海南青梅中白藜蘆醇類化合物及其抗腫瘤活性研究

陳文豪，李玖慧，惠陽，宋小平，陳光英*，韓長日，韓姣姣

（1.海南師范大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，海南?？?71158；2.海南師范大學(xué)熱帶藥用植物化學(xué)教育部重點實驗室，海南?？?71158）

海南青梅（Vatica mangachapoiBlanco）為龍腦香科（Dipterocarpaceae）青梅屬（Vatica）植物，又名青梅，為海南特有植物.在民間，青梅葉長期用作殺菌消毒，治療肝炎及提取中藥龍腦香.國內(nèi)外學(xué)者對青梅屬植物進行研究發(fā)現(xiàn)，該屬植物主要含有白藜蘆醇低聚體、三萜類化合物以及異香豆素類化合物.白藜蘆醇低聚體由于具有良好的抗HIV[1]、抗腫瘤[2]等活性而備受學(xué)者關(guān)注.課題組前期實驗中發(fā)現(xiàn)青梅提取物具有很好的抗氧化[3]、抗HIV[4]和抗腫瘤[5]等生物活性，并從青梅中分離得到三萜類和黃酮類等化合物[6-8]，本實驗建立在前期工作基礎(chǔ)上，進一步開展青梅化學(xué)成分研究，從中分離得到4 個白藜蘆醇類化合物（1-4），化合物1為首次從該屬植物中分離得到，并對所有化合物進行了體外抗腫瘤活性測試.

1 實驗部分

1.1 實驗材料、儀器與試劑

青梅莖采自海南省昌江縣霸王嶺國家森林公園自然保護區(qū)，經(jīng)海南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院鐘瓊芯教授鑒定為龍腦香科青梅屬植物青梅（Vatica man?gachpoiBlanco），標(biāo)本現(xiàn)存于海南師范大學(xué)熱帶藥用植物化學(xué)教育部重點實驗室.

Bruker AV400MHz超導(dǎo)核磁共振儀（瑞士Bruker公司），Bruker ESQUIRE HCT 質(zhì)譜儀；潔凈工作臺(蘇凈集團安泰公司)；紫外分析暗箱YOKO-ZX（武漢藥科新技術(shù)開發(fā)有限公司）；高壓滅菌鍋（森展企業(yè)有限公司）；倒置顯微鏡（重慶光學(xué)儀器廠）；Elx800 型酶標(biāo)儀（美國BioTek 公司）；MCO-15AC 型CO2恒溫培養(yǎng)箱（SANYO 公司）；超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備廠）；RPMI-1640 培養(yǎng)液（Gibco 公司)；胰酶（Gibco 公司）；MTT（Sigma 公司）；石油醚（60-90℃）、氯仿、乙酸乙酯、甲醇等（西隴化工股份有限公司，分析純）.乙醇（70%）為工業(yè)級，薄層硅膠GF254 和柱色譜硅膠（100-200目，200-300目，青島海洋化工廠）；葡聚糖凝膠Sephadex LH-20（Amersham Blosclences 公司）.

1.2 單體化合物的分離純化

青梅（V.mangachampoi）莖27 Kg 用70%的乙醇室溫浸泡三次，7 天/次，合并提取液，60 ℃減壓濃縮得棕色干浸膏2100 g.將浸膏混懸于水中，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇進行萃取，減壓回收溶劑，得石油醚部位10 g，氯仿部位103 g，乙酸乙酯部位888 g，正丁醇部位900 g.乙酸乙酯部位（888 g）用100-200 目硅膠拌樣，進行硅膠柱色譜層析，以石油醚/乙酸乙酯/甲醇為溶劑進行洗脫，薄層層析檢測合并相似流分得到10 個組分（A～J）.本研究主要從組分6 開展，經(jīng)反復(fù)硅膠柱色譜（CHCl3∶MeOH=5∶1）、sephadex LH-20（CHCl3∶MeOH=1∶1）及制備薄層層析（CHCl3∶MeOH=4∶1）等方法分離純化，依次得到化合物1（20.2 mg），2（8.4 mg）、3（5.0 mg）和4（15.6 mg）.

1.3 體外腫瘤細胞增殖抑制活性實驗

小鼠黑色素瘤細胞（B16F10）和人肺腺癌細胞（A549）由南京中醫(yī)藥大學(xué)提供；本實驗室續(xù)代培養(yǎng)，細胞在含有10%小牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基中，于5%CO2、37 ℃溫箱中培養(yǎng).

采用MTT 法[9]測試單體化合物的腫瘤細胞增殖抑制試驗：取對數(shù)生長期的腫瘤細胞株，用0.25%的胰蛋白酶消化，10%新生小牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液調(diào)制成5×104個/mL-1的細胞懸液，接種于96 孔板中，每孔接種180 μL.在37 ℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)8-10 h，待其貼壁，每個孔加入用PBS配制的樣品液，使得樣品終濃度分別為1，10，和100 μg/mL.每個濃度平行3 孔，繼續(xù)培養(yǎng)44 h 后，每孔加入50 μL MTT（1 mg/mL-1，PBS 配制），在37 ℃、5% CO2條件下繼續(xù)溫育4 h，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150 μL DMSO，在微型振蕩器上搖勻15 min，結(jié)晶溶解后，在酶聯(lián)免疫檢測儀上選擇570 nm，測定各孔的吸光值，同時設(shè)置空白組（僅加入含細胞的培養(yǎng)液）和對照組（以培養(yǎng)液替代藥物），計算細胞增殖抑制率.抑制率（%）=（1-實驗組3孔OD值平均值/對照組3孔OD值平均值）×100%.

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：紅色無定形粉末，易溶于丙酮.在碘蒸氣中顯棕紅色，三氯化鐵反應(yīng)呈陽性；ESI-MSm/z361[M+H]+,359[M-H]-；1H-NMR(400 MHz,Acetoned6)δH：7.54 (1H,d,J=1.6Hz,H-5),7.35 (1H,d,J=1.6Hz,H-7),7.54(2H,d,J=8.8Hz,H-2 ′,6 ′),7.11(2H,d,J=8.8Hz,H-3′,5′),6.38(1H,d,J=2.4Hz,H-3″),7.26 (1H,d,J=2.4Hz,H-5″),14.2 (1H,s,H-2″-OH)；13C-NMR(100 MHz,Acetone-d6)δC：158.5(C-2),110.1 (C-3),127.0 (C-3a),136.6 (C-4),109.3 (C-5),155.1(C-6),105.7(C-7),159.4(C-7a),123.5 (C-1 ′),132.6 (C-2 ′,6 ′),117.9 (C-3 ′,5 ′),161.5 (C-4 ′),188.8(C=O),113.2(C-1″),169.4(C-2″),104.2(C-3″),165.7(C-4″),104.7(C-5″),139.3(C-6″).以上數(shù)據(jù)與文獻[10]報道的diptoindonesin G 的波譜數(shù)據(jù)基本一致.檢索發(fā)現(xiàn)，僅有三篇文獻對該化合物進行報道，其中兩篇報道從坡壘屬的兩種植物中分離得到，同時發(fā)現(xiàn)該化合物具有很好的抑制老鼠白血病細胞（P-388）增殖活性[10]和抑制免疫反應(yīng)的活性[11]，另一研究小組還完成了該化合物的全合成[12].

化合物2：紅色無定形粉末，溶于丙酮，微溶甲醇，三氯化鐵反應(yīng)呈陽性；ESI-MSm/z455[M+H]+,453[M-H]-；1H-NMR(400 MHz,Acetone-d6)δH：7.22(2H,d,J=8.0Hz,2a/6a),6.84(2H,d,J=8.0Hz,3a/5a),5.45(1H,d,J=5.2Hz,7a),4.49(1H,d,J=5.2Hz,8a),6.24(3H,brs,10a,12a,14a),7.19(1H,d,J=8.0Hz,2b,6b),6.75(1H,d,J=8.0Hz,3b,5b),6.91(1H,d,J=15.6Hz,7b),6.73(1H,d,J=15.6Hz,8b),6.36(1H,brs,12b),6.73(1H,brs,14b);13C-NMR(100 MHz,Acetoned6)δC：130.0(C-1a),128.6(C-2a,6a),116.2(C-3a,5a),158.1(C-4a),93.8(C-7a),56.9(C-8a),147.3(C-9a),104.1(C-10a),159.7(C-11a,13a),102.2(C-12a),104.1(C-14a),129.7(C-1b),127.9(C-2b,6b),116.1(C-3b,5b),158.1(C-4b),127.8(C-7b),130.0(C-8b),136.2(C-9b),116.1(C-10b),162.2(C-11b),96.7(C-12b),158.1(C-13b),106.9(C-14b).以上數(shù)據(jù)與文獻[13]報道的（+）-ε-viniferin的波譜數(shù)據(jù)基本一致.

化合物3：黃色不定型粉末，易溶于丙酮.在碘蒸氣中顯棕紅色，三氯化鐵反應(yīng)呈陽性；ESI-MSm/z467[M+H]+,465[M-H]-；1H-NMR(400 MHz,Acetoned6)δH：7.71(2H,d,J=8.8Hz,2a,6a),6.99(2H,d,J=8.8Hz,3a,5a),6.60(1H,brs,12a),6.70(1H,brs,14a),6.85(2H,d,J=8.0Hz,2b,6b),6.58(2H,d,J=8.0Hz,3b,5b),6.15(1H,brs,7b),7.08(1H,brs,12b),7.36(1H,brs,14b)；13C-NMR(100 MHz,Acetone-d6)δC：123.1(C-1a),131.0(C- 2a,6a),116.6(C- 3a,5a),159.5(C- 4a),153.3(C-7a),116.2(C-8a),135.3(C-9a),114.1(C-10a),158.3(C-11a),102.9(C-12a),157.7(C-13a),109.0(C-14a),131.1(C- 1b),128.5(C- 2b,6b),115.7(C- 3b),114.7(C-5b),155.7(C-4b),56.0(C-7b),196.9(C-8b),129.4(C-9b),122.5(C-10b),154.9(C-11b),102.5(C-12b),156.1(C-13b),112.0(C-14b).以上數(shù)據(jù)與文獻[14]報道的hopeahainol的波譜數(shù)據(jù)基本一致.

化合物4：綠色針狀晶體，易溶于甲醇，丙酮，在碘蒸氣中顯黑色，三氯化鐵反應(yīng)呈陽性；ESI-MSm/z449[M+H]+,447[M-H]-；1H-NMR(400 MHz)δH：7.72(4H,d,J=7.6Hz,2a,2b,6a,6b),7.00(4H,d,J=7.6Hz,3a,3b,5a,5b),7.21(2H,s,10a,10b),6.81(2H,s,12a,12b); 13C-NMR(100 MHz)δC：122.5(C-1a,1b),128.8(C-2a,6a,2b,6b),115.9(C-3a,5a,3b,5b),158.4(C-4a,4b),148.7(C-7a,7b),121.5(C-8a,8b),111.0(C-9a,9b),104.9(C-10a,10b),157.2(C-11a,11b),97.0(C-12a,12b),153.5(C-13a,13b),123.6(C-14a,14b).以上數(shù)據(jù)與文獻[15]報道的hopeahainol C的波譜數(shù)據(jù)基本一致.

2.2 化合物的抗腫瘤活性測試

以小鼠黑色素瘤細胞（B16F10）和人肺腺癌細胞（A549）為研究對象，測試化合物（1-4）對其增殖抑制活性.實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在測試化合物當(dāng)中，化合物1對小鼠黑色素瘤細胞（B16F10）和人肺腺癌細胞（A549）的增殖抑制活性最好，IC50值分別為36.1，20.4 μM，化合物3 的IC50值分別為89.4，53.5 μM，化合物2，4對這兩株細胞的IC50值均大于100 μM.

3 結(jié)論

本研究從海南青梅中分離鑒定了4 個化合物（1-4），均為白藜蘆醇類化合物，其中化合物1 為首次從該屬植物中分離得到，且化合物1 對小鼠黑色素瘤細胞（B16F10）和人肺腺癌細胞（A549）的顯示一定的增殖抑制活性，IC50值分別為36.1,20.4 μM.

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