半薄切片技術(shù)實踐探討

胡基華，李 晶，2，張淑梅，2，孟力強(qiáng)，2，曹 旭，2

(1．黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，哈爾濱150020;2．黑龍江省科學(xué)院高技術(shù)研究所，哈爾濱150010)

隨著透射電子顯微鏡在科學(xué)研究中的廣泛應(yīng)用，已經(jīng)成為觀察組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的一種手段，生物標(biāo)本的制備，也是下一步結(jié)構(gòu)觀察和獲得好結(jié)果的前提。但是，由于切片太小，有時難于觀察到目標(biāo)結(jié)構(gòu)，為此需大量制備樣品，造成工作量大而且消耗多。為使超薄切片能精確地切到目標(biāo)部位，在做超薄切片前，首先要先做半薄切片來進(jìn)行定位［1］。半薄切片(厚度0．6 ～0．8μm)的制備是一種常用制樣手段，已經(jīng)應(yīng)用在胚胎學(xué)、病理學(xué)及動植物細(xì)胞學(xué)研究中。

半薄切片的制備在取材、固定、漂洗脫水、滲透包埋、切片和染色的每一個步驟，都很關(guān)鍵，任何環(huán)節(jié)的疏忽都會導(dǎo)致制片的失敗。目前多采用環(huán)氧樹脂和塑料包埋介質(zhì)，由于后者對組織和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的保存較差，難以達(dá)到電鏡觀察的要求。同一樣本若要作電鏡觀察又須進(jìn)行光鏡檢查，環(huán)氧樹脂包埋組織的方法能達(dá)到上述目的［2］。

1 固定液的選擇和半薄切片的制備

固定液一般選擇FAA固定液和卡諾固定液。FAA固定液(福爾馬林5 mL，冰醋酸5 mL，70%酒精90 mL)一般適用固定植物根、莖、葉、花藥和子房組織。值得注意的是幼嫩材料應(yīng)選用50%的酒精代替70%酒精，防止材料收縮;在固定液中加入5%甘油可防固定液蒸發(fā)和材料變硬;卡諾固定液(純酒精15 mL，冰醋酸5 mL或者純酒精30 mL，氯仿5 mL，冰醋酸1 mL)，滲透迅速，但是固定時間不能太久，一般不超過1d。伊麗米努爾等使用不同濃度梯度的乙醇為胡楊種子脫水的實驗表明，胡楊種子在4℃的70%酒精中可放置較長的時間，固定較快，對胡楊種子細(xì)胞內(nèi)各種結(jié)構(gòu)及其內(nèi)含物有較好的固定作用［3］。

半薄切片的制備，可直接在超薄切片機(jī)上進(jìn)行，也可以在半薄切片機(jī)上進(jìn)行，切片時要注意刀口是否鋒利，實驗表明鈍的刀口切出的片子易發(fā)生皺并且在光鏡下有切痕，影響觀察效果［4］。

2 脫樹脂、脂堿

半薄切片常規(guī)染色方法有甲苯胺蘭染色法、天青/美蘭染色法、堿性復(fù)紅法、蘇木素—伊紅法、H，E染色法和Giemsa染色法等。無論哪種方法都需要預(yù)先做好脫樹脂處理，否則染料不宜滲入，影響染色效果。脫樹脂使用的是NaOH的乙醇飽和溶液，脫樹脂成功的標(biāo)志是切片中組織周圍的樹脂已脫落，組織上顏色變淡，平展附著于載玻片上，無發(fā)皺、起卷現(xiàn)象，脫樹脂過程中，可以隨時夾出切片在光線下觀察效果。脫的不夠片子染色較淡，脫的太快，半薄切片容易從載玻片上脫落。載玻片黏附性可以避免掉片，是操作過程中不可忽視的環(huán)節(jié)，正確配制脫樹脂試劑才能達(dá)到良好的去除樹脂效果。而另一個避免脫片的關(guān)鍵是掌握好脫樹脂的時間，這些將有助于樹脂包埋樣品用于光鏡方面的觀察與研究，使電鏡樣品不但可用于電鏡方面的超微結(jié)構(gòu)的研究，同時可進(jìn)行光鏡方面的研究。于紅麗等用飽和氫氧化鈉無水乙醇液與甲苯按3∶1混合液脫樹脂，所需時間僅 5 min，樹脂完全脫凈［5］。

3 染色

選擇理想的染色劑非常重要。一般細(xì)胞壁的染料有酸性品紅、番紅、固綠、甲苯胺藍(lán)、蘇木精、結(jié)晶紫、亮綠、蘇丹Ⅳ等。細(xì)胞核染料(堿性)有堿性品紅、蘇木精、洋紅、番紅、地衣紅和結(jié)晶紫等。細(xì)胞質(zhì)染料(酸性)有酸性品紅、甲苯胺藍(lán)、曙紅、固綠和苦味酸等。要遵循先用堿性染料再使用酸性染料的順序，例如，對植物材料染色，使用番紅—固綠對染法，木質(zhì)化的細(xì)胞壁及細(xì)胞核呈紅色，纖維素的細(xì)胞壁及細(xì)胞壁呈綠色;使用鐵礬蘇木精法，作為細(xì)胞一般結(jié)構(gòu)及細(xì)胞分裂時期的優(yōu)良染劑，可使用鐵礬蘇木精法，細(xì)胞分裂時期的染色體呈黑色。PAS(高碘酸—席夫)法染色，可將纖維素細(xì)胞壁及淀粉染成紅色，植物組織會呈不同程度的紅色［6］。

4 結(jié)語

隨著電子顯微鏡技術(shù)的發(fā)展，在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、環(huán)境科學(xué)，尤其是在生物醫(yī)學(xué)、計量醫(yī)學(xué)、遠(yuǎn)程病理診斷等領(lǐng)域都得到廣泛的應(yīng)用。在整個電子顯微鏡技術(shù)中，切片制備的優(yōu)劣直接反映在超薄切片上。影響切片質(zhì)量的因素很多，在實際研究中，電鏡標(biāo)本制備是得到高質(zhì)量超薄切片的工作難點，同時又是技術(shù)的關(guān)鍵。這就要求在實驗中不斷總結(jié)經(jīng)驗，根據(jù)不同的材料性質(zhì)和觀察目的，改良舊的方法，摸索新的方法，使這項技術(shù)日趨完善成熟。

［1］ 蔣海鷹，沈明，馮德云．環(huán)氧樹脂包埋半薄切片脫樹脂新方法［J］．湖南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2000，25(1):85—86．

［2］ 唐海蘭，黃中新．環(huán)氧樹脂包埋塊半薄切片進(jìn)行免疫組化染色的方法［J］．暨南大學(xué)學(xué)報 1997，18(4):9—12．

［3］ 伊麗米努爾，Kurt Zogauer，Bernd Cyffca，史軍輝．改良半薄切片法觀察胡楊種子結(jié)構(gòu)［J］．西部林業(yè)科學(xué)，2013，42(2):26—30．

［4］ 楊興龍，申洪．電鏡樣品半薄切片HE染色前脫樹脂的技術(shù)處理［J］．黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2002，25(3):58—59．

［5］ 于紅麗，張大紅，徐夏紅，等．電鏡半薄切片制備方法的改進(jìn)［J］．徐州醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2004，24(2):129—130．

［6］ 周馥，邢樹平．介紹一種半薄切片定位樣品的方法［J］．植物學(xué)通報，1999，17(3):274—275．