产精品蜜桃在线观看| 热99久久久久精品小说推荐| 色婷婷av一区二区三区视频| 最近的中文字幕免费完整| 日本黄色日本黄色录像| 亚洲精品乱久久久久久| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 免费大片黄手机在线观看| 男人操女人黄网站| 在线 av 中文字幕| 国产探花极品一区二区| 一级片'在线观看视频| 欧美日韩精品网址| 女人久久www免费人成看片| 国产成人91sexporn| 男人爽女人下面视频在线观看| 成年女人在线观看亚洲视频| 欧美xxⅹ黑人| 国产精品 欧美亚洲| 蜜桃国产av成人99| 男女免费视频国产| 久久综合国产亚洲精品| 少妇精品久久久久久久| 视频在线观看一区二区三区| 精品卡一卡二卡四卡免费| 久久狼人影院| 成人手机av| 精品少妇内射三级| 成人午夜精彩视频在线观看| 91aial.com中文字幕在线观看| 国产免费一区二区三区四区乱码| 午夜福利一区二区在线看| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 亚洲情色 制服丝袜| 熟妇人妻不卡中文字幕| 母亲3免费完整高清在线观看 | 巨乳人妻的诱惑在线观看| av在线观看视频网站免费| 嫩草影院入口| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 亚洲精品视频女| 观看美女的网站| 免费黄频网站在线观看国产| 91国产中文字幕| 午夜老司机福利剧场| 久久久欧美国产精品| 少妇被粗大猛烈的视频| a 毛片基地| 午夜免费男女啪啪视频观看| 少妇的丰满在线观看| 亚洲精品成人av观看孕妇| 人妻一区二区av| 免费在线观看黄色视频的| 久久国内精品自在自线图片| 女人久久www免费人成看片| 日韩中文字幕视频在线看片| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 成人二区视频| 亚洲欧美精品自产自拍| 日日爽夜夜爽网站| 久久精品aⅴ一区二区三区四区 | 久久久久久免费高清国产稀缺| 人体艺术视频欧美日本| 日日爽夜夜爽网站| 亚洲第一青青草原| 国产亚洲欧美精品永久| 水蜜桃什么品种好| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 国产男女内射视频| av线在线观看网站| freevideosex欧美| 美国免费a级毛片| 亚洲视频免费观看视频| 国产精品无大码| 久久久久人妻精品一区果冻| 欧美少妇被猛烈插入视频| 亚洲一码二码三码区别大吗| 国产一区二区在线观看av| 久久精品久久精品一区二区三区| 在线免费观看不下载黄p国产| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 永久免费av网站大全| 十分钟在线观看高清视频www| 午夜福利影视在线免费观看| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 男女午夜视频在线观看| 熟女电影av网| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 男男h啪啪无遮挡| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 久久亚洲国产成人精品v| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 一本色道久久久久久精品综合| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 久久女婷五月综合色啪小说| 极品人妻少妇av视频| 热99国产精品久久久久久7| 免费少妇av软件| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 高清av免费在线| 一级毛片我不卡| 久久 成人 亚洲| 各种免费的搞黄视频| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 午夜福利影视在线免费观看| 久久久精品区二区三区| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 中文字幕色久视频| 91精品伊人久久大香线蕉| 最近2019中文字幕mv第一页| 另类亚洲欧美激情| 日韩人妻精品一区2区三区| 搡老乐熟女国产| 日韩一区二区三区影片| 中文字幕人妻丝袜一区二区 | 日韩三级伦理在线观看| 成年人午夜在线观看视频| 美女午夜性视频免费| 亚洲一区二区三区欧美精品| 国产精品一区二区在线不卡| 韩国高清视频一区二区三区| 亚洲在久久综合| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 婷婷色综合www| 国产又爽黄色视频| 免费高清在线观看视频在线观看| 亚洲情色 制服丝袜| 韩国精品一区二区三区| 亚洲精品aⅴ在线观看| 多毛熟女@视频| 亚洲三区欧美一区| 大香蕉久久网| 久久热在线av| 18禁国产床啪视频网站| 日韩中文字幕视频在线看片| 成年av动漫网址| 大香蕉久久成人网| 亚洲精品第二区| 久久久久精品人妻al黑| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 日韩伦理黄色片| 春色校园在线视频观看| 叶爱在线成人免费视频播放| 精品卡一卡二卡四卡免费| 91精品三级在线观看| 精品一区在线观看国产| 在线观看一区二区三区激情| 日本wwww免费看| 久久精品国产综合久久久| 国产一区二区三区综合在线观看| 日韩成人av中文字幕在线观看| 久久精品aⅴ一区二区三区四区 | 亚洲精品中文字幕在线视频| 久久久久久久久久人人人人人人| 综合色丁香网| 欧美+日韩+精品| 国产片内射在线| 亚洲欧美色中文字幕在线| 搡女人真爽免费视频火全软件| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 大话2 男鬼变身卡| 91精品伊人久久大香线蕉| 亚洲,欧美精品.| 夫妻午夜视频| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 韩国精品一区二区三区| 免费在线观看黄色视频的| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 9热在线视频观看99| 永久网站在线| 热99国产精品久久久久久7| 国产成人精品一,二区| 看非洲黑人一级黄片| 狂野欧美激情性bbbbbb| 满18在线观看网站| 国产精品嫩草影院av在线观看| 久久国产精品大桥未久av| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 久久久欧美国产精品| 有码 亚洲区| 国产成人精品一,二区| 久久精品国产自在天天线| 天堂俺去俺来也www色官网| 成人毛片60女人毛片免费| 国产在视频线精品| 亚洲成色77777| 黑人欧美特级aaaaaa片| 欧美激情 高清一区二区三区| 国产精品欧美亚洲77777| 国产一区有黄有色的免费视频| 久久久久精品久久久久真实原创| 国产精品蜜桃在线观看| 国产 一区精品| 在线观看www视频免费| 国产黄色免费在线视频| 最近2019中文字幕mv第一页| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 久久久久国产精品人妻一区二区| 美女大奶头黄色视频| 国产精品久久久久成人av| 伦精品一区二区三区| 少妇的逼水好多| 日本vs欧美在线观看视频| 亚洲一区中文字幕在线| 亚洲久久久国产精品| 人人妻人人澡人人看| 国产精品熟女久久久久浪| 成人午夜精彩视频在线观看| 制服诱惑二区| 老司机影院成人| 免费大片黄手机在线观看| 久久99蜜桃精品久久| 两性夫妻黄色片| 亚洲综合精品二区| 午夜免费观看性视频| av福利片在线| 在线免费观看不下载黄p国产| 久久精品国产亚洲av高清一级| 一二三四中文在线观看免费高清| 日韩视频在线欧美| 69精品国产乱码久久久| 水蜜桃什么品种好| 精品少妇黑人巨大在线播放| 日韩中文字幕视频在线看片| 999精品在线视频| 免费观看av网站的网址| 多毛熟女@视频| 999久久久国产精品视频| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 免费观看性生交大片5| 国产成人精品一,二区| 精品福利永久在线观看| 亚洲色图综合在线观看| tube8黄色片| 男女免费视频国产| 国产精品一区二区在线不卡| 极品少妇高潮喷水抽搐| 久久99一区二区三区| 最近中文字幕高清免费大全6| 美女午夜性视频免费| 亚洲欧洲国产日韩| 最近的中文字幕免费完整| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 欧美精品av麻豆av| 精品亚洲成a人片在线观看| 国产精品一国产av| 午夜激情av网站| 丝袜美腿诱惑在线| 看免费av毛片| h视频一区二区三区| 亚洲欧洲国产日韩| 国产精品一二三区在线看| 人成视频在线观看免费观看| 国产免费视频播放在线视频| 一级爰片在线观看| 中文欧美无线码| 日本欧美国产在线视频| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 丰满迷人的少妇在线观看| 少妇精品久久久久久久| 99香蕉大伊视频| 久久人人爽人人片av| 永久免费av网站大全| 亚洲,一卡二卡三卡| 成年动漫av网址| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 国产 一区精品| 欧美精品亚洲一区二区| 亚洲三级黄色毛片| 美女国产视频在线观看| 春色校园在线视频观看| 亚洲欧美成人精品一区二区| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 这个男人来自地球电影免费观看 | 黄片播放在线免费| 另类亚洲欧美激情| 一区二区av电影网| 九色亚洲精品在线播放| 精品国产露脸久久av麻豆| 有码 亚洲区| 99久久人妻综合| 成人黄色视频免费在线看| 99九九在线精品视频| 18禁国产床啪视频网站| 色吧在线观看| 97精品久久久久久久久久精品| 国产午夜精品一二区理论片| 波多野结衣一区麻豆| 一二三四在线观看免费中文在| 制服丝袜香蕉在线| av一本久久久久| 纯流量卡能插随身wifi吗| 久久人妻熟女aⅴ| 国产高清国产精品国产三级| 涩涩av久久男人的天堂| 免费人妻精品一区二区三区视频| 国产精品人妻久久久影院| 激情视频va一区二区三区| 边亲边吃奶的免费视频| 午夜91福利影院| 国产欧美亚洲国产| 亚洲精品乱久久久久久| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 日韩av不卡免费在线播放| av一本久久久久| 黄色怎么调成土黄色| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 国产 一区精品| 欧美日韩精品网址| 满18在线观看网站| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 下体分泌物呈黄色| 国产精品不卡视频一区二区| 日韩三级伦理在线观看| 寂寞人妻少妇视频99o| 男男h啪啪无遮挡| 高清在线视频一区二区三区| 在线观看免费日韩欧美大片| 97人妻天天添夜夜摸| 久久99一区二区三区| 最近手机中文字幕大全| 久久女婷五月综合色啪小说| 国产综合精华液| 久热这里只有精品99| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 亚洲精品国产av蜜桃| 中文欧美无线码| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 亚洲精品视频女| 成年人午夜在线观看视频| 免费高清在线观看日韩| a级毛片黄视频| 日本91视频免费播放| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 亚洲欧美一区二区三区久久| 母亲3免费完整高清在线观看 | 成人免费观看视频高清| 性色avwww在线观看| 人成视频在线观看免费观看| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 日韩三级伦理在线观看| 亚洲男人天堂网一区| 毛片一级片免费看久久久久| 中文天堂在线官网| 免费黄色在线免费观看| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 亚洲国产成人一精品久久久| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 日韩一区二区三区影片| 日本vs欧美在线观看视频| 久久这里有精品视频免费| av国产精品久久久久影院| 成人亚洲欧美一区二区av| 九色亚洲精品在线播放| 又大又黄又爽视频免费| av在线老鸭窝| 青青草视频在线视频观看| 国产精品av久久久久免费| 水蜜桃什么品种好| 亚洲天堂av无毛| 97在线人人人人妻| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 久久97久久精品| 人体艺术视频欧美日本| 国产精品国产三级国产专区5o| 91国产中文字幕| 涩涩av久久男人的天堂| 黑人猛操日本美女一级片| 十八禁网站网址无遮挡| 亚洲av免费高清在线观看| 成人手机av| 午夜福利视频在线观看免费| 丰满迷人的少妇在线观看| 久久久久久久久久久免费av| 曰老女人黄片| 少妇被粗大猛烈的视频| h视频一区二区三区| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 久久女婷五月综合色啪小说| 曰老女人黄片| 最新中文字幕久久久久| 两个人免费观看高清视频| 久久韩国三级中文字幕| 国产精品 国内视频| 男人舔女人的私密视频| 黑人猛操日本美女一级片| 老汉色av国产亚洲站长工具| 国产精品嫩草影院av在线观看| 国产 一区精品| 亚洲第一av免费看| 国产精品女同一区二区软件| 黄频高清免费视频| 老汉色∧v一级毛片| 少妇的丰满在线观看| 久久亚洲国产成人精品v| 午夜福利影视在线免费观看| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 狂野欧美激情性bbbbbb| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 精品国产一区二区三区四区第35| 亚洲色图综合在线观看| 亚洲av日韩在线播放| 在线观看www视频免费| 色婷婷av一区二区三区视频| 日韩一区二区视频免费看| 国产免费视频播放在线视频| 男女下面插进去视频免费观看| 亚洲国产成人一精品久久久| 大片电影免费在线观看免费| 久久鲁丝午夜福利片| 9热在线视频观看99| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 午夜福利视频精品| 电影成人av| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 制服人妻中文乱码| 日本-黄色视频高清免费观看| 老汉色∧v一级毛片| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 免费看不卡的av| 国产一区二区 视频在线| 国产av一区二区精品久久| 国产一区二区激情短视频 | 久久午夜福利片| 中文字幕人妻丝袜制服| av女优亚洲男人天堂| 在线观看免费日韩欧美大片| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 午夜福利,免费看| 精品一区二区免费观看| videos熟女内射| 欧美精品一区二区免费开放| 精品少妇一区二区三区视频日本电影 | 老司机亚洲免费影院| 久久久久久久久久久久大奶| 激情视频va一区二区三区| 日韩精品有码人妻一区| 丝袜喷水一区| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 亚洲,欧美精品.| 黄色毛片三级朝国网站| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 国产精品欧美亚洲77777| 18禁国产床啪视频网站| 国产成人免费无遮挡视频| 午夜福利在线免费观看网站| 在线 av 中文字幕| a级毛片在线看网站| 香蕉精品网在线| 成人国产麻豆网| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 久久ye,这里只有精品| 亚洲精品一二三| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 国产av精品麻豆| 丰满饥渴人妻一区二区三| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 亚洲精品日本国产第一区| 日韩中字成人| 1024香蕉在线观看| 亚洲精品日本国产第一区| 久久久久精品久久久久真实原创| 国产av一区二区精品久久| 春色校园在线视频观看| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 久热这里只有精品99| 午夜91福利影院| 观看av在线不卡| 秋霞伦理黄片| 午夜91福利影院|