16種EPA-PAHs復合污染土壤的菌群修復

李 政，趙朝成，張云波，趙東風

(中國石油大學化學化工學院，山東青島 266555)

16種EPA-PAHs復合污染土壤的菌群修復

李 政，趙朝成，張云波，趙東風

(中國石油大學化學化工學院，山東青島 266555)

通過富集篩選獲得一組PAHs降解混合菌群和3株降解單菌，利用變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù)分析混合菌群的組成，對16種多環(huán)芳烴(PAHs)復合污染土壤進行生物修復，同時考察混合菌群和單菌株在PAHs復合污染土壤中的生物修復效果。結(jié)果表明:混合菌群主要由3株已分離獲得的降解單菌和5株未可分離培養(yǎng)的單菌組成;經(jīng)過30 d的生物修復，混合菌群對土壤中總PAHs的降解率(54.17%)高于單一菌株(28.40%，31.95%，24.64%)，并且對高相對分子質(zhì)量PAHs的降解表現(xiàn)出了較大的優(yōu)勢，4環(huán)、5環(huán)、6環(huán)PAHs的降解率分別可達到71.26%、39.76%和42.86%;利用混合菌群來修復16種PAHs復合污染的土壤，可以避免一些未可分離培養(yǎng)的關(guān)鍵菌株的丟失，使PAHs的降解更加全面有效。

多環(huán)芳烴;污染土壤;混合菌群;生物降解

多環(huán)芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)是由兩個或兩個以上芳香環(huán)稠合在一起的一類化合物［1］。環(huán)境中的PAHs主要來源于石油污染、油輪泄漏、汽車尾氣，以及煤、石油等天然燃料的不完全燃燒等。由于部分PAHs對生物具有“致癌、致畸變和致突變”作用，美國環(huán)境保護署(EPA)將其中16種PAHs確定為優(yōu)先控制的有機污染物。PAHs的強吸附性使得它們在土壤環(huán)境中長期殘留和積累［2］，再通過呼吸直接進入人體，或者進入大氣顆粒物、水和生物體等其他環(huán)境介質(zhì)，間接影響人體健康［3］。雖然PAHs在環(huán)境中可以通過揮發(fā)、光解、化學氧化、吸附等多種途徑去除，而生物修復技術(shù)因其經(jīng)濟性和二次污染少等特點成為處理該類污染物的最有效方法［4-6］。目前已發(fā)現(xiàn)多種微生物具有降解單一PAHs的能力［7］，如鞘氨醇菌屬(Sphingomonassp.)、假單胞菌屬(Pseudomonassp.)、分枝桿菌屬(Mycobacteriumsp.)和紅球菌屬(Rhodococcussp.)等，而環(huán)境中PAHs通常以多種組分同時存在，呈現(xiàn)其復合污染現(xiàn)象［8］，并且高分子量PAHs(4～6環(huán)PAHs)對微生物生長有強抑制作用，生物可利用性很低［9］，增加了降解的難度。研究［10］表明，混合菌群作為一種多菌體共存的生物群體，在其生長過程中能分解有機物，同時依靠各種微生物之間相互共生增殖及協(xié)同代謝作用降解環(huán)境中的有機物，并能激活其他具有凈化功能的微生物，從而形成復雜而穩(wěn)定的微生態(tài)系統(tǒng)。筆者通過富集培養(yǎng)，從PAHs長期污染的土壤中獲得一組PAHs降解菌群，運用變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù)對該菌群的組成進行分析，并進一步驗證此菌群對土壤中16種EPA-PAHs生物降解效果。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

正己烷(色譜純)、16 EPA-PAHs混合標準樣品等購自美國Supelco公司。

BUCHI R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士步琪有限公司)，HZQ-HA水浴振蕩器(哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司)，GC-6890型氣相色譜儀配火焰離子檢測器(FID)(美國安捷倫公司)，GCMS-QP2010型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(日本島津公司)，KQ-400KDB型高功率數(shù)控超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)。

從新疆克拉瑪依油田百口泉油區(qū)原油處理污泥池附近采集多年污染的土壤。采用棋盤式五點采樣法，取淺層(0～20 cm)土壤，每點取樣量大體一致，將各點取出的樣品等量混合，裝入樣品袋中密封備用。土壤樣品于暗處風干后過2 mm篩，冰箱4℃保存。土壤的基本物理化學性質(zhì)為:pH值7.84，含水率27.3%，總有機質(zhì)含量1.351%，總氮含量0.158%，總磷含量0.042%，總鉀含量0.243%。

無機鹽培養(yǎng)基(MSM):Na2HPO4、KH2PO4、NaNO3、MgSO4、CaCl2、FeSO4的質(zhì)量濃度分別為0.6、0.2、4.0、0.3、0.01、0.01 g/L，酵母膏0.5 g/L，瓊脂20 g/L(固體培養(yǎng)基用)，pH值為7.2～7.4。

PAHs-MSM培養(yǎng)基:提取物經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后過硅膠柱凈化，高純氮氣吹干后重新溶解于適量丙酮，移取一定的用丙酮溶解的PAHs母液(10 g/L)到已滅菌的MSM中，待丙酮揮發(fā)后使用。

1.2 PAHs降解菌群的富集篩選

將10 g土壤樣品加入100 mL已滅菌的MSM中，經(jīng)30℃、160 r/min搖床避光培養(yǎng)10 d后，將其5%(體積分數(shù))轉(zhuǎn)接至PAHs-MSM培養(yǎng)基中繼續(xù)富集培養(yǎng)，連續(xù)轉(zhuǎn)接5次至降解菌群結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定。

采用稀釋涂布法從富集培養(yǎng)后期的混合培養(yǎng)液中分離單菌，將丙酮溶解的PAHs母液(10 g/L)均勻涂抹于固體MSM培養(yǎng)基上，待丙酮自然揮發(fā)后使用。分離純化的單菌用16SrDNA進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物回收純化后測序，并將測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進行核苷酸同源性比較，找出最為接近的細菌種類，確定菌株的種類范疇。

試驗用菌劑為菌懸液，即在無菌條件下將處于對數(shù)生長期的菌液室溫下5000 r/min離心10 min，收集菌體，用磷酸鹽緩沖液清洗，5000 r/min再次離心10 min，反復清洗3次以上，制成菌懸液，含菌量為1.0×108CFU/mL。

1.3 PAHs降解菌群的PCR-DGGE分析

收集第五次轉(zhuǎn)接后的混合菌群培養(yǎng)液，74 μm篩絹過濾去除殘留PAHs干擾，8 000 r/min離心10 min收集菌體。采用TIANGEN細菌基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取混合菌群的DNA。采用引物341F-GC/517R擴增細菌16SrDNA基因，用于 PCR-DGGE分離。變性梯度為30%～60%，在電壓80 V下電泳12 h。DGGE條帶的切膠測序操作參照文獻［11］。對所得DNA序列與Genbank數(shù)據(jù)進行BLAST比對，獲得最相似序列信息。

1.4 土壤中PAHs的生物降解

將10 g風干的土壤樣品加入含有20 mL已滅菌MSM的三角瓶中，接種5 mL菌懸液，于室溫下160 r/min搖床避光培養(yǎng)30 d。通過稱重三角瓶的質(zhì)量差，每3 d補充一次無菌水。同時做不接種菌懸液的對照試驗(CK)，并且所有的試驗均設3個平行。

1.5 土壤中PAHs的分析

(1)PAHs提取方法。參照EPA(方法3550超聲波提取、方法3630硅膠凈化和方法8310多環(huán)芳烴分析)［12-14］，用高壓滅菌的玻璃離心管采集泥漿樣品，4000 r/min離心5 min，置于冷凍干燥機干燥48 h后，稱取2 g干土于玻璃離心管中，加入10 mL二氯甲烷與丙酮的混合溶劑(體積比為1∶1)，超聲萃取20 min后在4000 r/min條件下離心5 min，收集萃取液，如此連續(xù)超聲萃取3次。合并萃取液過無水硫酸鈉除去水分后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將萃取液濃縮，更換溶劑為正己烷，然后過硅膠柱凈化，收集洗脫液，再次濃縮，用高純氮氣定量至1 mL待測。

(2)PAHs分析方法。取PAHs混合標準樣品(100 mg/L)用正己烷依次逐級稀釋，配成5.00、2.00、1.00、0.50、0.20、0.10 g/L的標準系列溶液。

色譜條件:進樣口溫度290℃;接口溫度290℃;色譜柱HP-5彈性石英毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm ×0.25 μm);程序升溫:60℃保持2 min，以6℃/min升到270℃，保持20 min;載氣:高純氦氣，吹掃流速1.10 mL/min，柱前壓力65.2 kPa;不分流進樣。

質(zhì)譜條件:離子源溫度為200℃，溶劑延遲時間6 min，檢測器電壓為1 kV，電子轟擊源(EI)，電離電壓70 eV，掃描模式為選擇性離子方式(SIM)。

2 結(jié)果分析

2.1 PAHs降解菌群的富集篩選

通過對污染土壤中PAHs降解菌的富集培養(yǎng)，獲得了一組可以降解PAHs的菌群，命名為KO5。通過稀釋涂布法從該菌群中分離獲得3株可培養(yǎng)單菌，分別記為KO5-1、KO5-2、KO5-3，其16SrDNA鑒定結(jié)果如表1所示。

表1 PAHs降解菌的16SrDNA鑒定結(jié)果Table 1 Phylogenetic affiliations of PAHs-degrading bacteria

這3株可培養(yǎng)單菌所屬的紅球菌屬(Rhodococcussp.)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonassp.)和芽孢桿菌屬(Bacillussp.)是目前已經(jīng)富集分離并鑒定的PAHs降解菌。Grzegorz Pasternak等［15］以PAHs為主要成分的煤焦油污染土壤中篩選獲得一株Rhodococcus erythropolisB10，對多環(huán)芳烴及雜環(huán)芳烴均有較好的降解效果。另有多項報道［16-18］也證實了該菌屬降解 PAHs的能力。鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonassp.)是降解芳香族化合物的主要菌屬［19］，能夠降解利用熒蒽、萘、菲［20］以及苯并蒽、苯并［a］芘［21］等。芽孢桿菌屬(Bacillussp.)也具有降解PAHs的能力［22-23］。

分別提取混合菌群KO5與3株單菌的DNA一起進行DGGE分析，比較這些單菌在混合菌群中的位置，如圖1。圖1表明，混合菌群KO5由8個主要的單菌株組成，并且3株降解單菌條帶均能與KO5中的條帶相對應，KO5-1對應Band 3，KO5-2對應Band 2，KO5-3對應Band 6。對主要條帶進行測序分析，確定了這些菌株的可能分類，結(jié)果見表2。

PCR-DGGE技術(shù)可以直觀地反應微生物的群落結(jié)構(gòu)［24-25］，能夠檢測到不易分離培養(yǎng)的優(yōu)勢菌株，揭示混合菌群的結(jié)構(gòu)組成。由表2可知，混合菌群KO5包含3株不可培養(yǎng)細菌(Band 1、Band 7、Band 8)、3株已分離獲得的降解單菌，以及一株假單胞菌(Band 4)和一株蒼白桿菌(Band 5)。假單胞菌屬(Pseudomonassp.)是PAHs降解的重要菌屬，該菌屬下的很多降解菌能以四環(huán)PAHs為唯一碳源和能源生長［26］，并且產(chǎn)生的胞外多糖能夠提高PAHs的生物可利用性［27］。有關(guān)蒼白桿菌屬(Ochrobactrumsp.)在降解方面的報道比較少，主要集中在苯系物的降解［28-29］，說明這一屬可能具有使芳香環(huán)裂解的相關(guān)功能。

圖1 混合菌群KO5與單菌株的DGGE圖譜Fig.1 DGGE analysis of microbial consortium KO5 and isolates

表2PAHs降解菌群DGGE條帶序列分析Table 2 Sequence analysis of PAHs-degrading microbial consortium from dominant DGGE bands

2.2 土壤中PAHs的生物降解

從新疆克拉瑪依油田百口泉油區(qū)原油處理污泥池附近采集的土壤樣品中檢測到干土中總PAHs的質(zhì)量分數(shù)為18.59×10-6(表3)，回收率為87.6%?？侾AHs包括16種EPA-PAHs，其中3環(huán)PAHs占34.53%(質(zhì)量分數(shù) 6.42×10-6)，4環(huán) PAHs占 39.64%(質(zhì)量分數(shù) 7.37×10-6)，5環(huán) PAHs占19.36%(質(zhì)量分數(shù)3.6×10-6)。帶有4～6個苯環(huán)的高分子量 PAHs(high molecular weight，簡稱HMW-PAHs)占63.31%，這些化合物具有沸點高，不易揮發(fā)，水溶性低，容易被土壤或底泥中的有機質(zhì)吸附，遺傳毒性高，難降解，環(huán)境中留存時間長的特點［30］。

表3 土壤樣品降解前后16種EPA-PAHs的質(zhì)量分數(shù)Table 3 16 EPA-PAHs mass fraction of contaminated soil before and after inoculatiion 10-6

土壤樣品經(jīng)過30 d生物修復其中總PAHs在不同處理下的降解效果如圖2所示。由圖2可知:與對照試驗組相比，添加的微生物對總PAHs的降解效果明顯;混合菌群KO5對總PAHs的降解率均高于單一菌株。

16種EPA-PAHs降解前后在土壤中的含量見表3(表中數(shù)據(jù)為平均值±標準方差，n=3)。對其中不同環(huán)數(shù)PAHs的降解情況作統(tǒng)計，結(jié)果見圖3。由表3和圖3可知，經(jīng)過30 d的生物修復，所有添加微生物處理的土壤樣品中PAHs的質(zhì)量分數(shù)均低于對照土壤，而添加混合菌群KO5處理的土壤樣品中PAHs的質(zhì)量分數(shù)明顯低于添加單一菌株處理的土樣。土壤中2～3個苯環(huán)的低相對分子質(zhì)量PAHs (LMW-PAHs)的含量較初始土樣有所降低，而高相對分子質(zhì)量PAHs(HMW-PAHs)的含量幾乎不變，這是由于土壤樣品未作滅菌處理，其中固有的微生物對LMW-PAHs有一定的利用。分別添加單一菌株KO5-1、KO5-2和KO5-3的處理中，2～4環(huán)PAHs的質(zhì)量分數(shù)均有明顯的降低，其中對3環(huán)PAHs的降解率在28.57%～56.07%，而對5環(huán)PAHs，僅KO5-2對其有大于20%(22.45% ～29.41%)的降解效果。在添加混合菌群KO5的處理中，3環(huán)PAHs的降解率(40.21%～52.02%)與單菌株的處理相近，而4環(huán)PAHs的降解效果(47.93%～71.26%)明顯高于單菌株的處理(4.04%～39.76%)。混合菌群 KO5對5環(huán) PAHs的降解率為32.73% ～58.43%，對6環(huán)PAHs茚并(1，2，3-cd)芘和苯并(ghi)苝的降解率分別為37.78%和42.86%。隨著苯環(huán)數(shù)增加，混合菌群和單菌株對PAHs降解效率均逐漸降低，這是因為HMW-PAHs分子結(jié)構(gòu)復雜，穩(wěn)定性高，水溶性低，PAHs的沉積物-水分配系數(shù)增大，易于被土壤顆粒吸附，難于被微生物利用［31］。

圖2 土壤中總PAHs的降解率Fig.2 Degradation efficiency of total PAHs in soil

圖3 土壤中不同環(huán)數(shù)PAHs降解前后的質(zhì)量分數(shù)Fig.3 Mass fraction of different-ring PAHs in soil before and after degradation

微生物的降解底物譜是生物修復時選擇微生物的重要因素，微生物能夠利用或降解的污染物越多，在生物修復中的利用價值就越大［8］?；旌暇篕O5對土壤中的LMW-PAHs和HMW-PAHs均有較好的修復效果，降解底譜比較廣，具有較好的應用前景。

PAHs的生物降解有兩種方式:一是微生物以LMW-PAHs作為唯一的碳源和能源，將其完全礦化;二是微生物以共代謝的方式降解HMW-PAHs，包括靠降解其他有機物提供能源，通過其他微生物協(xié)同作用，以及先經(jīng)別的物質(zhì)誘導產(chǎn)生相關(guān)酶系，才能降解相應化合物［32］。本文中篩選得到的混合菌群KO5對HMW-PAHs的降解可能是微生物降解和其中多株單菌共代謝共同作用的結(jié)果。在被污染的土壤中存在著經(jīng)自然選擇優(yōu)化過的混合菌群，其中不同菌株的功能和作用通過長期的演化穩(wěn)定下來。在混合菌群KO5中形成了一種較為穩(wěn)定的細菌群落結(jié)構(gòu)，一些不可分離培養(yǎng)的菌株(如Band l、Band 7、Band 8所代表的菌株)可能對PAHs的降解起著重要的作用，但在目前培養(yǎng)條件下無法通過分離得到。因此直接利用混合菌群來修復PAHs污染的土壤，避免一些未可分離培養(yǎng)的關(guān)鍵菌株的丟失，對HMW-PAHs的降解更加有效。當然，混合菌群結(jié)構(gòu)復雜，如何保持它降解能力的穩(wěn)定性或優(yōu)化其降解條件值得進一步的研究。

PAHs污染土壤的微生物修復是一個復雜的過程，其中高效的PAHs降解菌是必不可少的。有研究［33］表明，從受PAHs污染的土壤中篩選得到的土著菌較外源菌更能有效降解其中的PAHs。表面活性劑的添加可以提高PAHs在水相中的溶解度，進而增強生物利用性，加速環(huán)境中PAHs的降解進程［34-35］。添加維持一定的C∶N∶P營養(yǎng)物質(zhì)及某些微量營養(yǎng)元素對微生物的生長非常重要，通過提高微生物活性可實現(xiàn)PAHs降解高效化［36］。土壤的受污染時間也影響PAHs生物降解，可能是由于其影響土壤對PAHs的吸附與解吸，土壤與PAHs接觸時間越長，PAHs越不容易從土壤中解吸，PAHs對微生物的毒性減小，縮短了微生物的適應期，從而縮短PAHs生物降解的停滯期，提高PAHs的礦化程度［37-38］。此外，土壤含水量、土壤pH值、土壤通氣狀況、環(huán)境溫度、修復時間等因素都影響微生物修復效果［39-40］。

3 結(jié)論

(1)從土壤樣品中檢測到16種EPA-PAHs，質(zhì)量分數(shù)為18.59×10-6，其中含有4～6個苯環(huán)的高分子量PAHs占63.31%，說明土壤受HMW-PAHs污染較為嚴重。

(2)以土壤中PAHs提取物為唯一碳源，經(jīng)過長期富集培養(yǎng)，獲得了一組PAHs降解菌群，包含3株已分離獲得的降解單菌，分別為紅球菌屬(Rhodococcussp.)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonassp.)和芽孢桿菌屬(Bacillussp.)，3株不可培養(yǎng)細菌(Uncultured bacterium clone)，以及一株假單胞菌(Pseudomonassp.)和一株蒼白桿菌(Ochrobactrumsp.)。

(3)經(jīng)過30 d的生物修復，土壤中的PAHs得到有效降解，混合菌群對土壤中總PAHs的降解率高于單一菌株，并且混合菌群對HMW-PAHs的降解表現(xiàn)出了較大的優(yōu)勢，4環(huán)、5環(huán)、6環(huán)PAHs的降解率分別可達到71.26%、39.76%和42.86%。利用混合菌群來修復PAHs污染的土壤，避免一些未可分離培養(yǎng)的關(guān)鍵菌株的丟失，對16種EPA-PAHs復合污染土壤的修復更加有效。

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Bioremediation of 16 EPA-PAHs combined contaminated-soil with microbial consortium

LI Zheng，ZHAO Chao-cheng，ZHANG Yun-bo，ZHAO Dong-feng

(College of Chemistry and Chemical Engineering in China University of Petroleum，Qingdao266555，China)

For bioremediation of polycyclic aromatic hydrocarbons(PAHs)combined contaminated-soil，a microbial consortium and three strains were isolated from PAHs contaminated-soil containing sixteen USEnvironmental Protection Agency priority control PAHs.Denaturing gradient gel electrophoresis(DGGE)was used to analyze the structure of the microbial consortium，and the biodegradation effect of PAHs mixtures with the inoculation of mixed microbial consortium and single strain was studied.The results show that the consortium is mainly composed of three isolated strains and five uncultured bacterias. After 30 days bioremediation，the degradation efficiency of total PAHs by microbial consortium(54.17%)is higher than any single strain's(28.40%，31.95%，24.64%).Microbial consortium shows a great advantage in degradation of high relative molecular mass PAHs，and the degradation efficiencies of four-rings，five-rings and six-rings PAHs are 71.26%，39.76%，42.86%，respectively.Microbial consortium is capable of degrading PAHs which can avoid the loss of key strains and has a good application prospect in the bioremediation of PAHs contaminated-soil.

polycyclic aromatic hydrocarbons;contaminated-soil;microbial consortium;biodegradation

X 53;X 172

A

10.3969/j.issn.1673-5005.2012.01.032

1673-5005(2012)01-0175-07

2011-08-25

中國石油天然氣集團公司科學研究與技術(shù)開發(fā)項目(2008D-4704-2)

李政(1983-)，女(漢族)，山東日照人，博士研究生，研究方向為石油污染土壤生物修復。

(編輯 劉為清)