馬尾松內(nèi)生真菌產(chǎn)油脂菌株的分離、篩選和鑒定

鄧慧華， 洪 偉， 吳承禎， 謝安強， 潘偉彬， 段 萍

(1. 福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院， 福建 福州 350002； 2. 龍巖市林業(yè)科學(xué)研究所， 福建 龍巖 364000；3. 福建省高校森林生態(tài)系統(tǒng)過程與經(jīng)營重點實驗室， 福建 福州 350002； 4. 武夷學(xué)院， 福建 南平354300；5. 閩西職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 福建 龍巖 364021)

植物內(nèi)生真菌泛指那些在其生活史中的某一階段或在整個生活史中都生活在植物組織內(nèi)部，但并沒有引起植物組織明顯病害癥狀的一類真菌[1-2]；大量研究結(jié)果表明植物內(nèi)生真菌能產(chǎn)生與其宿主相同的代謝產(chǎn)物[3-4]。按照協(xié)同演化理論[5]，宿主植物與其內(nèi)生真菌長期共生并相互影響，內(nèi)生真菌極有可能具有與宿主植物相同的次生代謝產(chǎn)物合成途徑，其形成機制為：一是相關(guān)基因的直接傳遞，這種傳遞可發(fā)生在寄生生物與寄主間或共生生物與寄主間的相互作用過程中；二是在共同生活的環(huán)境中長期接觸而傳遞遺傳物質(zhì)[6-7]。油脂植物內(nèi)生真菌能否產(chǎn)生與其宿主相同的代謝產(chǎn)物？許多研究者對此進行了相關(guān)研究，并從油脂植物內(nèi)生真菌中篩選出產(chǎn)油菌株。游玲等[8]對油樟〔Cinnamomumlongepaniculatum(Gamble) N. Chao ex H. W. Li〕的產(chǎn)油脂內(nèi)生真菌進行了初步研究；戴傳超等[9]對大戟科(Euphorbiaceae)4種藥用植物及其內(nèi)生真菌的脂肪酸組分進行了比較研究；作者所在的研究團隊曾對桉樹(Eucalyptussp.)和雷公藤(TripterygiumwilfordiiHook. f.)等樹種的內(nèi)生真菌進行了較為廣泛的研究[10-13]。

馬尾松(PinusmassonianaLamb.)是國產(chǎn)松屬(PinusLinn.)中分布最廣的重要用材樹種，富含松脂，是中國主要的產(chǎn)脂樹種。內(nèi)生真菌與馬尾松協(xié)同進化，有可能產(chǎn)生與其宿主相同的代謝產(chǎn)物，但有關(guān)馬尾松內(nèi)生真菌產(chǎn)油脂的研究未見報道。為此，作者對馬尾松不同部位的內(nèi)生真菌進行分離，從中篩選出產(chǎn)油脂菌株；并采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定方法對菌種進行初步鑒定，以期為馬尾松內(nèi)生真菌的開發(fā)利用奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

馬尾松樣株種植于福建省漳平五一國有林場，于2011年6月挑選15株生長性狀良好、無病蟲害癥狀的健康植株，各株分別采集根、莖和葉片；其中根、莖樣品均采集10 cm以上的條段，用沾水的棉花包住根的兩端和枝條底部帶回實驗室，備用。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生真菌的分離、培養(yǎng)和菌體收集 參照文獻[14-16]采用組織塊法分離內(nèi)生真菌。將馬尾松根、莖和葉片分別剪成3～5 cm小段，用蒸餾水沖洗干凈后用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇表面消毒2～5 min，然后再用體積分?jǐn)?shù) 0.1%HgCl2進一步消毒10～30 s，最后用無菌水沖洗3次。無菌條件下吸干表面水分，用刀片將根和莖切成3 mm×3 mm的小片、將葉片切成3 mm的小段，接入PDA培養(yǎng)基平板上，置于27 ℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)3～7 d。待組織塊周圍長出菌絲后，挑取尖端菌絲移至新的PDA培養(yǎng)基中，逐步純化獲得純培養(yǎng)物。分離純化后的菌株接種于斜面培養(yǎng)基上保存、備用。

挑取菌絲塊接種于200 mL馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中，于27 ℃、125 r·min-1條件下培養(yǎng)7 d；用4層紗布過濾菌體后用蒸餾水充分洗滌，于65 ℃烘干至恒質(zhì)量,備用。

1.2.2 產(chǎn)油脂菌株的初步篩選 參照文獻[17]進行內(nèi)生真菌油脂含量的初步檢測。取少許振蕩培養(yǎng)的菌絲，吸干液體培養(yǎng)基后加入蘇丹黑染液(參照文獻[18]配制)1～2 mL，于室溫染色5 min，然后將菌絲用水洗滌5 min；挑取菌絲制作臨時裝片，鏡檢觀察菌絲內(nèi)油滴的數(shù)量、大小和顏色[7]。

1.2.3 油脂提取及含量測定 用酸熱法[19]提取油脂。稱取一定量菌體，按1 g 菌體加入10 mL 的比例加入4 mol·L-1HCl，振蕩混勻后室溫放置30 min，沸水浴處理10 min后立即于-20 ℃速冷30 min；加入2倍體積V(三氯甲烷)∶V(甲醇)=1∶1提取液，充分振蕩后于5 000 r·min-1離心5 min；取三氯甲烷層，加等體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%NaCl溶液，混勻后于 5 000 r·min-1離心5 min；將三氯甲烷層揮發(fā)除去溶劑后獲得油脂，稱取油脂質(zhì)量。油脂質(zhì)量與菌體干質(zhì)量的百分比即為油脂含量[7]。實驗重復(fù)3次。

1.2.4 菌種的形態(tài)學(xué)鑒定 挑取純化的真菌菌絲接種于PDA培養(yǎng)基上，采用3點接種法培養(yǎng)，肉眼觀察菌落正反面特征；采用直接挑取制片法或載玻片培養(yǎng)法對孢子進行顯微觀察。根據(jù)菌絲體和孢子的形態(tài)特征、參照文獻[20]對菌株進行初步鑒定。

1.2.5 菌種的分子生物學(xué)鑒定 利用核糖體ITS片段對菌種進行分子生物學(xué)鑒定

1.2.5.1 基因組DNA提取 采用CTAB法[21-22]提取基因組DNA，稍作改進。待測菌株用100 mL馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液搖瓶培養(yǎng)5～6 d，4層紗布過濾，吸干培養(yǎng)基后將菌絲體冷凍干燥。將干燥的菌絲體在液氮中研磨3次至粉狀，加入2 mL事先預(yù)熱至65 ℃的CTAB提取液及20 μL巰基乙醇，混勻后于65 ℃溫浴1 h；加入等體積的V(苯酚)∶V(三氯甲烷)∶V(異戊醇) =25∶24∶1混合液，10 000 r·min-1離心10 min，上清液重復(fù)1次上述步驟；于上清液中加入0.7倍體積異丙醇，4 ℃靜置10 min后，于10 000 r·min-1離心10 min，沉淀用預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)70%乙醇洗滌2次后吸干溶劑，獲得的DNA用200 μL DDW溶解；用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.8%～1.2%瓊脂糖(50 mL瓊脂糖加入1 μL EB)電泳檢測DNA純度。

1.2.5.2 PCR擴增和測序 參照文獻[23]進行ITS片段擴增。PCR擴增引物為真菌核糖體DNA通用引物ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)(上海生工生物技術(shù)有限公司)，用ABI 9700型PCR儀進行PCR擴增。PCR擴增反應(yīng)體系總體積25 μL，包含10×PCR Buffer 2.5 μL (Mg2+free)、 50 mmol·L-1Mg2+0.8 μL、10 mmol·L-1dNTPs 0.5 μL、10 μmol·L-1ITS5 0.5 μL、10 μmol·L-1ITS4 0.5 μL、5 U·μL-1PlantinumTaqDNA聚合酶0.2 μL、模板DNA 1 μL和重蒸水 19 μL。 擴增程序為： 95 ℃預(yù)變性3 min； 95 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸50 s，共38個循環(huán)；最后于72 ℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%瓊脂糖電泳檢測，電泳產(chǎn)物用Axygen凝膠回收試劑盒(美國Axygen公司)回收純化(操作步驟按照產(chǎn)品說明書進行)；純化產(chǎn)物由上海英駿生物技術(shù)有限公司采用ABI 3730型測序儀測序。

將測序得到的ITS片段序列與GenBank核酸數(shù)據(jù)庫中相應(yīng)的序列進行BLAST分析，利用ClustalX 2.1軟件進行多序列比對[24]；應(yīng)用MEGA 5.0軟件中的Neighbor-joining(NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[25-26]，自展值設(shè)為1 000。

2 結(jié)果和分析

2.1 內(nèi)生真菌分離結(jié)果

從馬尾松根、莖和葉片中分離出21株不同形態(tài)的真菌菌株。其中，從根中分離出4株，占總菌株數(shù)量的19.05%；從莖中分離出6株，占總菌株數(shù)量的28.57%；從葉片中分離出11株，占總菌株數(shù)量的52.38%。從葉片中分離獲得的真菌菌株數(shù)量最多。

2.2 產(chǎn)油脂菌株的初步篩選及油脂含量比較

鑒定結(jié)果顯示：在分離獲得的21株馬尾松內(nèi)生真菌菌株中，有14株內(nèi)生真菌的菌絲內(nèi)有油滴存在；其中，油滴較大較多的3株菌株分別為ZP-1、ZP-2和ZP-3，分別分離自馬尾松的葉片、根和莖。

菌株ZP-1、ZP-2和ZP-3的油脂含量見表1。結(jié)果顯示：菌株ZP-1、ZP-2和ZP-3的平均油脂含量分別為細胞干質(zhì)量的29.12%、25.03%和30.56%，其中分離自莖的菌株ZP-3的平均油脂含量最高，3株內(nèi)生真菌的平均油脂含量均在20%以上。方差分析結(jié)果表明：在α=0.01水平上，F(xiàn)(2, 6)=10.92，F(xiàn)=96.48, 表明3株菌株的油脂含量差異極顯著。

表1 分離自馬尾松葉片、根和莖的3株內(nèi)生真菌油脂含量比較

2.3 菌株的分類鑒定結(jié)果

2.3.1 菌株的形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果 分離自馬尾松葉片、根和莖的內(nèi)生真菌菌株ZP-1、ZP-2和ZP-3的菌落形態(tài)見圖1。菌株ZP-1的菌落呈淡紫色，短絨毛狀且較致密；分生孢子梗呈近球形，在菌絲端或短莖上輪生，初步鑒定菌株ZP-1屬于擬青霉屬(PaecilomycesBainier)。菌株ZP-2的菌落呈白色，絨毛狀；分生孢子橢圓形或圓柱形，初步鑒定菌株ZP-2屬于生赤殼菌屬(BionectriaSpeg.)。菌株ZP-3的菌落呈桃紅色，表面潮濕、菌絲密集，氣生菌絲發(fā)達并呈絨毛狀；小型分生孢子呈卵圓形或紡錘形，大型分生孢子呈鐮刀形，初步鑒定菌株ZP-3屬于鐮刀菌屬(FusariumLink)。

1. 菌株ZP-1菌落正面 Colony front of strain ZP-1; 2. 菌株ZP-1菌落背面 Colony back of strain ZP-1; 3. 菌株ZP-2菌落正面 Colony front of strain ZP-2; 4. 菌株ZP-2菌落背面 Colony back of strain ZP-2; 5. 菌株ZP-3菌落正面 Colony front of strain ZP-3; 6. 菌株ZP-3菌落背面 Colony back of strain ZP-3.

2.3.2 菌株的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果 用真菌通用引物ITS5和ITS4對分離自馬尾松葉片、根和莖的內(nèi)生真菌菌株ZP-1、ZP-2和ZP-3的核糖體DNA ITS片段進行擴增，獲得的ITS序列與GenBank中的相關(guān)序列進行比對分析。研究結(jié)果表明：菌株ZP-1與擬青霉屬種類的ITS序列相似性達到99%；菌株ZP-2與生赤殼菌屬種類的ITS序列相似性達到99%；菌株ZP-3與鐮刀菌屬種類的ITS序列相似性達到99%。Landeweert等[27]認(rèn)為：ITS序列相似性大于或等于99%，鑒別為相同種；ITS序列相似性大于95%但小于99%，鑒別為相同屬；ITS序列相似性序列相似性小于或等于95%，鑒別為相同科。根據(jù)這一標(biāo)準(zhǔn)，可對3株菌株的菌種進行鑒定。

菌株ZP-1、ZP-2和ZP-3與相似真菌的NJ系統(tǒng)樹分別見圖2、圖3和圖4。在各自的系統(tǒng)樹上菌株ZP-1與Purpureocilliumlilacinum(KC790527.1) 聚在同一個分支(圖2)， 菌株ZP-2與Bionectriasp. EXMQ-9 (FJ233188.1)聚在同一個分支(圖3)， 菌株ZP-3與Fusariumsp. JJP-2009a (FJ210605.1)和Fusariumsp. R2 (JX391934.1)聚在同一個分支(圖4)，表明它們之間均有密切的親緣關(guān)系。

分支上的數(shù)值代表1 000次重復(fù)抽樣檢測的自展支持率 The datums on the branches indicate the bootstrap value of 1 000 replications.

分支上的數(shù)值代表1 000次重復(fù)抽樣檢測的自展支持率 The datums on the branches indicate the bootstrap value of 1 000 replications.

分支上的數(shù)值代表1 000次重復(fù)抽樣檢測的自展支持率 The datums on the branches indicate the bootstrap value of 1 000 replications.

綜合分析分子生物學(xué)和形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，初步鑒定菌株ZP-1屬于半知菌亞門(Deuteromycotina)絲孢綱(Hyphomycetes)絲孢目(Hyphomycetales)絲孢科(Hyphomycetaceae)擬青霉屬菌種；菌株ZP-2屬于子囊菌門(Ascomycota)子囊菌綱(Ascomycetes)肉座菌目(Hypocreales)生赤殼科(Bionectriaceae)生赤殼菌屬菌種；菌株ZP-3屬于鐮刀菌屬，鐮刀菌屬又稱鐮孢霉屬，無性時期屬于半知菌亞門(Deuteromycotina)絲孢綱(Hyphomycetes)瘤座孢目(Tuberculariales)瘤座孢科(Tuberculariaceae)，有性時期屬于子囊菌亞門(Ascomycota)，有性態(tài)常為赤霉屬(GibberellaSacc.)。

3 討 論

上述研究結(jié)果表明：馬尾松不同器官內(nèi)生真菌的數(shù)量差異較大，其中從葉片中獲得的內(nèi)生真菌菌株數(shù)量多于根和莖，這與其他樹種不同器官內(nèi)生真菌的分布規(guī)律有差異。宋萍等[13]的研究結(jié)果顯示：從雷公藤枝中分離獲得的內(nèi)生真菌菌株數(shù)量多于根和葉；高智輝等[28]的研究結(jié)果顯示：在核桃(JuglansregiaLinn.)的根、莖和葉中，從莖部獲得的內(nèi)生真菌最多，從根部獲得的內(nèi)生真菌最少；竇學(xué)娥[29]從桑樹(MorusalbaLinn.)根部分離獲得的內(nèi)生真菌數(shù)量最多，莖部次之，桑樹葉片中內(nèi)生真菌最少。在馬尾松內(nèi)生真菌的分離過程中，由于其根和莖會分泌較多油脂，阻礙了根、莖組織塊與PDA培養(yǎng)基的接觸，而且散布在培養(yǎng)基表面的油脂對內(nèi)生真菌的生長也不利，因而，從馬尾松根和莖獲得的內(nèi)生真菌較少。而從馬尾松根部獲得的內(nèi)生真菌數(shù)量最少，與根系分泌物對根際微生物生長的影響有一定關(guān)系[12]。如何消除馬尾松根、莖內(nèi)油脂分泌對內(nèi)生真菌分離的影響？則有待進一步研究。

植物內(nèi)生真菌的數(shù)量和種類還與寄主植物種類、生長年限、生長環(huán)境、氣候條件、取樣時間、取樣數(shù)量以及分離方法等因素有關(guān)。本研究中，由于采樣數(shù)量和采樣地點有限，馬尾松內(nèi)生真菌的數(shù)量和種類也存在一定的局限性。

內(nèi)生真菌與宿主長期協(xié)同進化，極有可能具有與宿主植物相同的次生代謝產(chǎn)物合成途徑，所以，從油脂植物內(nèi)生真菌中尋找產(chǎn)油菌株是一條可行的途徑[7]。馬尾松富含松脂，是中國主要產(chǎn)脂樹種，內(nèi)生真菌與馬尾松長期共生，可能產(chǎn)生與其宿主相同的代謝產(chǎn)物。研究結(jié)果表明：馬尾松內(nèi)生真菌中存在大量產(chǎn)油菌株，其中的菌株ZP-1、ZP-2和ZP-3的油脂含量均在20%以上。一般認(rèn)為，油脂含量超過其生物體總量20%的微生物為產(chǎn)油微生物[30]，因而，馬尾松內(nèi)生真菌菌株ZP-1、ZP-2和ZP-3可確定為產(chǎn)油脂內(nèi)生真菌，它們是可用于微生物油脂生產(chǎn)的物種新資源，為進一步開發(fā)生物柴油的新油源奠定了基礎(chǔ)。但這些菌株所產(chǎn)油脂的化學(xué)組成是否與松脂相似？是否可以直接用馬尾松內(nèi)生真菌的油脂提取物研制松脂？則有待進一步研究。內(nèi)生真菌在植物生長發(fā)育和系統(tǒng)演化過程中有重要作用，其代謝物能夠促進植物生長并能增強植物的抗逆性，但產(chǎn)油脂內(nèi)生真菌與馬尾松松脂產(chǎn)生的關(guān)系則有待進一步確定。

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