食源性致病菌多重PCR快速檢測(cè)研究進(jìn)展

余倩，黃夢(mèng)娜

（仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東廣州510225）

食源性致病菌多重PCR快速檢測(cè)研究進(jìn)展

余倩，黃夢(mèng)娜

（仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東廣州510225）

食品安全問(wèn)題現(xiàn)在備受關(guān)注，食品中致病菌的污染造成的食物中毒事件時(shí)常發(fā)生，傳統(tǒng)的食源性致病菌檢測(cè)方法操作繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，未能及時(shí)檢驗(yàn)出食品中的致病菌，這些缺點(diǎn)限制了此方法的廣泛應(yīng)用。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）滿足了快速檢測(cè)致病菌的要求。主要介紹多重PCR快速檢測(cè)食源性致病菌的原理、特點(diǎn)、檢測(cè)體系的組成及其應(yīng)用。多重PCR具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、可同時(shí)檢測(cè)多種致病菌的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)多重PCR技術(shù)可結(jié)合熒光定量PCR、基因芯片技術(shù)等建立一個(gè)更加完善的體系。

食源性致病菌；多重PCR；快速檢測(cè)

近幾年，食品安全問(wèn)題的不斷爆發(fā)，打擊了消費(fèi)者對(duì)食品安全的信心。我國(guó)各大品牌速凍食品被檢出金黃色葡萄球菌超標(biāo)；德國(guó)芽菜感染大腸桿菌致多人中毒；美國(guó)人生吃從墨西哥進(jìn)口的西紅柿，因含沙門(mén)氏菌而中毒；在我國(guó)山西干豐火腿腸的肉毒梭菌超標(biāo)引起的中毒事件也引起社會(huì)的關(guān)注。各國(guó)因?yàn)橹虏【廴臼称芬鹬卸臼录l頻發(fā)生，為了避免類(lèi)似食品安全事件的發(fā)生，食品中食源性致病菌的檢測(cè)在當(dāng)今社會(huì)中顯得尤其重要。由于傳統(tǒng)的微生物檢測(cè)方法步驟繁瑣，消耗時(shí)間長(zhǎng)，工作量大，限制了該方法的廣泛使用。分子生物學(xué)方法作為食品微生物學(xué)的主要檢測(cè)方法之一，主要包括基因探針檢測(cè)方法、PCR技術(shù)、基因芯片技術(shù)等[1]。近幾年，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)憑借著特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便快速、靈敏度高、對(duì)標(biāo)本的純度要求低等優(yōu)點(diǎn)迅速的發(fā)展起來(lái)。多重PCR技術(shù)是在原有PCR基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，在同一反應(yīng)體系中加入多對(duì)引物，同時(shí)擴(kuò)增多條目的DNA的新型PCR技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了多種食源性致病菌的同時(shí)檢測(cè)。

1 多重PCR的原理及特點(diǎn)

1.1 原理

多重PCR原理與常規(guī)PCR基本相同。其基本原理是：在模板DNA、dNTP、適當(dāng)緩沖溶液的混合體系中，加入多對(duì)特異性引物，在DNA聚合酶的催化作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，對(duì)引物所界定的DNA樣品中的不同序列進(jìn)行擴(kuò)增。多重PCR的過(guò)程包括變性、退火、延伸三個(gè)步驟組成，經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)，形成新的DNA片段，該片段又可以作為下一輪反應(yīng)的模板[2]。如此重復(fù)改變溫度，有高溫變性、低溫復(fù)性和適溫延伸組成一個(gè)周期反復(fù)循環(huán)，使目的基因得以迅速擴(kuò)增。

1.2 特點(diǎn)

多重PCR保留了常規(guī)PCR特異性強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn)，同時(shí)又減少了操作時(shí)間、操作步驟及試劑的用量[3]。特別適用于檢測(cè)單拷貝基因缺失、重排、插入等異常改變，且可檢測(cè)小片段缺失。多重PCR目前也存在著一定的不足：該檢驗(yàn)方法不可區(qū)別活菌與死菌；引物之間可能存在干擾，因?yàn)榉磻?yīng)條件對(duì)擴(kuò)增結(jié)果有影響，所以要控制和協(xié)調(diào)好各反應(yīng)條件。

2 多重PCR反應(yīng)體系的組成

PCR反應(yīng)體系主要由模板、引物、dNTP、緩沖液、Taq DNA聚合酶以及反應(yīng)促進(jìn)劑組成。PCR的模板的標(biāo)本為核酸，主要為DNA。雖然大多數(shù)PCR對(duì)模板純度要求不高，但仍然需要部分純化，以除去標(biāo)本中的Taq DNA聚合酶抑制物、蛋白酶、核酸酶等。引物是指與帶擴(kuò)增的靶DNA區(qū)段兩端序列互補(bǔ)的人工合成的寡核苷酸短片段，引物的合成與選擇對(duì)PCR成功與否具有決定性意義[4]。反應(yīng)中dNTP和MgCl2的濃度應(yīng)該達(dá)到平衡，因?yàn)閐NTP的結(jié)合和Taq DNA聚合酶發(fā)揮活性，都需要游離的鎂離子。緩沖液的濃度提高到2×可以有效提高多重PCR的效率[5]。

3 多重PCR在食源性致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用

隨著食品安全問(wèn)題的不斷爆發(fā)，食品致病菌快速檢測(cè)的要求越來(lái)越高。近幾年，國(guó)內(nèi)外的許多報(bào)道采用了多重PCR技術(shù)檢測(cè)食源性致病菌，多重PCR快速檢測(cè)各種食源性致病菌受到研究者的關(guān)注。

3.1 沙門(mén)氏菌（salmonella）的檢測(cè)

據(jù)統(tǒng)計(jì)，在世界各國(guó)的種類(lèi)細(xì)菌性食物中毒事件中，由沙門(mén)氏菌引起的食物中毒名列榜首。傳統(tǒng)的沙門(mén)氏菌檢測(cè)是通過(guò)前增菌、選擇性增菌、分離培養(yǎng)，并對(duì)該菌落分離物進(jìn)行生化試驗(yàn)和血清實(shí)驗(yàn)來(lái)鑒定，所需時(shí)間至少為4 d～7 d。

陳諾等研究出用于檢測(cè)沙門(mén)氏菌的靶基因的引物基因主要有invA、invB、invC、invD、invE、hilA、fimA、hns、spv、16S rRNA，血清群特異性引物基因rfb基因和血清型特異性引物基因fliC、fljB、via基因等[6]。針對(duì)沙門(mén)氏菌的靶基因，可通過(guò)設(shè)計(jì)合適的引物來(lái)進(jìn)行多重PCR的檢測(cè)。Geevaretham Jeyasekaran等通過(guò)五個(gè)不同的特異性引物基因fimA，、himA，、hns、invA和hto基因建立了多重PCR檢測(cè)蝦米中的沙門(mén)氏菌體系，該實(shí)驗(yàn)僅需8 h[7]。Camila等運(yùn)用多重PCR技術(shù)，在巴西境內(nèi)檢測(cè)冷凍家禽肉中沙門(mén)氏菌污染及常見(jiàn)血清型的流行情況。該實(shí)驗(yàn)以沙門(mén)氏菌屬特異性基因ompC、傷寒沙門(mén)氏菌ViaB基因、腸炎沙門(mén)氏菌7Sdf基因和鼠傷寒沙門(mén)氏菌Spy基因?yàn)榘谢颍M(jìn)行多重PCR特異性擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，研究結(jié)果表明，陽(yáng)性結(jié)果與常規(guī)微生物檢測(cè)結(jié)果一致，且靈敏度高于常規(guī)微生物培養(yǎng)法[8]。而Ashok Kumar等研究發(fā)現(xiàn)了早期診斷傷寒副傷寒沙門(mén)氏菌的基因標(biāo)志物，診斷采用多重PCR技術(shù)檢測(cè)只需2 h，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間[9]。

3.2 腸出血性大腸桿菌（Enterohemorrhagic Escherichia coli）的檢測(cè)

腸出血性大腸桿菌的主要致病菌株為O157∶H7。傳統(tǒng)的大腸菌群檢測(cè)是通過(guò)樣品稀釋后進(jìn)行乳酸膽鹽發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，分離培養(yǎng)后進(jìn)行革蘭氏染色，采用顯微鏡觀察鑒定。該方法操作步驟繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，而且傳統(tǒng)的生化試驗(yàn)鑒定和常規(guī)PCR都不能準(zhǔn)確的監(jiān)測(cè)和鑒定腸出血性大腸桿菌O157∶H7。

目前多重PCR檢測(cè)腸出血性大腸桿菌O157∶H7時(shí)，主要的毒力基因有：編碼志賀毒素stx1和stx2基因、編碼與細(xì)菌粘附作用有關(guān)的蛋白eaeA基因、編碼溶血素hly基因，因此這些基因被作為PCR檢測(cè)的常用靶基因[10]。路長(zhǎng)勇通過(guò)自主研發(fā)食源性致病菌特異性靶點(diǎn)的自動(dòng)挖掘方法，建立優(yōu)化了多重PCR的檢測(cè)體系，包括單核細(xì)胞增生李斯特菌、阪崎腸桿菌、志賀氏菌、腸出血性大腸桿菌O157∶H7、沙門(mén)氏菌、副溶血弧菌和金黃色葡萄球菌的靶點(diǎn)篩選庫(kù)，靈敏度較高[11]。Barbora Vidova等，從牛奶和肉類(lèi)樣品中，通過(guò)多重PCR反應(yīng)體系，檢測(cè)出腸出血性大腸桿菌O157∶H7[12]。多重PCR的運(yùn)用對(duì)腸出血性大腸桿菌的檢測(cè)提供了一個(gè)快速、有效的方法。

3.3 金黃色葡萄球菌（StaphyloccocusaureusRosenbach）的檢測(cè)

金黃色葡萄球菌是人類(lèi)的一種重要病原菌。美國(guó)疾病控制中心報(bào)告，由金黃色葡萄球菌引起的感染事件數(shù)量占第二位，僅次于大腸桿菌。金黃色葡萄球菌腸毒素是引起食物中毒的主要原因。金黃色葡萄球菌腸毒素的檢測(cè)主要有動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)、血清試驗(yàn)、免疫熒光試驗(yàn)及酶聯(lián)免疫吸附等方法，多重PCR快速檢測(cè)技術(shù)也是其中的一種。多重PCR的檢測(cè)結(jié)果與免疫學(xué)檢測(cè)結(jié)果基本一致，但多重PCR還可以檢測(cè)一些免疫學(xué)方法不能檢測(cè)的腸毒素基因。

目前用于檢測(cè)金黃色葡萄球菌腸毒素SE的相關(guān)靶基因有sea、seb、sec、sed、see、seh、sei和sej基因[6]。以及編碼耐熱核酸酶基因nuc，編碼血漿凝固酶coa基因[13]。國(guó)外最早采用PCR方法是1991年Wilson等利用PCR技術(shù)從食品中檢測(cè)出金黃色葡萄球菌，該方法8 h內(nèi)即可檢出人工污染的干燥脫脂奶中的金黃色葡萄球菌，檢出量為105cfu/mL～106cfu/mL[14]。何暉等針對(duì)sea、seb、sec、sed、see 4個(gè)靶基因設(shè)計(jì)出四對(duì)引物進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)，達(dá)到了快速準(zhǔn)確檢測(cè)sea、seb、sec、sed、see 4個(gè)靶基因的目的，從而檢測(cè)出金黃色葡萄球菌[15]。3.4 其他食源性致病菌的檢測(cè)

多重PCR在其他食源性致病菌的檢測(cè)中也得到了廣泛的運(yùn)用。肉毒梭菌一共有A、B、C、D、E、F和G七個(gè)型，其中引起食物中毒的主要是A、B、E、F四種型[16]。王穎群等通過(guò)對(duì)比各型肉毒神經(jīng)毒素基因，選取其保守序列及16SrRNA基因的保守序列，設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，得出該引物可特異性擴(kuò)增A、B、E、F和G型的梭菌[17]。王艷君等以沙門(mén)氏菌編碼DNA結(jié)合蛋白hns基因、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌溶血素Hly基因和大腸桿菌O157∶H7編碼外膜蛋白緊密素eaeA基因?yàn)榘谢蛟O(shè)計(jì)了3對(duì)引物，建立了利用多重PCR技術(shù)檢測(cè)冷卻肉制品中3種致病菌的方法[18]。多重PCR技術(shù)在志賀氏菌、枯草芽孢桿菌、霍亂弧菌、副溶血弧菌等其他食源性致病菌的檢測(cè)中也得到廣泛運(yùn)用。

4 小結(jié)

在經(jīng)濟(jì)發(fā)展的現(xiàn)代，人們追求更多的是健康，食品的安全成為社會(huì)關(guān)注的焦點(diǎn)。多重PCR快速檢測(cè)技術(shù)特異性強(qiáng)和靈敏度高，操作簡(jiǎn)單，消耗時(shí)間和試劑少，一次反應(yīng)可以檢測(cè)多個(gè)基因型，減輕了工作量，同時(shí)還適用于小片段缺失的檢驗(yàn)，這些優(yōu)點(diǎn)使得多重PCR必將成為食源性致病菌的重要檢驗(yàn)方法之一。同時(shí)多重PCR可以與其他技術(shù)相結(jié)合，如熒光定量PCR相結(jié)合，可提高檢測(cè)效率?；蚴桥c其他檢測(cè)方法相結(jié)合，如基因芯片、實(shí)時(shí)PCR等，可以創(chuàng)造一個(gè)更完整的體系。PCR技術(shù)現(xiàn)已用于肝炎、艾滋病、皰疹病毒感染診斷，在醫(yī)學(xué)方面也作出了巨大貢獻(xiàn)[5]。所以多重PCR技術(shù)除了在食品范圍內(nèi)得到應(yīng)用，在科研和臨床領(lǐng)域也將會(huì)得到更多更好的應(yīng)用。

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Research of Multiplex PCR Fast Detection on Food-borne Bacterial Pathogens

YU Qian，HUANG Meng-na
（College of Food Science and Technology，Zhongkai University of Agriculture and Engineering，Guangzhou 510225，Guangdong，China）

Food safety has already been become the focus of attention.Food poisoning incidents have occurred by the pollution of food-borne bacterial pathogens frequently.It is quite complex and cost much time of traditional methods for detection of food-borne pathogens，so it can't checkout the pathogenic bacteria in food timely.All of these disadvantages limit its application.Multiplex-PCR can meet the requirement of checking out the pathogenic bacteria fast.This article introduced the theory，characteristic，composition of detection system and application of Multiplex-PCR.Multiplex-PCR had the advantages of high specificity，high sensitivity，simple operation and checking multiple pathogenic bacteria at the same time.Furthermore，multiplex-PCR can combine with fluorescence quantitative PCR or gene chip technology to establish a better system.

food-borne bacterial pathogens；multiplex PCR；fast detection

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.19.034

2013-07-23

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2011B031500023）

余倩（1979—），女（漢），副教授，研究生，研究方向：食品微生物。