腦震蕩大鼠腦組織MDA、SOD、TNF-α及IL-1β表達變化

高峰，趙麗，谷振勇，叢斌

（1.河北醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)系，河北石家莊050000；2.河北省公安廳物證鑒定中心，河北石家莊050017）

腦震蕩是在臨床和法醫(yī)檢案中經(jīng)常遇到的一種顱腦損傷，以頭部外傷后出現(xiàn)一過性意識喪失和短期記憶障礙為特點，多可自行恢復(fù)。有研究[1-2]表明，這種損傷與輕型彌漫性軸索損傷（diffuse axonal injury，DAI）相似。因腦震蕩患者昏迷時間較短且常規(guī)病理學(xué)檢查變化不明顯，常被視為一種一過性的輕型顱腦損傷。但在臨床上腦震蕩后可能出現(xiàn)短暫性昏迷、記憶障礙及持久的軀體、認知和行為障礙癥狀等綜合征，說明腦震蕩后可能存在繼發(fā)性腦損傷。本實驗通過采用單擺式打擊裝置建立大鼠腦震蕩模型，觀察腦組織內(nèi)丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性及腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）表達變化，探討腦震蕩后繼發(fā)性腦損傷機制。

1 材料與方法

1.1 材料

健康Wistar大鼠32只（河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供），雌雄不限，體質(zhì)量200~220 g，隨機分為對照組和實驗組，對照組8只，實驗組24只。

MDA和SOD測定試劑盒（南京建成生物工程研究所），兔抗大鼠TNF-α和IL-1β多克隆抗體及免疫組化SP試劑盒（北京中山生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 建立大鼠腦震蕩模型

建模：根據(jù)文獻[3]的方法建立大鼠腦震蕩模型，將大鼠用乙醚輕度麻醉后，俯臥位固定于單擺打擊裝置上，待大鼠剛恢復(fù)意識時，用長30 cm、2.5 kg金屬單擺，以135°起始角下落打擊大鼠枕外隆突部，選取打擊后立即出現(xiàn)一過性昏迷，且昏迷時間在1~3min，清醒后活動正常，解剖時無大體損傷，組織病理學(xué)檢查未見腦出血和挫傷者作為腦震蕩模型建立成功大鼠。腦震蕩大鼠打擊后分別觀察2、6、12h，每個時間點8只大鼠。分別在不同時間點放血處死。

對照組大鼠（n=8）經(jīng)乙醚麻醉后綁縛在打擊裝置上不給予打擊，待清醒活動正常后處死。

1.2.2 觀察腦組織病理學(xué)改變

將大鼠腦組織沿正中矢狀線切開，一側(cè)完整固定，包括大腦、小腦及腦干，作為大鼠腦組織矢狀位觀察面，另一側(cè)冠狀取包括海馬部位的大腦中部腦組織，置于4%甲醛溶液中固定，然后采用Weil氏染色進行鏡下觀察。

1.2.3 檢測腦組織中MDA含量和SOD的活性

腦組織勻漿制備：將大鼠迅速斷頭取腦，在冰盤上取額部大腦皮質(zhì)100mg，制成10%腦組織勻漿。勻漿液離心（2500×g，10min），取上清液測定MDA含量和SOD活性。

MDA含量檢測：采用硫代巴比妥酸比色法測定，MDA與硫代巴比妥酸在酸性條件下煮沸縮合，生成紅色化合物，此化合物在波長532 nm處有最大吸收峰，其吸光度與MDA含量呈正比。

SOD活性檢測：超氧陰離子自由基（O2-）能氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈現(xiàn)紫紅色，在550nm處有最大吸收峰，其吸光度與SOD活性呈反比。

1.2.4 檢測大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)TNF-α、IL-1β的表達

采用免疫組化SP法測定大鼠大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)TNF-α、IL-1β表達，TNF-α、IL-1β均在細胞質(zhì)內(nèi)表達，陽性反應(yīng)均呈棕黃色。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 腦組織病理學(xué)改變

大鼠腦震蕩打擊后立即昏迷，組織學(xué)檢查未見腦出血和挫傷。Weil氏染色觀察，腦震蕩6h后可見皮質(zhì)和小腦等部位輕度水腫、血管淤血，胼胝體、腦干、小腦白質(zhì)等部位可見神經(jīng)髓鞘排列紊亂、斷裂、彎曲腫脹，12h上述變化更明顯（圖1）。

圖1 小腦及胼胝體的神經(jīng)纖維排列情況Weil氏染色×400

2.2 腦組織MDA含量和SOD活性改變

腦震蕩2h組腦組織MDA含量較對照組明顯增高（P＜0.05），6、12h MDA含量下降，與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（表1）。

腦震蕩2 h組腦組織SOD活性較對照組下降（P＜0.05），6、12 h SOD活性與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（表1）。

2.3 大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)TNF-α、IL-1β的表達

對照組大腦皮質(zhì)、海馬區(qū)中TNF-α和IL-1β不表達或表達較少。腦震蕩組上述部位6、12h的TNF-α和IL-1β表達范圍及表達強度均增加（圖2～3）。

表1 各組腦組織中MDA以及SOD含量變化（n=8，±s）

表1 各組腦組織中MDA以及SOD含量變化（n=8，±s）

注：1）與對照組相比，P＜0.05

組別MDA/（nmol/mg）SOD/（U/mg）對照1.10±0.1113.15±2.07 2h2.27±0.341）11.12±0.791）6h1.30±0.1412.41±1.87 12h1.15±0.1813.41±1.84

圖2 大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)腦組織TNF-α表達結(jié)果SP×400

圖3 大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)腦組織IL-1β表達結(jié)果SP×400

3 討論

研究閉合性顱腦損傷模型很多，本實驗參照于曉軍等[3]的模型自制單擺式機械打擊裝置制作大鼠腦震蕩模型，采用單擺式打擊模型，大鼠頭部處于可活動狀態(tài)，打擊后可發(fā)生相應(yīng)的直線或旋轉(zhuǎn)運動，致傷物的能量可通過枕部顱骨傳入腦組織造成損傷，而且單擺打擊前大鼠頭部不先給予損傷刺激，更能模擬現(xiàn)實生活中某些情況下頭部受外力打擊的作用過程。

大鼠腦震蕩打擊后6 h可見皮質(zhì)和小腦等部位輕度水腫、血管淤血，Weil氏染色觀察到胼胝體和腦干部位神經(jīng)髓鞘排列紊亂、斷裂、彎曲腫脹，12h變化更加明顯。結(jié)果提示，大鼠腦震蕩后腦組織存在一定的病理學(xué)變化。傳統(tǒng)觀點認為，腦震蕩無器質(zhì)性病變，損傷輕微，不留有后遺癥。近年來，人們對腦震蕩的機制及其腦組織結(jié)構(gòu)的改變進行了研究[4]，認為腦震蕩的機制可能既有功能性變化，如外傷超強刺激引起腦皮質(zhì)阻抑，也有器質(zhì)性損傷，如腦內(nèi)剪應(yīng)力形成可使腦中間神經(jīng)元受損，本實驗結(jié)果也支持上述觀點。

有學(xué)者[1-2]支持腦震蕩與DAI的發(fā)生機制相同，是一種彌漫性的腦損傷，損傷不局限于受力部位。本實驗選取受力部位的對側(cè)腦組織進行腦震蕩后氧化損傷情況的觀察。

由于腦組織細胞含脂質(zhì)較多，易受自由基攻擊發(fā)生脂質(zhì)過氧化損害，而SOD是體內(nèi)主要的抗氧化酶，具有防止細胞膜脂質(zhì)過氧化的作用，MDA則是氧自由基攻擊生物膜后形成的脂質(zhì)氧化代謝產(chǎn)物，因此MDA含量可反映機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度。大鼠腦震蕩損傷后2h腦組織MDA含量明顯增加，而SOD活性降低，6h基本恢復(fù)，說明腦震蕩大鼠腦組織中存在氧化損傷。有報道[5-7]顯示，大鼠腦震蕩早期腦血管痙攣、腦血流減少，隨后血管反射性擴張，血流量回復(fù)并有可能超過傷前水平，因此氧自由基損傷可能與腦震蕩后腦微循變化有關(guān)。也有實驗[8]結(jié)果提示腦震蕩大鼠腦組織存在氧化應(yīng)激反應(yīng)，氧自由基可通過攻擊細胞膜、損傷線粒體DNA以及增加腦內(nèi)興奮性氨基酸等多種途徑造成腦組織受損，這可能是腦震蕩后繼發(fā)性損傷的途徑之一。

腦組織中TNF-α及IL-1β主要由神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞產(chǎn)生，是外傷后較早釋放的具有多種生物學(xué)效應(yīng)的重要促炎細胞因子[9]，表達區(qū)域主要在海馬區(qū)、下丘腦以及脈絡(luò)叢等部位[10]。本實驗觀察到對照組大鼠大腦皮質(zhì)、海馬區(qū)細胞胞漿中TNF-α和IL-1β不表達或表達較少，大鼠腦震蕩后6h及12h表達明顯增加，說明炎癥細胞因子TNF-α和IL-1β參與調(diào)控腦震蕩損傷后腦組織病理生理變化。TNF-α及IL-1β表達增高可激活磷脂酶A2[11]、中性粒細胞和單核巨噬細胞，介導(dǎo)腦創(chuàng)傷后的許多病理生理反應(yīng)[12-14]，包括發(fā)熱、白細胞聚集以及血管內(nèi)皮滲透性增加等，促進腦水腫的形成、顱內(nèi)壓的增高等，與繼發(fā)性腦損害密切相關(guān)。腦震蕩后兩種炎癥細胞因子隨時間變化的趨勢仍需進一步探討。

腦震蕩的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后不僅取決于不同原因引起的原發(fā)性損傷，還與繼發(fā)性損傷有關(guān)。本實驗結(jié)果表明，腦震蕩大鼠組織存在脂質(zhì)過氧化反應(yīng)及炎癥細胞因子TNF-α、IL-1β表達變化，提示上述指標可能是腦震蕩后繼發(fā)性損傷的重要介質(zhì)。

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