卜漢萍 王 璐 許 宙 程云輝
BU Han-ping WANG Lu XU ZhouCHENG Yun-h(huán)ui
(長沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院,湖南 長沙 410114)
(College of Chemistry and Biology Engineering,Changsha University of Science and Technology,Changsha,Hunan 410114,China)
近年來,隨著人們生活方式的轉(zhuǎn)變,人體免疫能力受到諸多因素的影響與挑戰(zhàn),老齡化、肥胖癥、飲食不當(dāng)、生活壓力與不良生活習(xí)慣皆可導(dǎo)致機體免疫力下降而引發(fā)各種疾病,尋求適宜的免疫調(diào)節(jié)劑來提高人體免疫能力,成為了人類社會的迫切需要。
傳統(tǒng)的藥物免疫調(diào)節(jié)劑對機體有一定的毒副作用,而免疫活性肽作為安全無副作用的免疫調(diào)節(jié)劑在食品、藥品與飼料等領(lǐng)域已顯出其獨特優(yōu)勢,免疫活性肽可通過促進免疫細胞增殖、提高巨噬細胞活性、增強自噬細胞(NK)機能、促進細胞因子生成[1,2]等來提高機體免疫力。
目前,國外學(xué)者[3-5]雖然已從多種動植物蛋白中獲得了氨基酸序列和結(jié)構(gòu)明確的肽段,并對其活性機理做了系統(tǒng)研究,但工業(yè)化制備的免疫活性肽并不多見;國內(nèi)學(xué)者[6-8]對免疫活性肽的研究主要集中在制備方法與分離純化工藝研究方面,具有明確氨基酸序列和結(jié)構(gòu)的免疫活性肽的報道較少。要對免疫活性肽進行生理活性、結(jié)構(gòu)及其構(gòu)效關(guān)系的研究,首先必須富集得到較高純度的活性肽,然后再深入研究其免疫活性機制。因此,研究高純度免疫活性肽的高效制備方法與免疫活性機制皆具重要意義。文章對免疫活性肽的酶法制備、分離純化和活性機制進行了綜述,可為肽類免疫調(diào)節(jié)劑的開發(fā)提供理論參考。
目前主流的制備免疫活性肽的方法主要有酶解法、微生物發(fā)酵法、化學(xué)合成法等,因生產(chǎn)條件溫和、安全性較高、價格低廉且可得到特定功能的活性肽等優(yōu)點,酶解法已成為從蛋白質(zhì)中釋放生物活性肽的最常用方法。
雖然食源性蛋白在生物體內(nèi)的消化過程中也可酶解成氨基酸與多肽類物質(zhì),但體內(nèi)酶解具有不完全性和不確定性,不能有目的地釋放出具有特定生物活性的肽段。近年來研究[9]發(fā)現(xiàn)蘊藏于蛋白質(zhì)多肽鏈中的肽類物質(zhì)的生理活性往往還強于其母體蛋白,若選擇適當(dāng)?shù)牡鞍酌阁w外水解蛋白,就有可能釋放出母體蛋白質(zhì)中有生理活性的肽段,按工業(yè)化規(guī)模制備出具特定生理功能的活性肽。
研究表明體外酶解有可能釋放出母體蛋白質(zhì)中有活性的肽段[6],母體蛋白的氨基酸組成[10]、亞基序列[11,12]與空間結(jié)構(gòu)[13]皆影響著肽的免疫活性。從大量免疫活性肽的研究[14,15]中發(fā)現(xiàn),免疫活性肽通常具有疏水性氨基酸,如Ala、Val、Met、Phe、Ile、Leu、Pro、Trp等。因此,對制備免疫活性肽的蛋白,有必要對其氨基酸組成與結(jié)構(gòu)進行分析。
目前,制備免疫活性肽的蛋白主要來源于動物與植物蛋白。以動物蛋白作為酶法制備免疫活性肽底物蛋白的研究報道較多,Jolles等[16]采用胰蛋白酶酶解乳蛋白,分離純化后獲得一個具有免疫活性的肽段,研究表明從α-乳白蛋白中獲得的免疫活性肽Tyr-Gly與Tyr-Gly-Gly能在體外有效促進人外周血細胞的增殖,增殖率分別為90%和35%,促進細胞代謝過程中蛋白合成(25%)[17]。Jairo Duarte等[18]采用太平洋無須鱈魚蛋白為原料,利用酵母代謝酶發(fā)酵鱈魚蛋白,探討發(fā)酵物的免疫活性,研究結(jié)果表明0.3 mg/m L發(fā)酵物連續(xù)灌喂小鼠7 d后能有效促進腹腔巨噬細胞的吞噬能力,Ig A+細胞數(shù)量在小腸固有層增加,IL-4、IL-6和IL-10細胞數(shù)量在相同位置有顯著性增加,此外,IFNγ和TNFaα促炎因子含量也得到增加,因此發(fā)酵物能增強小鼠機體的非特異性免疫能力。丁進峰等[19]采用響應(yīng)面優(yōu)化的木瓜蛋白酶酶解海蜇膠原蛋白工藝制備免疫活性肽,研究發(fā)現(xiàn)在1%加酶量、55℃,p H 6.5,酶解時間180 min的條件下,海蜇膠原蛋白肽能顯著促進小鼠免疫器官脾臟指數(shù)(4.857 mg/g)和胸腺指數(shù)(2.083 mg/g),并且能提高小鼠巨噬細胞的各項吞噬指標(biāo),如碳廓清指數(shù)0.033、吞噬指數(shù)6.645、伴刀球蛋白指數(shù)0.220。
以植物蛋白作為酶法制備免疫活性肽底物蛋白的研究報道涉及大米蛋白、大豆蛋白和小麥蛋白。Takahashi M等[20]采用胰蛋白酶水解可溶性大米蛋白,其水解物分離純化后獲得具有免疫調(diào)節(jié)功能的肽段為 Gly-Tyr-Pro-Met-Tyr-Pro-Leu-Pro-Arg,此九肽能引起豚鼠回腸收縮,具有提高白細胞吞噬功能,吞噬指數(shù)為1.5。陳季旺等[21]采用胰蛋白酶酶解米糠,凝膠過濾和RP—HPLC對酶解物進行分離純化,獲得 一 個 氨 基 酸 序 列 為 Asp-Gly-Ser-Val-Arg 的 阿 片 活性肽。
蛋白酶的種類決定了酶解的作用位點和酶解程度,從而可獲得具有不同氨基酸組成和分子量的肽段。
胰蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶與復(fù)合蛋白酶常用于制備免疫活性肽。房新平[22]、Hu Hou等[23]以淋巴細胞增殖活性為考察指標(biāo),采用胰蛋白酶分別對牛胎盤蛋白、阿拉斯加鱈魚進行酶解,皆獲得具有免疫活性功能的肽段。JingJiao Ma等[24]用堿性蛋白酶酶解乳清蛋白,以淋巴細胞增殖活性作為檢測指標(biāo),研究發(fā)現(xiàn)酶解物較母體蛋白能更顯著地促進細胞增殖,脾淋巴細胞增殖指數(shù)為1.71。馬儷珍等[25]以脾淋巴細胞增殖指數(shù)為指標(biāo),采用正交試驗考察了酶(木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶與堿性蛋白酶)、底物濃度、酶解時間和加酶量等因素的影響,研究發(fā)現(xiàn)采用木瓜蛋白酶在加酶量1 600 U/g,4 h,底物濃度1∶4.5(m∶m)條件下,能夠獲得較高免疫活性的多肽。
水解度(DH)可以反映蛋白質(zhì)被水解的程度,在相同條件下它與酶的種類及活力、底物種類有關(guān)。DH越高,蛋白質(zhì)水解得越徹底,獲得的分子量較小的肽段就越多,免疫活性肽的分子量大多小于2 k Da,但過高DH將產(chǎn)生較多的游離氨基酸??梢酝ㄟ^水解度來控制酶解反應(yīng)的進程,但僅用DH作為考察指標(biāo)是不完善的,通常應(yīng)結(jié)合生理活性指標(biāo)來考察制備免疫活性肽的工藝條件。
曾珍等[26]選用不同蛋白酶酶解兔骨粉,以DH和小鼠淋巴細胞增殖指數(shù)(SI)作為指標(biāo),篩選較適宜的蛋白酶,并優(yōu)化酶解工藝,研究結(jié)果表明,采用胰蛋白酶酶解兔骨粉,DH對SI有顯著影響,隨著DH不斷提高,SI值的變化趨勢是先增大后減小,可能是因為隨著DH提高,具有免疫活性的肽段被進一步降解了。Xiang Zhen Kong等[27]比較了 DH對3種大豆蛋白(InSP、SPI與SSP)水解物分子量的影響,相同條件下,InSP的DH較其它兩種蛋白高,獲得的水解物分子量最小為655.3 Da;以InSP為底物,考察不同條件對SI、腹腔巨噬細胞吞噬能力與DH的影響,研究發(fā)現(xiàn)在60℃獲得的酶解物的DH最高,此時SI值與吞噬能力也最強。
酶法制備的活性肽中,因蛋白酶酶切位點具有一定的隨機性和不確定性,導(dǎo)致酶解過程中產(chǎn)生了大量分子量大小相近但氨基酸序列不同的肽段。因此,要對酶法制備的活性肽進行生物活性、結(jié)構(gòu)及其構(gòu)效關(guān)系的研究,就必須對酶解產(chǎn)物進行分離純化,以富集得到較高純度的生物活性肽。
在生物活性肽常用的分離純化方法中,膜分離、等電點分離、離子交換樹脂分離和親和色譜分離已在工業(yè)化生產(chǎn)中得到了較廣泛的應(yīng)用,凝膠色譜、聚丙烯酰胺凝膠電泳、毛細管色譜、高壓液相色譜、質(zhì)譜等分離技術(shù)則在實驗室規(guī)模上得到了較普遍的使用。
鑒于目前國內(nèi)外研究[6]報道的免疫活性肽的相對分子量大多在2 k Da以下,因此,按分子量對肽進行分離純化是一種有效可行的方法,并且適用于工業(yè)化生產(chǎn)。膜分離技術(shù)基于膜本身孔徑的大小,比其孔徑大的物質(zhì)被截留在膜上,而直徑較孔徑小的物質(zhì)可以透過膜,依據(jù)此原理可對不同分子量大小的活性肽進行分離純化。
Bingjun Qian等[28]采用超濾膜對乳酸桿菌發(fā)酵液進行分離純化,研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)肽的分子量范圍為3~5 k Da時,其抗氧化活性比較高;繼續(xù)分離純化則可得到一個具有免疫活性的F6組分,此組分對小鼠脾淋巴細胞增殖指數(shù)為0.729。Milda Stuknyte等[29]采用超濾膜按分子量大小對牛乳乳酸菌發(fā)酵液進行分離純化,研究發(fā)現(xiàn)分子量小于3 k Da的分離組分能顯降低Caco-2細胞中NF-κB因子的活性,具有免疫調(diào)節(jié)的作用。
2.2.1 離子交換色譜分離 離子交換色譜的分離原理是基于活性肽帶有不同性質(zhì)電荷和不同電荷量,先使活性肽與帶有相反電荷的離子交換劑結(jié)合,再通過電荷強度不同的洗脫液與活性肽競爭結(jié)合,從而將帶有不同電荷量的物質(zhì)分離開。離子交換色譜因成本低、效率高和易再生等特點而成為蛋白質(zhì)和寡肽分離純化中最常用手段,在蛋白質(zhì)和寡肽純化方案中的使用率達到75%左右,工業(yè)化應(yīng)用前景良好。
房新平等[30]以體外淋巴細胞增殖活性為考察指標(biāo),采用DEAE Sepharose CL-6B陰離子交換色譜、凝膠色譜和反相高效液相色譜對牛胎盤蛋白胰蛋白酶酶解物進行分離純化,牛胎盤免疫活性肽含量達93%,并經(jīng)分離純化獲得氨基酸序列為 Tyr-X-Phe-Leu-Gly-Leu-Pro-Gly-X-Thr的免疫活性肽。張亞飛等[31]利用離子交換色譜法對小麥蛋白堿性蛋白酶酶解物進行分離,研究結(jié)果表明使巨噬細胞增殖效果較好的是p H 8與p H 10的洗脫組分。吳綿斌等[32]采用陰離子和陽離子兩種交換色譜對小牛胸腺酶解物進行分離純化得到的組分具有較高的肽含量。
2.2.2 大孔吸附樹脂色譜分離 大孔吸附樹脂的分離原理是基于吸附和分子篩,主要是通過分子間作用力如范德華引力或氫鍵等對被吸附的分子進行吸附,吸附劑表面的親水或疏水性質(zhì)決定了其具有不同的吸附特性;同時本身的多孔性結(jié)構(gòu)亦決定其具有一定的分子篩作用。因樹脂與被分離成分之間的吸附為物理吸附,被吸附的活性肽較易洗脫,因而具有成本低、效率高、穩(wěn)定性好和易再生等特點。
侯虎等[33]比較了6種大孔吸附樹脂對鱈魚免疫活性肽的分離效果,其中DA201-C樹脂對鱈魚免疫活性肽的吸附能力最強,其吸附率、脫鹽率與回收率分別為84.7%,98.1%,90.3%,脫鹽后的鱈魚免疫活性肽對小鼠脾淋巴細胞增殖能力有劑量依賴性。
2.2.3 凝膠色譜分離 凝膠色譜是利用凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),據(jù)分子大小、形狀差異進行分離的方法。凝膠色譜因具有設(shè)備簡單、操作方便、分離條件溫和、重復(fù)性好和樣品回收率高等特點而廣泛應(yīng)用于活性肽的分離純化,但因上樣量小,只適合在活性肽分離純化后期使用。紀(jì)麗娜[34]以小鼠脾淋巴細胞增殖指數(shù)為考察指標(biāo),采用葡聚糖凝膠色譜Sephadex G-25與Sephadex G-15對分子量范圍為5~10 k Da的金槍魚頭酶解物進行分離純化,獲得3個洗脫峰,研究結(jié)果顯示TIP3C組分主要由200~800 Da的肽構(gòu)成,低劑量的金槍魚頭酶解物即可顯著促進細胞增殖和增強巨噬細胞吞噬能力。Assad Sila等[35]聯(lián)用凝膠過濾色譜Sephadex G-25、反相高效液相色譜(RP—HPLC)與電噴霧質(zhì)譜(ESI)對堿性蛋白酶魚蛋白酶解物進行分離純化,在一個活性較高的組分中檢測出具有 抗 菌 活 性 的 3 條 肽 Ala-Ala-Ala-Leu、Ala-Ala-Gly-Gly-Val和 Ala-Ala-Val-Lys-Met。
Hu Hou等[24]以淋巴細胞增殖活性為指標(biāo),采用離子交換色譜、凝膠過濾色譜與RP—HPLC對阿拉斯加鱈魚胰蛋白酶酶解物進行分離純化,獲得 Asn-Gly-Met-Thr-Tyr、Asn-Gly-Leu-Ala-Pro與 Trp-Thr 3條肽,其淋巴細胞增殖活性分別為35.92%,32.96%,31.35%。
電泳法分離蛋白質(zhì)、肽、氨基酸等兩性物質(zhì)能得到較純的組分,但處理量較小,不適用于工業(yè)化生產(chǎn)。常規(guī)Tris-Glycine-SDS-PAGE對10 kDa以下的小分子肽分辨率低,并且易出現(xiàn)擴散丟失和無著色帶等現(xiàn)象。Schagger等[36]用Tricine代替?zhèn)鹘y(tǒng)甘氨酸,在常規(guī)SDS—PAGE分離膠與濃縮膠基礎(chǔ)上增加一層間隙凝膠,并減小電流、延長電泳時間,實現(xiàn)了對5~20 k Da肽段的分離,并能觀察到不太清晰的1 kDa肽段的色帶。曹佐武[37]采用5%濃度的聚丙烯酰胺凝膠,并在分離膠中加入尿素,發(fā)現(xiàn)1 kDa的小分子肽段的帶型也能清晰顯示。
免疫系統(tǒng)由非特異性免疫與特異性免疫組成,非特異性免疫是多細胞生物經(jīng)過進化形成的防御系統(tǒng),它由皮膚黏膜組織、巨噬細胞、NK細胞等組成,是機體抵抗和消滅抗原的第一戰(zhàn)線;特異性免疫是隨著機體的個體發(fā)育,與抗原接觸后獲得的防御功能,它包含體液免疫和細胞免疫。免疫活性肽可以促進淋巴細胞的增殖、提高巨噬細胞活性、增強自噬細胞(NK)機能、促進細胞因子生成[2,38]等,通過這些功能來鞏固機體防御能力、提高機體免疫力。
3.1.1 免疫活性肽與巨噬細胞 巨噬細胞是非特異性免疫的重要組成部分,巨噬細胞存在于各種器官和組織中,它能無特異性的識別抗原,釋放出大量的細胞因子IL-1、IL-6、IL-8與TNF-α等,激發(fā)免疫反應(yīng)。同時巨噬細胞能活化增殖、吞噬并消化抗原,也能將抗原傳遞給T淋巴細胞與B淋巴細胞,進入細胞免疫階段。
龔吉軍等[39]采用環(huán)磷酰胺構(gòu)建小鼠免疫力低下模型,研究了油茶粕多肽對小鼠免疫能力的影響,發(fā)現(xiàn)油茶粕多肽能增強小鼠巨噬細胞的吞噬能力,減輕小鼠耳腫脹度,提高小鼠的免疫功能。Berthaou等[40]用合成的α-乳白蛋白免疫活性肽Gly-Leu-Leu研究其對小鼠的體液免疫活性,發(fā)現(xiàn)此3肽能顯著促進巨噬細胞吞噬綿羊紅細胞的能力,并能保護小鼠抵抗肺炎克雷伯氏菌的感染。Gattegno等[41]還發(fā)現(xiàn)此3肽能劑量依賴性地促進人單核巨噬細胞與衰老的紅細胞的結(jié)合,并增強此類巨噬細胞的吞噬能力。
3.1.2 免疫活性肽對自然殺傷NK細胞的作用 NK細胞是人體體液免疫的第一道防線,屬于非特異性免疫的范疇,它能分泌胞毒因子、腫瘤促死因子與穿孔素等,選擇性地殺死靶細胞。NK細胞較T淋巴細胞、B淋巴細胞來說其特異性識別功能是較弱的。通??蓮腘K細胞生物活性變化來考察機體免疫功能。周涌等[42]采用蛙皮生物活性肽作用于小鼠,通過NK細胞增殖試驗、變態(tài)反應(yīng)和碳廓清試驗考察哺乳動物細胞的免疫功能,發(fā)現(xiàn)蛙皮活性肽可明顯促進NK細胞的免疫活性,NK細胞活性為77.4%。傅煒昕等[43]采用凝膠過濾層析與陰離子交換色譜分離純化低分子地龍肽,并考察分離組分對自然殺傷NK細胞活性的影響,發(fā)現(xiàn)分子量在13 kDa以下的組分能明顯提高NK細胞活性和殺傷率。
3.2.1 免疫活性肽與T細胞 T細胞表面有能識別“非己”的抗原決定簇,這些抗原決定簇由糖蛋白組成,具有特異性的識別功能。T細胞的主要功能是介導(dǎo)細胞免疫,T細胞能消滅一些被感染的細胞,提高其他細胞的免疫作用與釋放記憶細胞,抵御抗原的再次入侵。張智宇等[44]采用胰蛋白酶酶解豆粕,考察酶解工藝參數(shù)與小鼠T淋巴細胞增殖指數(shù)之間的關(guān)系,研究發(fā)現(xiàn)在一定的劑量關(guān)系內(nèi),豆粕酶解物對小鼠T淋巴細胞有顯著增殖作用,刺激指數(shù)為1.189 4。Javier Rodríguez-Carrio等[45]采用膜過濾對β-乳球蛋白酶解物進行分離純化,研究發(fā)現(xiàn)富集大量酸性氨基酸的組分能誘導(dǎo)Th1應(yīng)答,分子量較小的組分能刺激單核細胞分泌TNF-α,另一個分子量較小的組分還能引導(dǎo)TGFβ分泌與調(diào)控T細胞分化,可能是由于從β-乳球蛋白獲得的段能削弱過敏與炎癥反應(yīng)。
3.2.2 免疫活性肽與B細胞 B淋巴細胞是從骨髓干細胞分化而來的,屬于體液免疫細胞,主要分布在淋巴結(jié)和脾臟中。當(dāng)B細胞受到外界刺激時,能夠分化成為漿細胞,漿細胞可以產(chǎn)生抗體,參與體液免疫;也可以分化為記憶細胞。劉賓等[46]用計算機推測大豆蛋白酸性多肽具有刺激B細胞抗原表位的結(jié)構(gòu),并能引起B(yǎng)細胞產(chǎn)生特異性免疫,從而激活體液免疫。方廖瓊[47]研究了羊胎盤免疫調(diào)節(jié)肽GPIF對體液免疫的影響,發(fā)現(xiàn)GPIF能顯著促進B細胞增殖與抗體分泌,提高脾淋巴B細胞與骨髓B細胞數(shù)量,促進骨髓干細胞向B淋巴細胞分化,表明GPIF具有促進小鼠體液免疫的能力;GPIF還能促進60Co-γ射線免疫損傷小鼠免疫功能的恢復(fù)。
免疫活性肽的主流制備方法為酶解法,因蛋白酶酶切位點具有一定的隨機性和不確定性,導(dǎo)致酶解過程中產(chǎn)生大量分子量大小相近但氨基酸序列不同的肽段。酶解產(chǎn)物是由蛋白質(zhì)、肽和氨基酸混合的復(fù)雜體系,這大大增加了工業(yè)化生產(chǎn)和實驗室分離純化免疫活性肽的成本,選擇高效率、低成本的分離純化方法已成為酶法制備的免疫活性肽大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵所在。
免疫涉及到機體的體液、組織和器官,且各免疫細胞之間還將直接或間接的依靠多種信號分子進行信息傳遞,因而導(dǎo)致不同免疫活性肽作用的方式也各不相同,這使得免疫活性肽作用機制的研究變得更為復(fù)雜,目前還沒有研究開發(fā)出簡便有效的免疫活性評價方法。因此,進一步探索免疫活性肽的作用機制,揭示免疫活性肽功能與活性之間的關(guān)系,可為免疫活性肽類功能性食品的研究開發(fā)提供重要的理論依據(jù)。
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