基于psbA-trnH序列變異分析川明參屬親緣關系及分類地位

宋春鳳， 吳寶成， 周 偉， 劉啟新

〔江蘇省·中國科學院植物研究所(南京中山植物園), 江蘇 南京 210014〕

在國產傘形科(Apiaceae)植物中有2個中國特有單種屬：一是川明參屬(ChuanminshenSheh et Shan)，隸屬于前胡族(Trib. Peucedaneae)，僅有川明參(C.violaceumSheh et Shan)1種，分布于四川；二是明黨參屬(ChangiumH. Wolff)，隸屬于美味芹族(Trib. Smyrnieae)，屬下種類為明黨參(C.smyrnioidesH. Wolff)，分布區(qū)域從與四川接壤的湖北一直向東分布至江西、安徽、江蘇和浙江等省。這2個種不僅分布區(qū)域上有交接，而且根、莖和葉等外部形態(tài)特征非常相似，生長習性、花期以及藥材功效等也十分相近，在民間曾被混作為藥材 “明黨參”入藥[1-3]。

川明參與明黨參分屬于不同族，主要因為二者的果實特征差異明顯，前者分生果背腹面明顯扁壓，被置于前胡族中；而后者分生果橫切面近圓形，被置于美味芹族中[4]。邱英雄等[5]和陶曉瑜等[6]基于ISSR標記以及核基因ITS序列的研究，認為川明參屬應置于美味芹族并靠近明黨參屬。這一建議與川明參屬在經典分類中原有的系統(tǒng)位置分歧較大。但要最終確定川明參屬的系統(tǒng)分類地位，還需要多學科的研究證據以及補充更多的基因片段資料。

在眾多的適宜于研究物種進化的基因中，葉綠體基因psbA-trnH片段是進化速率最快的葉綠體DNA間隔區(qū)之一[7-12]，被廣泛應用于被子植物分子系統(tǒng)樹構建及物種鑒別[8-11]。

作者對川明參屬的psbA-trnH片段進行克隆測序，并選取前胡族和美味芹族的代表類群(包括明黨參)、以針果芹族(Trib. Scandicineae)種類為外類群，基于psbA-trnH片段序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹；結合外部形態(tài)和內部解剖結構，探討川明參與明黨參間及其與前胡族和美味芹族種類間的親緣關系，為川明參屬分類地位的確定提供分子系統(tǒng)學研究證據。

1 材料和方法

1.1 材料

供試川明參、明黨參、華中前胡(PeucedanummedicumDunn)和泰山前胡〔P.wawrae(H. Wolff) Su〕以及寶興棱子芹(PleurospermumdavidiiFranch.)、麗江棱子芹(P.foetensFranch.)和雞冠棱子芹(P.cristatumde Boiss.)的幼嫩葉片于2009年至2010年采自野外，采集地點及憑證標本信息見表1；每份樣品3～5枚葉片，用硅膠迅速干燥后供試。研究涉及15個種類，包括美味芹族的5屬7種、前胡族5屬7種以及針果芹族1種，除前述7種外，另8個種類的psbA-trnH序列均引自GenBank。

1.2 實驗方法

1.2.1 總DNA提取 采用改良的2×CTAB法[13]提取基因組總DNA，并用質量體積分數1.2%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下通過Tanon 2500型凝膠成像系統(tǒng)測定DNA濃度。將獲得的總DNA稀釋20倍后作為模板用于PCR 擴增。

1.2.2 擴增與純化 采用Sang等[14]和Tate等[15]設計的通用引物trnH(CGCGCATGGTGGATTCACAATC)和psbA(GTTATGCATGAACGTAATGCTC)進行PCR擴增。

表1 川明參和供試傘形科相關種類的憑證標本信息

首先采用20 μL反應體系進行預擴增，檢測之后再將擴增體系總體積增加到80 μL。20 μL反應體系包括：10×TaqBuffer 2 μL，25 mmol·L-1MgCl22 μL，2.5 mmol·L-1dNTPs 2 μL，2 mmol·L-1上、下游引物各2 μL，重蒸水9.2 μL，模板DNA 0.8 μL和TaqDNA聚合酶0.15 μL。

用MG96G 型PCR儀(Long Gene公司)進行PCR擴增反應。擴增程序為：94 ℃預變性3 min；然后于94 ℃變性1 min、52 ℃退火45 s、72 ℃延伸1 min，重復循環(huán)30次；最后于72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。擴增產物經質量體積分數0.8%瓊脂糖凝膠電泳后，用Tanon 2500圖像分析儀觀察。反應產物采用Axygen凝膠純化試劑盒進行純化。

1.2.3 測序 PCR 產物純化后直接用ABI 3730型基因分析儀測序，由華大基因科技有限公司完成。

1.3 數據分析

采用Sequencher 4.5軟件對獲得的序列進行校正，然后用BioEdit 7.0.4.1軟件進行比對和對位排列[16]并手工校正。用MEGA 5.05軟件將排序后的序列組成數據矩陣，統(tǒng)計各種類的GC含量及變異位點和信息位點；根據Kimura 2-parameter法計算各種類間的相對遺傳距離[17]。將序列格式轉換為Nexus格式，堿基處理作Fitch性狀(無序)、空位(gap)作缺失(missing)狀態(tài)分析，利用PAUP4.0 beta 10 win軟件進行統(tǒng)計和分支分析[18]，構建最大似然法(ML)與最大簡約法(MP)系統(tǒng)發(fā)育樹，并用自展法(bootstrap)對系統(tǒng)發(fā)育樹進行檢測，自展重復次數1 000次。最后用MrBayes V3.1.2中的貝葉斯方法構建BI系統(tǒng)發(fā)育樹。構建ML和BI系統(tǒng)樹前，先用Modeltest 3.7軟件選擇堿基替換模型并估計相關參數；經運算，獲得最適的堿基替換模型為K81uf+G，相關參數為：-lnL=2 037.089 6，K=6； 堿基A、 C、 G和T的頻率分別為 0.348 0、0.132 9、0.167 5和0.351 7。

2 結果和分析

2.1 供試種類的psbA-trnH長度與GC含量比較

從川明參以及明黨參、華中前胡、泰山前胡、寶興棱子芹、麗江棱子芹和雞冠棱子芹7個種類的cpDNA中克隆獲得psbA-trnH 片段并測序，各種類的psbA-trnH 片段序列已提交至GenBank；各種類psbA-trnH 片段的GenBank登錄號依次為KF557756、KF557757、 KF557758、KF557759、KF557760、KF557761和KF557762(表2)。

校正后川明參和明黨參的psbA-trnH片段長度均為258 bp(表2)，其余種類的psbA-trnH片段長度為228～405 bp，各種類psbA-trnH片段長度均存在差異。人工排序后psbA-trnH 片段序列總長度為553 bp(包括空位)；其中，變異位點237個，占位點總數的42.9%；信息位點178個，占位點總數的32.2%。

由表2可見：川明參和明黨參psbA-trnH片段的GC含量均為23%，其他種類的為26%～35%。川明參和明黨參psbA-trnH片段的GC含量最低，主要原因是它們的psbA-trnH片段序列包含多個A和T的重復序列。 由于每個種類DNA的GC含量恒定，不會因環(huán)境條件和培養(yǎng)條件等因子的變化而改變，且在同屬不同種間DNA的GC含量差異不大，因此可利用GC含量研究種間或屬間的親緣關系及其遠近程度。

根據psbA-trnH片段長度和GC含量可以得出2個明確結果：一是在選取的植物種類中psbA-trnH片段可提供的變異位點和信息位點較多，說明在傘形科的族間和屬間的系統(tǒng)發(fā)育重建研究中psbA-trnH片段可以提供較豐富的變異信息；二是川明參的psbA-trnH片段長度及GC含量均與明黨參相同，說明二者可能具有較近的親緣關系。

表2 川明參和供試傘形科相關種類的psbA-trnH片段序列長度、GC含量和GenBank登錄號

2.2 供試種類相對遺傳距離分析

基于psbA-trnH片段序列計算15個供試種類間的相對遺傳距離，結果見表3。川明參與屬于前胡族的前胡屬(PeucedanumLinn.)種類華中前胡和泰山前胡，阿魏屬(FerulaLinn.)種類草地阿魏(F.kingdon-wardiiH. Wolff)，大瓣芹屬(SemenoviaRegel et Herder)種類密毛大瓣芹〔S.pimpinelloides(Nevski) Manden.〕及當歸屬(AngelicaLinn.)種類白芷(A.dahuricaBenth. et Hook.)和狹葉當歸(A.anomalaAve-Lall.)間的相對遺傳距離均超過1，而與屬于美味芹族的明黨參、棱子芹屬(PleurospermumHoffm.)種類寶興棱子芹和麗江棱子芹及雞冠棱子芹、舟瓣芹屬(SinolimprichtiaH. Wolff)種類舟瓣芹(S.alpineH. Wolff)、羌活屬(Notopterygiumde Boiss.)種類寬葉羌活(N.franchetiiC.T. Ting ex H.T. Chang)和瘤果芹屬(TrachydiumLindl.)種類瘤果芹(T.royleiLindl.)間的相對遺傳距離均小于0.12。說明川明參與供試前胡族各種類間的親緣關系較遠，而與美味芹族各種類間的親緣關系則較近。

表3 基于psbA-trnH片段序列的川明參和明黨參與供試傘形科相關種類間的相對遺傳距離

此外，川明參與明黨參的相對遺傳距離僅為0.02，甚至與某些同屬種類間的相對遺傳距離相同，如棱子芹屬寶興棱子芹、麗江棱子芹和雞冠棱子芹3種之間的相對遺傳距離也為0.02，說明川明參與明黨參間具有極近的親緣關系。但要判斷川明參與明黨參能否歸為同屬則仍需多學科的研究證據加以驗證。

2.3 供試種類分子系統(tǒng)發(fā)育樹的比較和分析

以刺果芹〔Turgenialatifolia(Linn.) Hoffm.〕作為外類群，根據測序所得的psbA-trnH片段序列，分別構建MP、ML以及BI系統(tǒng)樹，結果見圖1、圖2和圖3。結果顯示：3類系統(tǒng)樹在拓撲結構上稍有區(qū)別。除去外類群，MP系統(tǒng)樹分為2大支：一大支(Ⅰ)由川明參、明黨參以及美味芹族的舟瓣芹、寬葉羌活、3個棱子芹屬種類和瘤果芹構成(美味芹族分支)；另一大支(Ⅱ)由前胡族的草地阿魏、2個前胡屬種類、密毛大瓣芹和2個當歸屬種類構成(前胡族分支)(圖1)。但在ML和BI系統(tǒng)樹中，草地阿魏獨立出來并位于系統(tǒng)樹基部，與前胡族和美味芹族分支成為姐妹類群；除去個別小分支的拓撲結構不同之外，ML和BI系統(tǒng)樹的大分支結構與MP系統(tǒng)樹基本相同，來自美味芹族的種類聚為一支(Ⅰ)，而前胡族種類聚為另一支(Ⅱ)(圖2和圖3)。ML和BI系統(tǒng)樹的拓撲結構比較相似，大的分支結構基本相同，僅美味芹族分支中舟瓣芹和寬葉羌活的位置有所變化，前胡族分支中密毛大瓣芹的位置也稍有不同。

美味芹族分支又可分成多個小支。川明參與明黨參聚為1個小支；棱子芹屬的3個種類與瘤果芹組成1個小支；舟瓣芹的位置變化較大，在MP和BI系統(tǒng)樹中均與川明參聚在同一個分支，但在ML系統(tǒng)樹中卻位于美味芹族分支的最外部；而寬葉羌活的位置也稍有變化，在MP和ML系統(tǒng)樹上均與川明參聚為同一個分支，但在BI系統(tǒng)樹上卻與棱子芹屬種類聚為同一分支。

1. 川明參 Chuanminshen violaceum Sheh et Shan； 2. 明黨參 Changium smyrnioides H. Wolff; 3. 舟瓣芹 Sinolimprichtia alpine H. Wolff; 4. 華中前胡 Peucedanum medicum Dunn; 5. 泰山前胡 Peucedanum wawrae (H. Wolff) Su; 6. 寶興棱子芹 Pleurospermum davidii Franch.; 7. 麗江棱子芹 Pleurospermum foetens Franch.; 8. 雞冠棱子芹 Pleurospermum cristatum de Boiss.; 9. 瘤果芹 Trachydium roylei Lindl.; 10. 寬葉羌活 Notopterygium franchetii C.T. Ting ex H.T. Chang; 11. 草地阿魏 Ferula kingdon-wardii H. Wolff; 12. 密毛大瓣芹 Semenovia pimpinelloides (Nevski) Manden.; 13. 白芷 Angelica dahurica Benth. et Hook.; 14. 狹葉當歸 Angelica anomala Ave-Lall.; 15. 刺果芹 Turgenia latifolia (Linn.) Hoffm. Ⅰ. 美味芹族分支Clade of Trib. Smyrnieae; Ⅱ. 前胡族分支Clade of Trib. Peucedaneae. 分支上的數字為自展支持率 Numbers on the branches are the bootstrap values.

1. 川明參 Chuanminshen violaceum Sheh et Shan； 2. 明黨參 Changium smyrnioides H. Wolff; 3. 舟瓣芹 Sinolimprichtia alpine H. Wolff; 4. 華中前胡 Peucedanum medicum Dunn; 5. 泰山前胡 Peucedanum wawrae (H. Wolff) Su; 6. 寶興棱子芹 Pleurospermum davidii Franch.; 7. 麗江棱子芹 Pleurospermum foetens Franch.; 8. 雞冠棱子芹 Pleurospermum cristatum de Boiss.; 9. 瘤果芹 Trachydium roylei Lindl.; 10. 寬葉羌活 Notopterygium franchetii C.T. Ting ex H.T. Chang; 11. 草地阿魏 Ferula kingdon-wardii H. Wolff; 12. 密毛大瓣芹 Semenovia pimpinelloides (Nevski) Manden.; 13. 白芷 Angelica dahurica Benth. et Hook.; 14. 狹葉當歸 Angelica anomala Ave-Lall.; 15. 刺果芹 Turgenia latifolia (Linn.) Hoffm. Ⅰ. 美味芹族分支Clade of Trib. Smyrnieae; Ⅱ. 前胡族分支Clade of Trib. Peucedaneae. 分支上的數字為自展支持率 Numbers on the branches are the bootstrap values.

前胡族分支也可分為數個小支。泰山前胡和華中前胡始終聚為1個小支，當歸屬的狹葉當歸和白芷也始終聚為1個小支；但密毛大瓣芹的位置變化較大，在ML系統(tǒng)樹中位于前胡屬和當歸屬2個小支的外部，而在MP和BI系統(tǒng)樹中均與當歸屬的2個種類聚為1個小支；草地阿魏位置比較特殊，在MP系統(tǒng)樹中聚在前胡族分支中，而在ML和BI系統(tǒng)樹中則從前胡族分支中劃出并獨立于系統(tǒng)樹基部，因而，阿魏屬的系統(tǒng)關系也有待進一步探討。

3 討論和結論

3.1 psbA-trnH 片段在傘形科屬間分類中的應用

從MP、ML及BI系統(tǒng)樹可見：基于psbA-trnH片段序列分析建立族內屬間的系統(tǒng)樹，3種方法都具有比較理想的效果，說明psbA-trnH片段適用于川明參屬與前胡族和美味芹族種類的親緣關系分析。psbA-trnH 片段已被廣泛用作被子植物物種鑒別的條形碼，但目前該片段應用面臨的最大困難是非同屬物種間的序列比對，主要是插入/缺失位點過多所致[19]。本研究中，不同屬種類的psbA-trnH片段序列的插入和缺失位點也較多，因此序列比對和人工校正相對比較繁瑣；但該片段序列提供的變異位點也較多，可為族內屬間的系統(tǒng)發(fā)育重建研究提供較豐富的信息。本項目組對供試種類也進行了基于ITS序列分析的分子系統(tǒng)學研究(另文發(fā)表)，得到的結果與其他研究者[5-6]的研究結果基本相同。因此，在傘形科屬間系統(tǒng)關系研究中也可使用psbA-trnH片段；而在實際研究過程中也可1個或多個條形碼片段組合使用。

3.2 川明參屬分類地位的探討

川明參在獨立成屬之前曾作為藥材“明黨參”使用。由于其分生果具有果體背腹壓扁和側棱稍寬等特征，1980年佘孟蘭和單人驊將其從美味芹族明黨參屬中分出，獨立為新屬并歸入前胡族[4]。從經典分類上看，這種分類處理有其合理性，因為果實強烈背腹壓扁和側棱發(fā)達是前胡族種類的特征之一。

從基于psbA-trnH片段構建的3類系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出：川明參總是與供試的美味芹族種類聚為一大支，而供試的前胡族種類則聚為另一大支。并且川明參與供試前胡族種類間的相對遺傳距離較大(基本均大于1)，而與供試的美味芹族種類的相對遺傳距離較小(小于0.2)。說明川明參與前胡族關系較遠，與美味芹族的關系較近。以上結果均支持將川明參從前胡族調整到美味芹族的分類處理。

此外，近年來的相關研究結果也與傳統(tǒng)的經典分類觀點不同?；菁t等[20]通過傘形科前胡族的血清系統(tǒng)學研究，認為川明參屬與前胡族其他屬的親緣關系較遠；邱英雄等[5]和陶曉瑜等[6]基于ISSR標記分析及ITS片段分析結果，提出將川明參置于美味芹族的分類觀點；Zhou等[21]對包括明黨參和川明參在內的10個中國傘形科特有種進行了分子系統(tǒng)進化研究，確定明黨參屬和川明參屬共同位于同一分支中。由此可見，目前將川明參屬置于前胡族中的分類處理不甚合理，建議將川明參屬重新歸入美味芹族。

3.3 川明參與明黨參親緣關系的分析

上述的MP、ML和BI系統(tǒng)樹均顯示川明參與明黨參聚在一起，說明二者的親緣關系非常近。從相對遺傳距離來看，川明參與明黨參間的相對遺傳距離較小，僅為0.02，等同于傘形科某些屬內種間的相對遺傳距離，如供試棱子芹屬的3個種類間的相對遺傳距離也為0.02；但有些屬間種類的相對遺傳距離也較小，如密毛大瓣芹和2個當歸屬種類間的相對遺傳距離也僅為0.02。說明川明參與明黨參的親緣關系極近，二者互為姐妹類群，但要判斷川明參與明黨參分屬于不同屬還是同一個屬則需依據其他學科證據的驗證。

川明參和明黨參的外部形態(tài)特征和果實解剖特征有許多相似之處[22-24]：從外部形態(tài)看，二者的植株和果實發(fā)育季節(jié)和過程均比較相近；成熟果實表面皺縮，可看到突起的油管。從果實發(fā)育過程的解剖結構看，二者在幼果期都存在一段有角的五邊形時期，可稱之為果實發(fā)育的“五邊態(tài)”，并且二者的胚乳發(fā)育趨勢以及油管和維管束的分布方式和演化趨勢相同。這也佐證了川明參和明黨參具有較近的親緣關系。

果實形態(tài)特征是傘形科植物的重要分類依據，而川明參和明黨參的果實形態(tài)和解剖結構也存在一些差別。從橫切面形狀上看，川明參的成熟分生果橫切面為背腹極度壓扁的梭形，而明黨參的則為腎狀圓形；從油管數目上看，川明參果實棱槽處僅有1～2個油管，而明黨參果實棱槽處有3～4個油管；從胚乳形狀上看，明黨參成熟果實的胚乳形狀為“C”形，而川明參的則為新月形[22-24]。所以，依據果實壓扁類型和果棱突起程度劃分，川明參和明黨參應分別位于果實背腹壓扁且側棱發(fā)達和果實不甚壓扁且無果棱的2個類群中，也就是說應處理為2個獨立屬。

綜合分子系統(tǒng)學與形態(tài)學的研究證據，作者認為川明參屬應重新置于美味芹族中；而川明參屬與明黨參屬應處理為2個獨立屬，但因二者親緣關系較近，可并列為姐妹類群。

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