改良差異裂解法結(jié)合硅珠法提取混合斑精子DNA

韓海軍，張玉紅，楊敏，伊海，楊耕野，賈東濤，盧大儒

（1.復旦大學生命科學學院，上海200433；2.南通市公安局物證鑒定所，江蘇南通226007）

在性犯罪案件中，含有精液和女性成分混合斑是常見的生物檢材物證。一般先采用差異裂解法[1]消化女性成分，但在實際檢案中發(fā)現(xiàn)，因有些混合斑中的精子數(shù)量少或女性成分難以消化完全，常檢出混合基因型或女性DNA分型。2006年李鑫等[2]利用單細胞捕獲法、2009年邵武等[3]利用過濾膜法分離精子細胞取得了良好效果。本研究收集52例混合斑樣本，按常規(guī)差異裂解法和硅珠法提取精子DNA，檢測圖譜含有女性STR分型，經(jīng)采用改良差異裂解法結(jié)合硅珠法提取，以提高混合斑檢材中精子DNA分型有效檢出率。

1 材料與方法

1.1 樣本

52例經(jīng)常規(guī)差異裂解法[1]檢驗結(jié)果含有女性分型的混合斑檢材來自于本實驗室日常受理的案件，其中陰道拭子21例、內(nèi)褲26例、衛(wèi)生巾5例。

1.2 主要試劑和儀器

P30金標試紙條（北京芬格爾安公司），硅珠法試劑按文獻[4]配制，IdentifilerTM試劑盒、9700擴增儀、3130XL型遺傳分析儀（美國AB公司）。

1.3 方法

1.3.1 確證實驗

分別剪取混合斑樣本少量，浸泡后離心，取上清液分別經(jīng)P30金標試紙條檢測，均呈陽性反應。取沉淀少量涂片、酸性品紅亞甲基藍染色，高倍鏡下有8例檢見1~3個精子/每視野，44例未檢見精子，52例均檢見大量陰道上皮細胞。

1.3.2 精子分離

改良差異裂解法：分別剪取內(nèi)褲布片約2cm×2cm，衛(wèi)生巾外層紙約2cm×2cm，陰道拭子1枚（取外層棉花），剪碎后置入2mL試管中，加入1.6mL TES、160μL 10%SDS、16 μL PK（10 mg/mL），振蕩混勻后置于恒溫振蕩器56℃保溫2h以上，將液體轉(zhuǎn)移至另一2mL試管。以離心半徑5cm，12000r/min，離心3min，吸棄上清液，沉淀中加入1.6 mL TES、160 μL 10%SDS、16μL PK，振蕩混勻后置于恒溫振蕩器，56℃再次保溫3h以上，以離心半徑5cm，12000r/min離心3min，吸棄上清液，沉淀轉(zhuǎn)移至0.5mL試管，用300μL TES漂洗3次后備檢。

以上結(jié)果與采用常規(guī)差異裂解法進行精子分離檢驗結(jié)果進行比較。

1.3.3 精子DNA提取、擴增及檢測

在上述含提純后精子試管內(nèi)加入100 μL TES、20 μL SLS、4 μL DTT（1 mol/L）振蕩混勻后置于恒溫振蕩器99℃保溫5min。在上述消化液中加入吸附液300μL，渦旋混合5s，以離心半徑5cm，12000r/min，離心2 min，上清液轉(zhuǎn)移到另一0.5 mL的離心管中。加入20μL硅珠懸液，吸附15min，離心棄上清液。漂洗液洗滌1次，70%乙醇溶液洗滌3次，最后離心棄上清液，60℃揮干乙醇。加入20μL的TC，56℃保溫15min，離心后上清液用于PCR反應。

采用IdentifilerTM試劑盒進行復合擴增，PCR體系為10 μL，擴增產(chǎn)物在3130XL型遺傳分析儀上進行毛細管電泳，用GeneMapper ID-X軟件進行基因分型，混合樣本分析按文獻[5]方法進行。

2 結(jié)果

對比兩種分離方法的檢驗結(jié)果，改良差異裂解法男性分型檢出率得到了提高，達到98.08%（51例），而常規(guī)差異裂解法僅為42.31%（22例）（表1），對常見的內(nèi)褲、陰道拭子、衛(wèi)生巾等載體混合斑均有較好適應性（表2）。同一樣品用改良方法精子成分峰高比例明顯升高（圖1）。

表1 兩種分離方法檢驗結(jié)果對比 ［例（%）］

表2 3種載體混合斑中精子成分的有效檢出率 ［例（%）］

圖1 陰道拭子樣本的檢驗圖譜

3 討論

鄭秀芬等[5]認為能檢出混合樣品中少量成分等位基因的最高混合比例為1∶10；在混合比例為1∶20時，基本上檢測不出來自少量混合成分的等位基因，表現(xiàn)為單一組分圖譜。采用常規(guī)差異裂解法檢驗混合斑中微量精子，檢出女性單一型或男女混合型，分析原因可能是女性細胞難以消化完全，微量的精細胞在混合樣品中成分低于1∶10，甚至低于1∶20。女性細胞難以消化完全的原因主要是黏附于載體上的女性細胞洗脫效率低以及常規(guī)差異裂解液裂解效率低。改良差異裂解法從4個方面加以改良，以提高女性細胞消化效率：檢材中加入相應比例TES、SDS、PK，56℃保溫振蕩，利用溫度和SDS的作用增強洗脫效率，進行細胞洗脫的同時進行女性成分初步消化；去除載體，避免載體上難以洗脫的女性細胞進入下一步驟；加入相應比例消化液對女性成分進行二次消化；提高消化溫度至56℃，提高消化效率。

本研究選擇硅珠法提取微量精子的DNA，原理是在高濃度的硫氰酸胍的存在下，DNA能被硅珠特異性地吸附；去除條件后又可以釋放DNA。吸附DNA的硅珠經(jīng)過多次漂洗可將溶液中的PCR抑制物除去，因此提取的DNA比較純，回收率高。

綜上所述，改良差異裂解法結(jié)合硅珠法提高了混合斑中女性成分消化效率，極大程度提高了混合斑中男性分型檢出率。此改良方法操作簡單、效率高，無需特殊設備且費用低，適用于常見的混合斑檢材，在法醫(yī)物證檢案中有較高的應用價值。

[1]Gill P，Jeffreys AJ，Werrett DJ.Forensic application of DNA‘fingerprints’[J].Nature，1985，318（6046）：577-579.

[2]李鑫，胡蘭，郭紅玲，等.顯微操作法提取混合斑中精子細胞方法的探討[J].中國法醫(yī)學雜志，2006，21（5）：263-265.

[3]邵武，姜先華，孫學科，等.精子富集柱分離技術(shù)的研究[J].中國法醫(yī)學雜志，2009，24（3）：194-196.

[4]王林生，蘇勇，顧林崗.硅珠法提取PCR模板DNA[J].中國法醫(yī)學雜志，2000，15（1）：36-37.

[5]鄭秀芬，紀貴金，劉超，等.二組分混合DNA樣品STR圖譜解釋[J].中國法醫(yī)學雜志，2000，15（4）：203-207.