浙江洞頭不同品系羊棲菜的栽培性狀及ISSR分析

徐佳麗，駱其君*，嚴(yán)小軍

浙江洞頭不同品系羊棲菜的栽培性狀及ISSR分析

徐佳麗，駱其君*，嚴(yán)小軍

（寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江寧波 315211）

浙江洞頭栽培的羊棲菜具有不同來源，通過定期測(cè)定5種不同品系羊棲菜（原始采集地分別是韓國(guó)、浙江洞頭、浙江南麂列島、浙江東極島及廣東汕頭）的栽培性狀，發(fā)現(xiàn)在生長(zhǎng)階段后期，各品系在株重和株高方面都存在顯著性差異，原始親本引自韓國(guó)的羊棲菜品系較其他品系具有更好的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，可作為育苗選種目標(biāo)品系。利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)這5種羊棲菜品系進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果顯示，從36條引物中篩選出的11條引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到219條羊棲菜DNA片段，其中多態(tài)性片段為129條，多態(tài)性條帶比率達(dá)58.9%；5個(gè)羊棲菜品系之間的遺傳距離為0.151 0～0.382 4，且聚在一起，同屬的鼠尾藻在最外群。本研究從DNA分子水平上揭示了目前洞頭養(yǎng)殖的羊棲菜品系遺傳多態(tài)性偏低，為今后開展羊棲菜種質(zhì)資源保護(hù)及其優(yōu)良苗種的選育提供了一定的理論參考。

羊棲菜；栽培性狀；ISSR；遺傳多樣性

0 引言

羊棲菜（Sargassum fusiforme（Harv.）Setch.）屬于褐藻門，墨角藻目，馬尾藻科，馬尾藻屬，作為一種暖溫帶-亞熱帶性的大型褐藻，主要分布于太平洋西北部，在中國(guó)北至大連，南至海南島都有分布，尤其以浙江和福建分布最廣。株高一般為30～60 cm，有時(shí)長(zhǎng)達(dá)2 m，藻體可分為假根、莖、葉片、氣囊及生殖托。羊棲菜雌、雄異株，以有性及營(yíng)養(yǎng)2種生殖方式進(jìn)行繁殖，生活史只有孢子體階段，無明顯的配子體階段［1-3］。羊棲菜富含蛋白質(zhì)、多糖、膳食纖維、B族維生素、褐藻酸、甘露醇及人體必需的礦物質(zhì)和微量元素，具有較高的食用及藥用價(jià)值，且是優(yōu)良的海藻工業(yè)原料，具有廣闊的市場(chǎng)前景［4-5］。自1989年羊棲菜人工試養(yǎng)成功后，現(xiàn)已成為我國(guó)淺海藻類栽培的重要種類之一，主要集中在浙江洞頭，面積最多時(shí)達(dá)1 040 hm2，產(chǎn)量近8 737 t，年創(chuàng)匯2 100萬美元［6］。

國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)羊棲菜進(jìn)行了大量的研究，ZOU et al［7-8］研究了羊棲菜的繁殖模式及生殖調(diào)控；PANG et al［9-10］對(duì)羊棲菜也進(jìn)行了同步受精的研究；張勝幫等［11］進(jìn)行了羊棲菜多糖的提取分離及其清除自由基的活性研究；劉樹興等［12］通過對(duì)羊棲菜干制技術(shù)的研究，制成了一種方便營(yíng)養(yǎng)的干燥即食羊棲菜。YUet al［13］分別利用ISSR及SRAP標(biāo)記技術(shù)對(duì)中國(guó)沿海9種野生羊棲菜種群作了遺傳結(jié)構(gòu)的分析；ZHAO et al［14-15］以羊棲菜種群為對(duì)照，用RAPD和ISSR技術(shù)研究比較了山東半島4個(gè)不同地區(qū)鼠尾藻（Sargassum thunbergii）和海黍子（Sargassum muticum）各自的群體遺傳結(jié)構(gòu)；呂慧等［16］運(yùn)用RAPD技術(shù)構(gòu)建了羊棲菜3個(gè)主要養(yǎng)殖品系的DNA指紋圖譜。

隨著我國(guó)羊棲菜栽培在海藻產(chǎn)業(yè)中所占比例的日益提高，優(yōu)良種質(zhì)的選育仍是未來發(fā)展的方向。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)栽培于浙江洞頭海區(qū)5個(gè)不同品系來源的羊棲菜測(cè)定其栽培性狀，并利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)羊棲菜進(jìn)行遺傳背景的研究，以期為羊棲菜資源的合理開發(fā)利用及其遺傳育種提供一定的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)所用材料的品系編碼、原始采集地及養(yǎng)殖狀況如表1所示。將栽培于洞頭同一海區(qū)5個(gè)不同品系的羊棲菜采回，放置于-40℃冰箱中保存，以備后續(xù)的DNA提取；用采自浙江洞頭的鼠尾藻作種間對(duì)照。

1.2 栽培性狀的測(cè)定

對(duì)栽培于洞頭海區(qū)不同來源的羊棲菜品系，各隨機(jī)選擇其中株高為5 cm左右的藻株20株，自2011年10月25日開始測(cè)定，每間隔30 d測(cè)定其株重及株高，測(cè)定時(shí)間至2012年5月。

1.3 基因組DNA的提取

將存放于-40℃冰箱內(nèi)的6種實(shí)驗(yàn)材料分別在無菌海水中復(fù)蘇過夜。用毛筆在無菌海水中反復(fù)輕刷藻體表面后置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.7%的碘化鉀溶液中浸泡5～10 min，再用無菌海水沖洗數(shù)次。用吸水紙吸干表面水分，再各取幼嫩部分藻體約100 mg，立即用液氮迅速研磨成粉。

DNA提取按照Biospin植物基因組DNA提取試劑盒（購自杭州昊天生物技術(shù)有限公司）的說明進(jìn)行。提取后的DNA用核酸蛋白質(zhì)儀檢測(cè)其濃度，并用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA完整性。

1.4 ISSR引物選擇

實(shí)驗(yàn)所用ISSR引物由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司合成，共36條，從中篩選出11條擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清晰、多態(tài)性較好的引物用于不同品系羊棲菜遺傳多樣性分析。這11條引物的名稱、序列及退火溫度見表2。

1.5 ISSR-PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)在Biometra PCR儀中進(jìn)行，2×Power Taq PCR Master Mix購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司。25μL反應(yīng)體系中，Mix 12.5μL，dd H2O 8.5 μL，引物（10μmol/L）2μL，模板DNA（DNA含量為0.5～1.5 ng）2μL。

PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；接著設(shè)置35個(gè)循環(huán)：94℃變性45 s，退火1 min（退火溫度見表2），72℃延伸2 min；循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10 min。取擴(kuò)增產(chǎn)物在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄結(jié)果。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

生長(zhǎng)性狀數(shù)據(jù)：實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x± SD）表示。用IBM SPSS分析軟件進(jìn)行ANOVA分析。

ISSR數(shù)據(jù)：電泳圖譜的每1條帶均為1個(gè)分子標(biāo)記，代表1個(gè)引物的結(jié)合位點(diǎn)。統(tǒng)計(jì)條帶的有無，強(qiáng)帶和可重復(fù)性出現(xiàn)的弱帶記為1，若無條帶則為0。采用NEI et al［17］的計(jì)算方法：S=2Nij/（Ni+Nj）來計(jì)算樣品間的相似性系數(shù)（S），其中Nij為材料i和j共有的條帶數(shù)，Ni和Nj分別為材料i和j各自的條帶數(shù)。遺傳距離D=1-S，利用Popgen 32軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，根據(jù)遺傳距離用UPGMA法進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建分子樹狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 栽培性狀測(cè)定結(jié)果

本研究對(duì)栽培在浙江洞頭同一海區(qū)不同的羊棲菜品系分別測(cè)定其株重及株高，結(jié)果如表3和圖1所示。ANOVA分析顯示，2011年10月至2012年1月為羊棲菜幼苗的初期生長(zhǎng)階段，各品系之間株重和株高差異不顯著。2012年2月至5月是羊棲菜的快速生長(zhǎng)期，各品系在株重和株高上存在顯著性差異（P＜0.05）。在2012年5月的測(cè)定結(jié)果中，HG株高值大于DT、NJ和ST，并呈顯著性差異（P＜0.05），與DJ差異不顯著，DT、NJ和ST之間差異不顯著；HG株重值大于DJ、DT和NJ，并呈顯著性差異（P＜0.05），與ST差異不大，DJ、DT和NJ之間差異不顯著。表明HG品系在栽培實(shí)踐中，具有良好生產(chǎn)性狀的潛力。

表3 不同品系羊棲菜栽培性狀比較（n=20，Tab.3 Comparison of cultivated characteristics among 5 strains of Sargassum fusiforme（Harv.）Setch.（n=20；x±SD）

注：同一行數(shù)據(jù)上字母相同者表示差異不顯著（P＞0.05），不同者表示差異顯著（P＜0.05）

HG DT DJ NJ ST 2011.10 0.14（±0.06）a 0.15（±0.06）a 0.15（±0.03）a 0.15（±0.03）a 0.15±（0.04）a 5.2（±0.26）a 5.2（±0.17）a 5.1（±0.26）a 5.1（±0.10）a 5.2±（0.26）日期株重/g 株高/cm HG DT DJ NJ ST a 2011.11 0.18（±0.03）a 0.16（±0.01）a 0.17（±0.04）a 0.16（±0.02）a 0.17±（0.04）a 13.3（±0.79）a 12.5（±1.41）a 12.2（±1.04）a 13.4（±2.61）a 14.4±（1.90）a 2011.12 0.38（±0.04）a 0.32（±0.04）a 0.37（±0.02）a 0.33（±0.02）a 0.39±（0.04）a 18.6（±1.40）a 16.7（±1.95）a 16.6±（2.13）a 17.2（±1.64）a 16.9±（1.65）a 2012.01 0.53（±0.08）a 0.44（±0.05）a 0.47（±0.08）a 0.41（±0.10）a 0.49±（0.09）a 25.9（±2.46）a 23.8（±1.59）a 24.1±（2.00）a 24.4（±1.57）a 23.3±（1.61）a 2012.02 1.68（±0.20）a 1.41（±0.10）a 1.52（±0.16）a 1.39（±0.26）a 1.62±（0.18）a 33.9（±1.15）a 27.6（±2.05）c 32.6±（1.08）a 31.7（±1.57）ab 28.5±（3.66）bc 2012.03 3.67（±0.34）a 3.09（±0.17）b 3.49（±0.33）ab 3.14（±0.17）ab 3.51±（0.33）ab 50.5（±2.18）a 41.4（±2.16）b 49.5±（3.48）a 44.5（±2.00）b 49.5±（2.29）a 2012.04 6.86（±0.84）a 5.82（±0.17）c 6.12（±1.13）a 5.61（±0.46）bc 6.55±（0.69）a 98.5（±1.50）a 88.8（±3.06）b 86.7±（2.19）bc 84.7（±2.56）bc 82.7±（1.21）c 2012.05 17.9（±1.15）a 13.7（±1.95）c 14.9（±1.21）bc 13.3（±1.70）c 16.4±（0.60）ab 169.8（±2.98）a 157.3（±2.51）b 164.3±（4.19）a 152.3（±2.16）bc150.3±（3.74）c

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

在ISSR-PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)中，以提取的5個(gè)不同品系的基因組DNA為模板進(jìn)行引物篩選，結(jié)果從36條引物中篩選出11條引物，可擴(kuò)增出清晰穩(wěn)定，重復(fù)性好，多態(tài)性高的條帶（部分引物的擴(kuò)增結(jié)果見圖2）。擴(kuò)增結(jié)果顯示不同引物在所有材料中的擴(kuò)增條帶總數(shù)不同，擴(kuò)增片段大小在250～2 250 bp之間，11條引物在5個(gè)羊棲菜樣品中共擴(kuò)增出219條DNA帶，其中多態(tài)性條帶為129條，占58.9%。

2.3 遺傳多樣性分析

利用Popgen 32軟件計(jì)算不同樣品間的遺傳距離（表4）。由表4可知，5個(gè)羊棲菜品系之間的遺傳距離在0.151 0至0.382 4之間；其中DT與ST之間的遺傳距離最大，為0.382 4；DT與NJ之間的遺傳距離最小，為0.151 0。根據(jù)個(gè)體間的遺傳距離，結(jié)合UPGMA法構(gòu)建聚類分析圖（圖3）可知，5個(gè)羊棲菜品系首先聚在一起，DT首先與NJ聚為一類后與HG聚在一起，再與DJ聚合，最后才與ST聚合，同屬的鼠尾藻在最外群。

3 討論

3.1 不同品系羊棲菜的栽培性狀

近年來，隨著市場(chǎng)對(duì)羊棲菜需求的日益增長(zhǎng)，羊棲菜資源的開發(fā)利用受到眾多養(yǎng)殖戶的追捧。不僅廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥領(lǐng)域，亦是海藻工業(yè)的重要原料之一，可用于褐藻膠、甘露醇、碘及褐藻淀粉等物質(zhì)的提取。本研究對(duì)栽培于洞頭同一海區(qū)不同品系的羊棲菜定期測(cè)定其生長(zhǎng)性狀，通過相互比較，發(fā)現(xiàn)在生長(zhǎng)階段后期，不同品系羊棲菜在株重和株高方面存在顯著性差異（P＜0.05），HG品系較其他品系具有更好的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，可為苗種選育提供目標(biāo)品系，這對(duì)于羊棲菜總產(chǎn)量的提高具有重大意義。

3.2 不同品系羊棲菜的遺傳多樣性

分子標(biāo)記技術(shù)可以從分子水平上區(qū)分不同品種之間的差異，而不受環(huán)境條件的限制及組織發(fā)育的影響，穩(wěn)定可靠［18］。本文利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，篩選出的11條引物在5個(gè)品系的羊棲菜中共擴(kuò)增出219條DNA帶，其中多態(tài)性條帶為129條，多態(tài)性比率為58.9%。由聚類圖可知，DT首先與NJ聚為一支，兩者間遺傳距離最小，為0.151 0，親緣關(guān)系最近，這2種品系原始親本均位于溫州，地理位置相近，洞頭本地栽培羊棲菜（DT）的親本最初可能來自南麂島野生羊棲菜（NJ）。HG與DT之間的遺傳距離為0.173 0，HG品系的原種自韓國(guó)引進(jìn)，這2個(gè)品系原種雖地理位置相隔甚遠(yuǎn)，但均栽培于洞頭同一海區(qū)，養(yǎng)殖環(huán)境相似，且HG品系引進(jìn)栽培時(shí)間較其它品系早，在不斷的養(yǎng)殖期間加強(qiáng)了兩者群體間的基因流動(dòng)，故而遺傳距離較小。

于深輝［19］對(duì)我國(guó)沿海9個(gè)地理種群的羊棲菜野生種群作了ISSR遺傳結(jié)構(gòu)分析，得到99.61%的高遺傳多態(tài)性；2008年，呂慧［20］利用ISSR遺傳標(biāo)記方法對(duì)浙江洞頭養(yǎng)殖常用的羊棲菜品系進(jìn)行了遺傳多態(tài)性分析，結(jié)果顯示多態(tài)位點(diǎn)比率為67.4%；本文運(yùn)用ISSR對(duì)洞頭栽培的不同羊棲菜品系進(jìn)行分析得到其多態(tài)性比率為58.9%，多樣性程度明顯降低。分析原因認(rèn)為：一方面，野生羊棲菜來源于我國(guó)沿海9個(gè)不同的地理種群，地理隔離較大，生殖隔離較好，故種群之間基因流動(dòng)水平較低，遺傳變異很高。另一方面，2008年前，羊棲菜的人工養(yǎng)殖主要依靠營(yíng)養(yǎng)繁殖，即采取海礁上自然生長(zhǎng)的野生苗種作為種質(zhì)來源。隨后，羊棲菜人工養(yǎng)殖采用假根渡夏、幼孢子體的“北育南養(yǎng)”等方式，親本來源于之前養(yǎng)殖的野生苗種，野生種經(jīng)歷幾代人工育苗、栽培之后，存在基因單一化流動(dòng)態(tài)勢(shì)，遺傳變異必然有所降低，多樣性程度也隨之降低。對(duì)于目前洞頭栽培品系遺傳多態(tài)性較低的問題，可充分利用我國(guó)沿海豐富的野生羊棲菜資源，為日后推進(jìn)羊棲菜的種苗選育提供優(yōu)質(zhì)的親本來源。

4 結(jié)論

（1）通過定期測(cè)定浙江洞頭不同栽培品系羊棲菜的生長(zhǎng)性狀，發(fā)現(xiàn)在生長(zhǎng)階段后期，各品系的株重和株高都存在顯著性差異（P＜0.05），原始親本引自韓國(guó)的羊棲菜品系較其他品系具有更好的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，可作為育苗選種目標(biāo)品系。

（2）應(yīng)用ISSR技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)洞頭羊棲菜養(yǎng)殖品系遺傳多樣性程度偏低，而我國(guó)沿海豐富的野生羊棲菜資源并未得到充分的研究利用，積極開展羊棲菜種質(zhì)資源的保護(hù)及優(yōu)良苗種的選育是羊棲菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。建立羊棲菜優(yōu)良的種質(zhì)基因庫，豐富其遺傳背景，可為今后羊棲菜全人工養(yǎng)殖模式的開展提供充分且優(yōu)異的親本材料，以促進(jìn)羊棲菜產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

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Analysis of cultivated characteristics and ISSR of different strains of Sargassum fusiforme（Harv.）Setch. in Dongtou，Zhejiang

XU Jia-li，LUO Qi-jun*，YAN Xiao-jun
（School of Marine Sciences，Ningbo University，Ningbo 315211，China）

There are diverse origins of cultivated Sargassum fusiforme（Harv.）Setch.in Dongtou，Zhejiang Province.In this paper，5 strains of S.fusiforme were investigated，of which one came from Korea，three were collected from Dongtou，Nanji Island，Dongji Island of Zhejiang Province，and the last one was from Shantou，Guangdong Province.Significant differences were found among the five strains in the algal weight and height.The strain of S.fusiforme from Korea had better growth advantages than others，so it could be used as target strain for breeding.The genetic diversity of S.fusiforme was analyzed by ISSR makers.The genetic distances among the samples were calculated by Popgen 32 and the cluster analysis was performed by UPGMA method.The results showed that 11 ISSR primers could amplify polymorphic and informative bands from the 36 screened primers.Total 219 DNA bands were amplified，of which 129 were polymorphic and the percentage of polymorphic loci reached to 58.9%.The genetic distances of the 5 samples varied from 0.151 0 to 0.382 4.In the dendrogram，five strains of S.fusiforme clustered into one clade and S.thunbergii were in the outgroup.The study revealed that the genetic diversity of the cultivated S.fusiforme in Dongtou was low on the DNA molecular level，which provided theoretical reference for the developing genetic resources conservation and superior seed breeding of S.fusiforme in the future.

Sargassum fusiforme（Harv.）Setch.；cultivated characteristics；ISSR；genetic diversity

S968.42+5；Q755

A

1001-909X（2014）02-0074-06

10.3969/j.issn.1001-909X.2014.02.010

徐佳麗，駱其君，嚴(yán)小軍.浙江洞頭不同品系羊棲菜的栽培性狀及ISSR分析［J］.海洋學(xué)研究，2014，32（2）：74-79，

10.3969/j. issn.1001-909X.2014.02.010.

XU Jia-li，LUO Qi-jun，YAN Xiao-jun.Analysis of cultivated characteristics and ISSR of different strains of Sargassum fusiforme（Harv.）Setch.in Dongtou，Zhejiang［J］.Journal of Marine Sciences，2014，32（2）：74-79，doi：10.3969/j.issn.1001-909X. 2014.02.010.

2013-06-27…………

2014-03-31

國(guó)家科技支撐計(jì)劃課題資助（2011BAD13B08）；國(guó)家海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目資助（201105009）；浙江省海洋環(huán)保項(xiàng)目資助（WZHX2012-10-116）

徐佳麗（1989-），女，浙江新昌縣人，主要從事藻類分子生物學(xué)與遺傳育種方面的研究。E-mail：xujiali1009@163.com

*通訊作者：駱其君，副教授，E-mail：luoqijun@nbu.edu.cn