ALDH2基因多態(tài)性與乙醇代謝及外周乙醛積蓄程度的關(guān)系

熊卉，王薇，葉懿，顏有儀，肖敏，阮若云，廖林川

（四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，四川成都610041）

乙醇，俗稱酒精。飲酒后，乙醇通過胃腸道完全吸收入血，乙醛是乙醇在體內(nèi)氧化代謝的第一代謝產(chǎn)物，代謝過程涉及多個(gè)器官和酶系統(tǒng)。乙醛主要被乙醛脫氫酶（acetaldehyde dehydrogenase，ALDH）進(jìn)一步代謝為乙酸，并最終氧化成二氧化碳和水排出體外[1-2]。ALDH是乙醇在人體代謝過程中的關(guān)鍵酶，已被證實(shí)有12種不同基因編碼的同工酶，而ALDH2是唯一存在于線粒體內(nèi)，且與黃種人的飲酒行為密切相關(guān)的酶[3]。ALDH2具有高度遺傳多態(tài)性，其編碼的基因存在變異，隨編碼基因的不同，酶活性不同。

本實(shí)驗(yàn)采用靈敏、可靠的頂空氣相色譜法，同時(shí)測(cè)定血中乙醇及乙醛濃度，并得到一系列藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)，初步考察ALDH2基因多態(tài)性與乙醇代謝及乙醛外周積蓄的相關(guān)性，為完善乙醇藥代動(dòng)力學(xué)規(guī)律提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

收集無(wú)血緣關(guān)系志愿者14名，男性7名，女性7名，隨機(jī)編號(hào)為A~N，常規(guī)體檢及生化檢驗(yàn)結(jié)果證明肝腎功能均正常，無(wú)精神病史，常見鎮(zhèn)靜催眠藥和毒品尿檢板篩查均呈陰性。志愿者于受試前3d內(nèi)未飲酒，實(shí)驗(yàn)期間未服用藥物。

1.2 主要儀器與試劑

9700型PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)AB公司），CP-3800氣相色譜儀（美國(guó)Varian公司），DANI HSS 86.50自動(dòng)頂空進(jìn)樣儀（意大利DANI公司），Thermo Scientific Sorvall ST16R通用臺(tái)式離心機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）。

乙醛標(biāo)準(zhǔn)品（上海安譜科學(xué)儀器有限公司，批號(hào)1075400），乙醇標(biāo)準(zhǔn)品（美國(guó)Ceriliant公司），正丙醇（分析純，成都科龍化工試劑廠），正丁醇（分析純，北京化工廠），70%高氯酸（分析純，天津東方化工廠），去離子水經(jīng)優(yōu)普純水系統(tǒng)制備。

1.3 色譜條件

色譜柱：PEG-20M氣相色譜柱（50 m×0.53 mm，2 μm，美國(guó)安捷倫科技公司）；恒溫箱溫度：65℃；恒溫時(shí)間：10 min；進(jìn)樣間隔：12 min；程序升溫：初始溫度50℃，保持1.5min，然后以35℃/min升溫到85℃，保持4.5 min；進(jìn)樣口溫度：120℃；FID檢測(cè)器溫度：200℃；載氣：N2。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

乙醛儲(chǔ)備液：稱取乙醛標(biāo)準(zhǔn)品（98.9%）0.1047g，用新沸后冷卻至4℃的超純水定容至100 mL，得1.035×103μg/mL乙醛儲(chǔ)備液，4℃冰箱儲(chǔ)存待用。

乙醇儲(chǔ)備液：取2 mL乙醇標(biāo)準(zhǔn)品（99.5%），用新沸后冷卻至室溫的超純水定容至50 mL，得3.141×104μg/mL乙醇儲(chǔ)備液，4℃冰箱儲(chǔ)存待用。

高氯酸（PCA）溶液：取氯化鈉4.250 7 g，硫脲0.380 7 g，乙二胺四乙酸二鈉0.093 2 g，70%高氯酸28mL，超純水稀釋1000倍后的正丙醇0.8 mL，超純水稀釋100倍后的正丁醇2 mL，用煮沸過的超純水溶解定容至500mL，4℃冰箱儲(chǔ)存待用。

1.5 ALDH2基因型檢測(cè)

采集志愿者空白靜脈血1 mL，經(jīng)過鹽析法提取DNA，根據(jù)文獻(xiàn)[4]的方法，采用預(yù)設(shè)好的程序?qū)LDH2目的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增完成后，用限制性內(nèi)切酶MboⅡ進(jìn)行酶切，37℃水浴4h。采用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)銀染后觀察結(jié)果，以20 bp DNA Marker分子量標(biāo)準(zhǔn)物來(lái)確定酶切產(chǎn)物的位置。

1.6 飲酒劑量與血樣采集

給予志愿者按0.64 g/kg乙醇劑量啤酒[5]，30 min內(nèi)佐以零食（花生和紅薯?xiàng)l）飲完。飲酒前采集空白血樣1mL。從飲酒第一口計(jì)，于30min、45min、1h、1.5h、2h、3h、4h、5h和6h時(shí)間點(diǎn)，通過靜脈留置針從肘靜脈采血1mL，置于4℃冰箱保存，6h內(nèi)處理待檢。

1.7 樣品預(yù)處理

取血液0.5 mL置于提前預(yù)冷的塑料離心管中，加入1 mL PCA溶液，渦旋5 s，在0℃下以離心半徑10 cm，8000r/min，離心5min后，取1mL上清液轉(zhuǎn)移至20mL頂空瓶中，立即蓋上硅橡膠墊、鋁帽，用密封鉗密封后進(jìn)樣分析。乙醛沸點(diǎn)約為20℃，為避免乙醛揮發(fā)，操作全過程均在冰盒內(nèi)進(jìn)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 分析方法的選擇

有實(shí)驗(yàn)[6]采用Porapak填充柱的乙醇及其代謝物的頂空氣相色譜測(cè)定法，而本實(shí)驗(yàn)采用PEG毛細(xì)管色譜柱及自動(dòng)頂空進(jìn)樣儀，考察了色譜分離條件。

本實(shí)驗(yàn)考察了恒溫溫度為55℃、65℃、75℃、85℃的乙醛和乙醇峰面積，結(jié)果顯示，隨溫度的升高，乙醛和乙醇的峰面積也增加（表1），因此在滿足靈敏度的情況下，避免較高溫度下血液中揮發(fā)性較強(qiáng)的物質(zhì)進(jìn)入色譜系統(tǒng)造成干擾，選擇65℃為恒溫溫度。

表1 不同恒溫溫度下乙醛和乙醇的峰面積

另外，本實(shí)驗(yàn)還考察了恒溫時(shí)間為10、20、30min時(shí)的乙醛和乙醇峰面積，結(jié)果顯示，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，乙醛和乙醇的峰面積均變化不大（表2），因此選擇恒溫時(shí)間為10min。

表2 不同恒溫時(shí)間乙醛和乙醇的峰面積

對(duì)于乙醛和乙醇內(nèi)標(biāo)的選擇，本實(shí)驗(yàn)考察了叔丁醇、異丙醇、正丙醇和正丁醇，在選定前處理和色譜條件的情況下，四者出峰時(shí)間依次分別為2.249、2.453、3.435、4.844min，乙醛和乙醇的出峰時(shí)間分別為1.337、2.549min，異丙醇與乙醇有重疊，而叔丁醇多次進(jìn)樣顯示峰面積不穩(wěn)定，因此選擇正丙醇為乙醛的內(nèi)標(biāo)，正丁醇為乙醇的內(nèi)標(biāo)。

2.2 分析方法適用性評(píng)價(jià)

在選定的色譜條件下，乙醛、乙醇和內(nèi)標(biāo)對(duì)照品溶液、空白血樣和飲酒1 h后血樣結(jié)果顯示，乙醛和乙醇與相關(guān)物質(zhì)能完全分離，峰形良好，內(nèi)源性物質(zhì)不干擾測(cè)定。取高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度（乙醇為783.54、197.91、47.120μg/mL，乙醛為5.1772、1.0355、0.1035μg/mL）添加樣品各3份，按1.7項(xiàng)處理樣品后分別于當(dāng)日和不同日內(nèi)檢測(cè)，乙醛和乙醇方法回收率分別為96.1%~114.1%和90.2%~100.3%；乙醛和乙醇日內(nèi)精密度分別小于5.5%和1.8%，日間精密度分別小于6.7%和2.8%。取高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度添加樣品分別于4℃放置0、2、6h后，按1.7項(xiàng)處理樣品，分析結(jié)果表明，樣品存放于4℃冰箱中放置6h內(nèi)穩(wěn)定，精密度小于5.8%。

2.3 ALDH2分型結(jié)果及分組

根據(jù)電泳結(jié)果，14名志愿者ALDH2基因型分型，分為突變組9名（A、B、C、D、E、H、I、J、N）和野生組5名（F、G、K、L、M），基因型分別為突變雜合型ALDH2*1/*2和野生純合型ALDH2*1/*1。14名志愿者中，未見基因型ALDH2*2/*2。其中4例女性志愿者（A、B、C、E）在實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)嘔吐癥狀，退出實(shí)驗(yàn)。

2.4 血中乙醛、乙醇標(biāo)準(zhǔn)曲線

取適量乙醛和乙醇儲(chǔ)備液，分別用煮沸過的超純水配制成系列梯度質(zhì)量濃度，各取50μL加入0.4mL空白血液中，得乙醛質(zhì)量濃度為0、0.051772、0.10355、0.517 72、1.035 5、2.071 0、5.177 2 μg/mL和乙醇質(zhì)量濃度為0、47.120、100.53、197.91、392.68、783.54、1570.7μg/mL的添加血樣。按1.7項(xiàng)處理，并進(jìn)行色譜分析，記錄乙醛峰面積A1，正丙醇峰面積A2，乙醇峰面積A3，正丁醇峰面積A4。以乙醛質(zhì)量濃度x1（μg/mL）對(duì)乙醛和正丙醇峰面積之比y1（A1/A2）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程y1=1.3039x1-0.0188，決定系數(shù)R2=0.9993；以乙醇質(zhì)量濃度x2（μg/mL）對(duì)乙醇和正丁醇峰面積之比y2（A3/A4）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程y2=0.0060x2+0.0216，決定系數(shù)R2=0.9993。每批次進(jìn)樣前，同上述方法建立隨行標(biāo)曲，決定系數(shù)R2均大于0.990。

2.5 飲酒后藥代動(dòng)力學(xué)結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了10名志愿者飲用同種、同劑量啤酒后，于相同時(shí)間點(diǎn)采集的血液樣本中乙醛和乙醇的濃度，描繪藥時(shí)曲線，利用DAS 3.1.6軟件的非房室模型統(tǒng)計(jì)矩法得到乙醇藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)（表3），并計(jì)算乙醛藥時(shí)曲線下面積（AUC），見表4。不同個(gè)體之間的乙醇藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)存在差異，乙醇峰濃度（Cmax）范圍在557.9~951.2 μg/mL，達(dá)峰時(shí)間（tmax）范圍在0.8~2.0h，AUC（0-t）范圍在1881.9~3604.7mg·L-1·h，平均駐留時(shí)間MRT（0-t）范圍在2.0~2.8 h，末端消除半衰期（t1/2z）范圍在0.5~2.6 h，經(jīng)生物利用度校正的表觀分布容積（V/F）和表觀清除率（CL/F）的范圍分別在0.2~0.5L/kg和0.1~0.3L·h-1·kg-1。此外，乙醛AUC（0-t）范圍在1.312~6.642mg·L-1·h。

表3 乙醇藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

表4 乙醛藥時(shí)曲線下面積

2.6 ALDH2基因型與乙醇代謝相關(guān)性

野生組ALDH2*1/*1（志愿者F、G、K、L、M）和突變組ALDH2*1/*2（志愿者D、H、I、J、N）個(gè)體，飲酒后乙醛和乙醇藥時(shí)曲線圖見圖1～2。

利用SPSS 19.0軟件對(duì)兩組血液中乙醇藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)和乙醛AUC進(jìn)行Mann-Whitney U檢驗(yàn)（非參數(shù)檢驗(yàn)），P＜0.05時(shí)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果顯示，野生組和突變組乙醇Cmax、tmax、MRT（0-t）以及V/F值比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；突變組AUC乙醇、AUC乙醛以及t1/2z值均大于野生組，CL/F值小于野生組（P＜0.05），詳見表5。

2.7 性別、體質(zhì)量與乙醇代謝的相關(guān)性

對(duì)男性組（志愿者D、F、H、I、K、L、M）和女性組（志愿者G、J、N）個(gè)體血液中乙醇藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)和乙醛AUC進(jìn)行Mann-Whitney U檢驗(yàn)（非參數(shù)檢驗(yàn)），結(jié)果顯示，兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），詳見表6。

根據(jù)所有志愿者體質(zhì)量均值（65 kg），將志愿者分為兩組，對(duì)體質(zhì)量≥65kg（志愿者D、F、I、J、K）和體質(zhì)量＜65kg（志愿者G、H、L、M、N）個(gè)體血液中乙醇藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)和乙醛AUC進(jìn)行Mann-Whitney U檢驗(yàn)（非參數(shù)檢驗(yàn)），結(jié)果顯示，兩組數(shù)據(jù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），詳見表7。僅以性別或體質(zhì)量分組考察其與乙醇代謝的相關(guān)性，結(jié)果差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，推測(cè)可能為樣本量少，且性別或體質(zhì)量單一變量對(duì)乙醇代謝影響較小。同時(shí)也反映出ALDH2基因型對(duì)乙醛和乙醇代謝具有決定性的作用。

圖1 野生組和突變組乙醛藥時(shí)曲線

圖2 野生組和突變組乙醇藥時(shí)曲線

表5 野生組和突變組血液中乙醇藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)和乙醛藥時(shí)曲線下面積比較（±s）

表5 野生組和突變組血液中乙醇藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)和乙醛藥時(shí)曲線下面積比較（±s）

注：1）與野生組比較，P＜0.05

組別Cmax/（μg/mL）tmax/hAUC乙醇/（mg·L-1·h）MRT（0-t）/ht1/2z/hV/F/（L/kg）CL/F/（L·h-1·kg-1）AUC乙醛/（mg·L-1·h）野生（n=5）688.0±160.0 1.6±0.52137.5±256.32.3±0.30.6±0.20.3±0.10.3±0.02.3±1.0突變（n=5）734.4±87.91.3±0.42814.7±511.51）2.6±0.21.5±0.71）0.4±0.10.2±0.01）4.6±1.21）

表6 男性和女性乙醇藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)和乙醛藥時(shí)曲線下面積比較（±s）

表6 男性和女性乙醇藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)和乙醛藥時(shí)曲線下面積比較（±s）

性別Cmax/（μg/mL）tmax/hAUC乙醇/（mg·L-1·h）MRT（0-t）/ht1/2z/hV/F/（L/kg）CL/F/（L·h-1·kg-1）AUC乙醛/（mg·L-1·h）男性（n=7）668.3±88.61.5±0.42299.6±399.62.4±0.20.9±0.40.3±0.10.3±0.13.1±1.1女性（n=3）811.2±156.2 1.3±0.72887.9±620.72.5±0.41.5±1.10.4±0.20.2±0.14.1±2.6

表7 體質(zhì)量≥65kg和＜65kg者乙醇藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)和乙醛藥時(shí)曲線下面積比較（±s）

表7 體質(zhì)量≥65kg和＜65kg者乙醇藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)和乙醛藥時(shí)曲線下面積比較（±s）

體質(zhì)量/kg Cmax/（μg/mL）tmax/hAUC乙醇/（mg·L-1·h）MRT（0-t）/ht1/2z/hV/F/（L/kg）CL/F/（L·h-1·kg-1）AUC乙醛/（mg·L-1·h）≥65（n=5）704.8±169.2 1.6±0.62433.0±412.72.5±0.3 1.0±0.50.3±0.10.3±0.12.9±1.2＜65（n=5）717.6±77.31.3±0.32519.2±662.52.4±0.3 1.1±0.90.3±0.10.3±0.13.9±1.9

ALDH2是公認(rèn)的乙醇體內(nèi)代謝途徑的關(guān)鍵酶，其編碼的基因存在變異，基因型不同，編碼的同種異型酶活性不同，從而影響乙醇及其代謝產(chǎn)物乙醛在人體的代謝動(dòng)力學(xué)及其作用效果，進(jìn)而影響飲酒后的行為。

ALDH2*1/*2突變組由于ALDH2酶活性較低，代謝乙醛速率較慢，外周乙醛大量蓄積，AUC大于野生組（P＜0.05）；而積聚的乙醛對(duì)于乙醇氧化反應(yīng)有產(chǎn)物抑制作用，減緩了其代謝速率，使得血中乙醇的CL/F降低，t1/2z延長(zhǎng)。與乙醇吸收和分布有關(guān)的乙醇藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)如Cmax、tmax、MRT（0-t）以及V/F等，兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能原因?yàn)锳LDH2只是乙醛氧化成乙酸這一步驟中的關(guān)鍵酶，即乙醇代謝途徑中的關(guān)鍵酶[7]，只在乙醇的代謝過程中起重要作用，而對(duì)于代謝之前的吸收和分布基本無(wú)影響。

綜上，本研究通過建立頂空氣相色譜法同時(shí)測(cè)定血液中乙醇及乙醛，對(duì)ALDH2基因型與乙醇代謝及乙醛外周積蓄的關(guān)系進(jìn)行了初步研究，為進(jìn)一步研究乙醇代謝提供了基礎(chǔ)。

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