不同死因大鼠心肌內(nèi)多種RNA相對表達量變化與PMI的關(guān)系

呂葉輝，張恒，潘暉，馬開軍，李文燦，陳文峰，江潔清，薛愛民，張萍，王慧君，陳龍

（1.復(fù)旦大學上海醫(yī)學院法醫(yī)學系，上海200032；2.上海市公安局刑事科學技術(shù)研究所法醫(yī)室，上海200043；3.上海市公安局浦東分局刑事科學技術(shù)研究所，上海200135；4.復(fù)旦大學附屬兒科醫(yī)院，上海201102）

死亡時間（PMI）是指發(fā)現(xiàn)、檢查尸體時距死亡發(fā)生時的時間間隔，PMI的準確推斷具有重要的法醫(yī)學實踐價值，一直是法醫(yī)病理學研究的重點和難點之一。利用傳統(tǒng)的方法進行PMI的推斷一直受到各種因素的制約，如環(huán)境溫度、濕度、機體內(nèi)在因素等，導致推斷的準確性和精確性較低。隨著分子生物學技術(shù)在法醫(yī)學領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，利用生物體內(nèi)RNA的時間依賴性降解規(guī)律推斷PMI正逐漸成為目前研究的熱點。

實時熒光定量PCR作為核酸的精確定量技術(shù)，擁有準確、高效的優(yōu)點，被越來越多地應(yīng)用于PMI的推斷[1-2]，但是目前研究PMI的動物模型較為單一，通常只考慮溫度因素的影響，而針對不同死亡原因的研究較少，故實際應(yīng)用受限[3]。本研究通過構(gòu)建斷頸死、窒息死和失血性休克死的大鼠模型，利用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測各RNA相對表達量與PMI的關(guān)系，以期為不同死因下PMI的推斷提供一種新的思路。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

RNAlater保護液（美國Ambion公司），TRIzol試劑盒（美國Invitrogen公司），PrimeScriptTMRT試劑盒（日本TaKaRa公司），SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒（日本TaKaRa公司），DEPC水（焦碳酸二乙酯處理并經(jīng)高溫高壓滅菌的MiliQ純水）。NanoDrop 1000分光光度計（美國Thermo公司），7500型實時熒光定量PCR儀（美國AB公司），geNorm PLUS軟件（比利時Biogazelle公司）。

1.2 實驗動物分組

成年健康SD大鼠135只，雄性，體質(zhì)量在250 g左右，由復(fù)旦大學上海醫(yī)學院動物實驗中心提供。按照隨機的原則將大鼠分為斷頸組、窒息組和失血性休克組，每組45只，并將斷頸組作為對照。

1.3 動物模型的建立及處理

斷頸死模型：用一手拇指和食指用力往下按住鼠頭，另一只手抓住鼠尾，用力向后上方拉動，造成脊髓橫斷致死。

窒息死模型：用直徑3mm尼龍繩打一個可滑動的活套，上端固定于橫杠上，將大鼠頸部放入活套內(nèi)并使其背對活結(jié)，大鼠依靠自身重力拉緊活套，造成窒息死亡[4]。

失血性休克死模型：采用傳統(tǒng)的Wiggers改良法，在大鼠處死前12h禁食，50mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉。麻醉后仰臥固定于大鼠板上，分離出右側(cè)股動脈，插入三通管，三通管連接血壓計觀察血壓、連接注射器用于放血，肝素鈉500U/kg抗凝。術(shù)畢穩(wěn)定10 min后開始放血，10 min左右血壓降至5.3 kPa（40mmHg），維持3h后立即處死大鼠。

尸體保存于室溫（25±2）℃的環(huán)境下。各組分別在死后0、3、6、12、24、36、48、72、96 h提取大鼠心肌組織（每個時間點5只大鼠），分裝于RNAlater保護液中，置于-80℃凍存。

1.4 RNA的提取與cDNA的合成

取凍存組織（約30 mg），按照TRIzol試劑盒總RNA提取說明書操作步驟提取總RNA，NanoDrop 1000分光光度計測定RNA的濃度及純度，并計算單位質(zhì)量心肌下RNA得率。取RNA樣本500ng進行反轉(zhuǎn)錄，按照PrimeScriptTM試劑盒說明書配置10 μL反應(yīng)體系。反轉(zhuǎn)錄條件為37℃15min，85℃5s，1個循環(huán)。

1.5 引物的設(shè)計與合成

共選擇7種RNA指標，分別為甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、β-肌動蛋白（β-actin）、缺氧誘導因子-1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）、誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、U6微核RNA（U6 small nuclear RNA，U6 snRNA）。根據(jù)GenBank提供的上述大鼠mRNA序列及U6 snRNA序列設(shè)計引物。引物設(shè)計除U6 snRNA外至少跨一個外顯子或外顯子區(qū)域以保證目的cDNA的正確合成與擴增，所有引物均選擇在RNA序列的3′端附近且經(jīng)Blast驗證，擴增片段長度都在400bp以下。引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見表1。

表1 選取的指標及引物序列

1.6 實時熒光定量PCR

應(yīng)用SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒進行實時熒光定量PCR反應(yīng)。按說明書配制20μL反應(yīng)體系：SYBR?Premix Ex Taq 10μL、上游引物0.4μL、下游引物0.4 μL、ROX Reference DyeⅡ0.4 μL、cDNA模板1μL、雙蒸滅菌水7.8μL。應(yīng)用7500型實時熒光定量PCR儀進行兩步法擴增，擴增條件：95℃30s；95℃5s，60℃34s，40個循環(huán)。每個樣本重復(fù)3次，結(jié)果由系統(tǒng)自動生成，從而得到各個指標的循環(huán)閾值（threshold cycle，Ct）。

1.7 統(tǒng)計學分析

采用geNorm PLUS軟件對7個RNA指標的Ct值進行計算，將基因表達穩(wěn)定度的平均值M最小的指標作為內(nèi)對照。各個樣本其他RNA指標與選出內(nèi)對照的Ct差值記做ΔCt，另選取斷頸組PMI為0時的樣本為對照樣本，各樣本和對照樣本的Ct差值記作ΔΔCt，各指標的相對表達量通過公式2-ΔΔCt計算得到。采用SPSS v18.0軟件（美國SPSS公司）進行統(tǒng)計分析，三組間運用單因素方差分析，兩組間運用t檢驗進行差異性分析，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 總RNA得率及實時熒光定量PCR結(jié)果

從135個心肌樣本中成功提取總RNA，并加入30 μL DEPC水溶解。經(jīng)NanoDrop 1000分光光度計測定所有RNA樣本的D260/D280在1.8～2.1，且所有D260/D280＞2.0的均在死后36 h，證明RNA純度和完整性相對較好。單位質(zhì)量心肌下，斷頸組RNA質(zhì)量為180～340 ng/mg，窒息組為200～330 ng/mg，失血性休克組為160～350ng/mg，三組之間RNA得率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。所有樣本均成功反轉(zhuǎn)，對反轉(zhuǎn)后的cDNA進行7個指標的實時熒光定量PCR檢測，重復(fù)3次，得到Ct值，結(jié)果證實擴增曲線和溶解曲線完好，表明樣本均成功特異性擴增。

2.2 內(nèi)對照的選擇

采用geNorm PLUS軟件對7個指標的Ct值進行統(tǒng)計學處理，得到不同組別的M值，見表2。M值越小，指標的表達水平越穩(wěn)定，三組中U6 snRNA的M值都是最小的。U6 snRNA表達穩(wěn)定，受PMI和死亡原因的影響較小，故將其作為內(nèi)對照。

2.3 不同死因下各RNA相對表達量與PMI的關(guān)系

斷頸、窒息和失血性休克組均按照1.7項計算公式方式處理，各指標相對表達量與PMI的關(guān)系，見表3～8。

表2 各組7個指標M值穩(wěn)定性評估

表3 GAPDH在各組的相對表達量與PMI的關(guān)系（n=5，±s）

表3 GAPDH在各組的相對表達量與PMI的關(guān)系（n=5，±s）

注：1）與相同死亡時間斷頸組比較，P＜0.05

組別0h3h6h12h24h36h48h72h96h斷頸10.985±0.1240.762±0.1260.617±0.0920.522±0.0860.255±0.0920.105±0.0910.076±0.0210.032±0.012窒息1.258±0.1861）2.595±0.3101）3.234±0.3331）5.205±0.5671）3.773±0.3661）1.773±0.1691）1.233±0.2241）0.553±0.0921）0.124±0.063失血性休克1.985±0.2591）1.986±0.2591）2.801±0.4351）2.381±0.5151）2.052±0.2451）1.321±0.1331）0.558±0.0761）0.222±0.1351）0.090±0.075

表4 β-actin在各組的相對表達量與PMI的關(guān)系（n=5，±s）

表4 β-actin在各組的相對表達量與PMI的關(guān)系（n=5，±s）

注：1）與相同死亡時間斷頸組比較，P＜0.05

6h12h24h36h48h72h96h組別0h3h斷頸10.850±0.1240.813±0.126 0.635±0.1920.455±0.0860.239±0.0920.154±0.0910.097±0.051 0.055±0.035窒息0.858±0.250 0.874±0.1870.763±0.176 0.333±0.1631）0.203±0.0851）0.183±0.0460.119±0.0600.084±0.060 0.024±0.013失血性休克1.205±0.300 0.800±0.1500.721±0.170 0.380±0.1401）0.302±0.0951）0.233±0.0630.171±0.0760.109±0.062 0.050±0.035

表5 HIF-1在各組的相對表達量與PMI的關(guān)系（n=5，±s）

表5 HIF-1在各組的相對表達量與PMI的關(guān)系（n=5，±s）

注：1）與相同死亡時間斷頸組比較，P＜0.05；“-”代表未測到

組別0h3h6h12h24h36h48h72h96h斷頸11.120±0.1240.813±0.1260.635±0.0920.355±0.0860.239±0.0920.154±0.051--窒息1.216±0.1261）1.415±0.2871）1.316±0.1761）0.986±0.0631）0.803±0.0851）0.723±0.0461）0.419±0.0601）0.084±0.0300.034±0.013失血性休克1.535±0.2151）1.773±0.1001）2.129±0.1701）1.725±0.1401）1.355±0.0951）0.875±0.0631）0.512±0.0761）0.109±0.0420.050±0.015

表6 iNOS在各組的相對表達量與PMI的關(guān)系（n=5，±s）

表6 iNOS在各組的相對表達量與PMI的關(guān)系（n=5，±s）

注：1）與相同死亡時間窒息組比較，P＜0.05；“-”代表未測到

組別0h3h6h12h24h36h48h72h96h斷頸---------窒息11.215±0.0871.982±0.1761.458±0.0631.850±0.2850.592±0.0460.359±0.0600.184±0.0600.083±0.033失血性休克1.893±0.2581）2.573±0.2201）2.129±0.1701.725±0.1401.655±0.0950.875±0.0630.212±0.1760.221±0.062 0.240±0.0351）

表7 TNF-α在各組的相對表達量與PMI的關(guān)系（n=5，±s）

表7 TNF-α在各組的相對表達量與PMI的關(guān)系（n=5，±s）

注：1）與相同死亡時間斷頸組比較，P＜0.05

組別0h3h6h12h24h36h48h72h96h斷頸10.858±0.1211.126±0.2550.759±0.1950.659±0.1460.718±0.2660.346±0.1010.226±0.0940.113±0.085窒息1.512±0.1261）1.215±0.3871）1.982±0.1761）1.458±0.0631）1.850±0.2851）0.592±0.0460.359±0.0600.184±0.0600.083±0.033失血性休克4.589±0.3251）3.120±0.2201）3.570±0.5701）2.725±0.1401）1.655±0.5951）0.875±0.0630.212±0.1760.221±0.0620.240±0.035

表8 IL-6在各組的相對表達量與PMI的關(guān)系（n=5，±s）

表8 IL-6在各組的相對表達量與PMI的關(guān)系（n=5，±s）

注：1）與相同死亡時間斷頸組比較，P＜0.05；“-”代表未測到

組別0h3h6h12h24h36h48h72h96h斷頸10.883±0.121 0.822±0.2550.723±0.1250.455±0.1250.315±0.2660.106±0.122--窒息1.212±0.1261）1.315±0.3871）1.082±0.1761.858±0.5631）0.850±0.2851）0.392±0.0460.259±0.0601）0.184±0.0730.123±0.033失血性休克2.580±0.3251）3.120±0.2201）1.570±0.5701）1.725±0.1401）1.355±0.5951）0.675±0.0631）0.512±0.2761）0.325±0.0620.100±0.135

GAPDH的相對表達量在斷頸組隨PMI延長呈逐漸下降趨勢，24h約為0h的0.5倍；窒息組相對表達量在12h達到峰值，此后隨PMI延長不斷下降，在72h內(nèi)均高于斷頸組（P＜0.05）；失血性休克組變化趨勢與窒息組相似，但峰值出現(xiàn)在6h，各時間點相對表達量較窒息組低（P＜0.05），但較斷頸組高（P＜0.05）。

β-actin的相對表達量在三組中均隨著PMI延長不斷下降，各時間點變化基本一致，幾乎不受死亡原因的影響。

HIF-1的相對表達量在斷頸組隨PMI延長逐漸下降的趨勢，在72h后已檢測不出；窒息組HIF-1相對表達量的峰值出現(xiàn)在3 h，約為對照0 h的1.4倍，此后隨PMI延長不斷降低，在48 h前略高于斷頸組（P＜0.05）；失血性休克組在24h前均處于高水平表達，峰值出現(xiàn)在6 h，約為對照0 h的2.1倍，此后HIF-1的相對表達量逐漸降低。

iNOS的相對表達量在斷頸組各個時間點均檢測不出，故將窒息組0 h樣本作為對照；窒息組和失血性休克組在24h前表達水平均增高，峰值分別出現(xiàn)在6h和3h，36h之后相對表達量逐漸降低；失血性休克組在0h和3h較窒息組相對表達量增高（P＜0.05）。

TNF-α的相對表達量在斷頸組36h前保持相對穩(wěn)定，此后不斷下降；窒息組的峰值出現(xiàn)在6 h，約為對照0 h的2倍，其在24 h前都保持較高的表達；失血性休克組的峰值出現(xiàn)在死后即刻（0 h），約為斷頸組的4.6倍，之后相對表達量隨PMI延長不斷降低，但在24h前表達水平都高于對照0h（P＜0.05）。

IL-6的相對表達量在斷頸組隨PMI延長而降低，在72h后檢測不到；窒息組在12 h達到峰值，約為對照0h的1.9倍，此后IL-6的相對表達量逐漸降低；失血性休克組在24 h前都處于高表達狀態(tài)（P＜0.05），在3 h達到峰值，約為對照0 h的3.1倍，此后逐漸降低。

3 討論

近年來隨著分子生物學的發(fā)展，利用生物體內(nèi)大分子如DNA、RNA和蛋白質(zhì)等來推斷PMI是當前研究的熱點，尤其是依據(jù)RNA的時間依賴性推斷PMI已經(jīng)取得了一定進展[5]。但是目前對RNA推斷PMI的研究主要停留在動物模型上，通常的處死方式為斷頸死，而針對其他不同死因的研究較少。本研究在將斷頸死動物模型作為對照的基礎(chǔ)上，探討了窒息和失血性休克這兩種較常見的死因?qū)λ篮筇囟≧NA表達量的影響，而模型的成功建立是研究死因?qū)MI影響的前提。窒息死采用了縊死的動物模型，大鼠在套上活套后6min內(nèi)死亡，尸僵出現(xiàn)較早，與文獻[4]報道一致。失血性休克模型在經(jīng)典的Wiggers改良法基礎(chǔ)上，降壓穩(wěn)定后維持3h，以模擬失代償期的失血性休克即不可逆性休克。多種死因下的研究可以提高PMI推斷的靈敏度和精確度，從而增加其實際應(yīng)用價值。

實時熒光定量PCR技術(shù)在檢測基因表達水平時有很好的靈敏性與特異性，與傳統(tǒng)的半定量RT-PCR技術(shù)相比，具有高效穩(wěn)定的優(yōu)點，利用Ct值與起始模板濃度的對數(shù)呈反比關(guān)系來計算RNA的表達水平，可有效避開平臺反應(yīng)帶來的誤差，是理想的定量技術(shù)。主要影響其結(jié)果的兩大因素是人為操作誤差和內(nèi)對照的選擇。因此在每個樣本重復(fù)3次以減小誤差的基礎(chǔ)上，內(nèi)對照的選擇對RNA表達的準確定量是至關(guān)重要的。geNorm PLUS軟件是選擇內(nèi)對照的良好工具，被廣泛應(yīng)用于基因表達的分析[6]。該軟件可以計算基因平均表達穩(wěn)定度，并對所有候選內(nèi)對照的表達穩(wěn)定性進行排序。本研究選取的7個指標中，U6 snRNA的M值在3個組別中都是最小的，說明其受死亡原因和PMI的影響都相對較小，與人體心肌組織中的研究結(jié)果[7]一致。U6 snRNA是核內(nèi)小RNA，長度只有100~200bp，只存在于細胞核內(nèi)，通常狀態(tài)snRNA不是游離存在，而是與蛋白質(zhì)結(jié)合成復(fù)合物，形成小核核糖核蛋白（small nuclear ribonucleoprotein particle，snRNP），這為U6 snRNA提供了一個相對穩(wěn)定的環(huán)境，接觸核酶的機會較少，不易受內(nèi)外環(huán)境的影響而降解[8]。U6 snRNA在生物體內(nèi)表達穩(wěn)定而且高度保守，是理想的內(nèi)對照，可用其排除個體差異帶來的誤差，使統(tǒng)計結(jié)果更加客觀、準確。

利用U6 snRNA作為內(nèi)對照，計算出各個指標在不同PMI下的相對表達量，其隨死因的不同呈現(xiàn)出特異性的改變。在死亡24h之前，斷頸組各指標皆呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢，而窒息組和失血性休克組的各指標（除β-actin）呈現(xiàn)不同程度的增高趨勢；在死亡24 h之后，各指標不論組別都隨著PMI延長而不斷降低，這說明在死亡早期時間內(nèi)，體內(nèi)RNA的轉(zhuǎn)錄表達并沒有停止，而是隨著死因的不同而呈現(xiàn)不同的改變，之后細胞徹底死亡，隨著核酶持續(xù)釋放，RNA時序性的降解，各指標相對表達量隨著PMI延長不斷降低。

GAPDH和β-actin是管家基因，在體內(nèi)呈高豐度且穩(wěn)定的表達，是普通分子生物學實驗定量mRNA表達時常用的內(nèi)對照[9]。本研究發(fā)現(xiàn)β-actin在3個組內(nèi)表達幾乎沒有差異，均隨著PMI不斷降低。這說明β-actin作為細胞骨架的基本成分，受死因的影響較小，但與PMI的線性關(guān)系良好，可作為推斷PMI的指標。而各時間點下GAPDH的相對表達量表現(xiàn)為窒息組＞失血性休克組＞斷頸組，說明缺氧會引起GAPDH表達上調(diào)，而且窒息造成的缺氧程度要比失血性休克造成的缺氧更為嚴重。GAPDH作為糖酵解的關(guān)鍵酶在缺氧情況下表達上調(diào)，可提高葡萄糖的利用率和轉(zhuǎn)運利用，以補償缺氧時ATP的下降，從而改善缺氧時的能量代謝過程[10]。在死亡模型下，雖然機體已經(jīng)死亡，但是組織細胞仍能保持一定的生物活性，故細胞依然能感受缺氧的狀態(tài)，在死亡早期GAPDH可不斷增高。

HIF-1是受缺氧誘導的關(guān)鍵因子，在通常狀態(tài)下其α亞基通過泛素-蛋白酶體系迅速降解，但在缺氧狀態(tài)下HIF-1 α亞基降解受阻聚集，有報道[11]稱其早期調(diào)節(jié)主要通過蛋白轉(zhuǎn)錄后水平而不是通過mRNA的轉(zhuǎn)錄水平增加表達。本研究證實HIF-1在窒息組表達增高不明顯，峰值出現(xiàn)在死后3h且只有對照0h的1.4倍，與張更謙等[4]的研究一致，推測是窒息造成的缺氧狀態(tài)并不能刺激心肌細胞RNA轉(zhuǎn)錄的升高，而是在蛋白水平有所增高。HIF-1在失血性休克組在24 h前均處于高表達水平，這與我們采用的模型有關(guān)，即降壓穩(wěn)定后維持3h，失血性休克已達到失代償期即不可逆性期。有研究[12]表明，HIF-1在嚴重失血性休克中參與了能量代謝、炎癥反應(yīng)失控和脂質(zhì)過氧化損傷的途徑，而不是單純的缺氧，故其可能在死后一定時間內(nèi)呈現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄水平的增高。

iNOS在基本狀態(tài)下不表達或者表達量很低，但在缺氧、損傷、炎癥介質(zhì)、內(nèi)毒素等因素刺激下，編碼基因被激活，可在一定時間內(nèi)持續(xù)表達mRNA[13]。在斷頸組iNOS均檢測不到表達，在窒息組和失血性休克組24 h前持續(xù)表達增高，說明缺氧可以導致iNOS成倍表達增加。失血性休克組在3h前較窒息組表達增高，可能是重癥失血性休克組除了缺血缺氧之外，已經(jīng)有全身不同程度的全身炎癥反應(yīng)發(fā)生，而iNOS正是促炎反應(yīng)的核心分子。

TNF-α和IL-6作為體內(nèi)重要的細胞因子，介導參與體內(nèi)多種生物學反應(yīng)，如抗腫瘤和調(diào)節(jié)機體免疫功能等，同時在失血性休克中促進著炎癥的發(fā)生，也被稱為促炎細胞因子[14-15]。正常情況下，單核巨噬細胞內(nèi)含有少量TNF-α的mRNA，受炎性刺激能快速上調(diào)mRNA表達。本研究發(fā)現(xiàn)，在單純的窒息缺氧下，TNF-α表達也可以上調(diào)且窒息組的峰值出現(xiàn)在HIF-1峰值之后，推測是作為HIF-1的下游因子，TNF-α可在缺氧狀態(tài)下被誘導而表達增高，與余嫻[14]的研究一致。在失血性休克組，TNF-α在0h已處于最高峰，且高于窒息組，Yao等[15]認為，失血性休克發(fā)生30 min TNF-α水平已經(jīng)開始升高，其可能是炎癥介質(zhì)連鎖反應(yīng)中最早的啟動因子，故在死后0h已達到高峰。IL-6是一種重要的急性反應(yīng)期炎癥介質(zhì)，多在受到TNF-α刺激后產(chǎn)生，同時也可以對TNF-α進行反饋調(diào)節(jié)，調(diào)控網(wǎng)絡(luò)相對復(fù)雜[15]。IL-6在窒息組和失血性休克組的峰值皆晚于TNF-α出現(xiàn)，推測其可能是隨著TNF-α的上調(diào)而增高。

用一種死亡模型來推斷PMI，可用的指標就會比較少，相應(yīng)推斷的精確度也會降低，因此推廣應(yīng)用受到限制。在窒息和失血性休克狀態(tài)下，體內(nèi)的多種RNA參與了組織細胞缺血、缺氧、炎癥反應(yīng)等一系列復(fù)雜的病理生理變化，而且在死后也能維持一段時間。這其中的一些RNA指標在不同的死因下呈現(xiàn)出了有意義的變化趨勢，其表達量與PMI的特定關(guān)系可提高利用RNA來推斷PMI的準確性和可靠性，并能為死因的分析提供一定的實驗依據(jù)。

本研究通過實時熒光定量PCR技術(shù)對斷頸死、窒息死、失血性休克死大鼠不同PMI心肌內(nèi)各RNA指標相對表達量的研究發(fā)現(xiàn)：U6 snRNA表達量非常穩(wěn)定，受PMI和死因的影響較小，適合作為內(nèi)對照。在死亡早期，GAPDH、HIF-1、iNOS、TNF-α和IL-6的表達量在窒息組和失血性休克組比斷頸組呈現(xiàn)不同程度的增加，且峰值出現(xiàn)的時間點不同，而β-actin在3個組皆呈現(xiàn)表達量下降趨勢。在死亡晚期，隨著mRNA的不斷降解，表達量持續(xù)下降。各RNA表達量特征性的變化可為不同死因下PMI的推斷提供參考。如何選擇、優(yōu)化各RNA指標并綜合應(yīng)用于不同死因下人體樣本的PMI推斷，是我們進一步研究的方向。

（本研究受復(fù)旦大學研究生創(chuàng)新基金項目資助。）

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