老年性上瞼下垂患者眼輪匝肌組織中Elastin、MMP-9、MMP-12的表達(dá)變化及意義

龐潤暉，白 萍，苗 杰，王 娟，張宏斌，段國琴

(1邢臺市眼科醫(yī)院，河北省眼病治療中心，河北省眼科學(xué)重點實驗室，河北邢臺054001; 2邢臺市人民醫(yī)院;3寧晉縣中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院)

老年性上瞼下垂是常見的老年性眼瞼退行性病變，臨床表現(xiàn)為上瞼皮膚下垂，遮蓋瞳孔、額部皺紋加重、眉毛上移、上瞼皮膚牽拉延長等［1，2］。關(guān)于老年性上瞼下垂的形成機理，考慮可能為皮膚松馳、彈性減退、提上瞼肌乏力及Muller氏肌漸趨萎縮乏力綜合因素所致［3］。國外研究［4］表明，在上瞼折疊區(qū)，Muller氏肌鍵、提上瞼肌腱膜、瞼板前眼輪匝肌和聯(lián)合筋膜內(nèi)有大量的彈性纖維表達(dá)，而彈性纖維是由彈性蛋白(Elastin)構(gòu)成，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9、MMP-12能有效降解彈性蛋白和細(xì)胞外基質(zhì)。2011年6月～2013年6月，我們檢測了30例老年性上瞼下垂眼輪匝肌組織中Elastin、MMP-9、MMP-12，觀察其表達(dá)變化，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇我院收治的老年性上瞼下垂患者30例(觀察組)，男11例，女19例;年齡50～72歲，平均61歲;提上瞼肌肌力0～4 mm 5例，4～8 mm 12例，8～12 mm 13例;另選30例單瞼行重瞼手術(shù)患者作為對照組，男5例，女25例;年齡18～35歲，平均22歲，提上瞼肌肌力正常。兩組一般資料無統(tǒng)計學(xué)差異，具有可比性。

1.2 Elastin、MMP-9、MMP-12的檢測方法 將術(shù)中切除的瞼板前眼輪匝肌組織用10%甲醛溶液固定，經(jīng)常規(guī)組織脫水、透明石蠟浸泡與包埋備用。4μm厚石蠟切片，60℃烘片30 min，二甲苯脫蠟15 min ×3次，梯度乙醇水化。切片于3%H2O2溶液中浸泡30 min，以滅活內(nèi)源性過氧化物酶。后置于乘有枸椽酸鹽抗原修復(fù)液的電熱式壓力蒸汽滅菌器中，高壓修復(fù)20 min，室溫下冷卻，PBS洗5 min×3次。滴加10%正常山羊血清，濕盒內(nèi)作用30 min，中和非特異性抗原。再滴加經(jīng)預(yù)試驗確定的濃度(1∶200)兔抗人Elastin、MMP-9、MMP-12單克隆抗體(武漢博士德公司)，置濕盒內(nèi)作用60 min后4℃過夜，PBS緩沖液洗5 min×3次;滴加生物素化羊抗兔lgG二抗(1∶100)作用30 min，PBS緩沖液洗5 min×3次。滴加新鮮配置的DAB顯色液，顯色5～15 min，流水洗滌。蘇木素復(fù)染，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。用已知陽性切片作為陽性對照，PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照。Elastin、MMP-9、MMP-12在眼輪匝肌的染色均為胞質(zhì)著色，以棕黃色或淡黃色定性為陽性。用MPIAS-1000真彩色病理圖像分析系統(tǒng)(北京航空航天大學(xué)圖像中心)測定1 000個細(xì)胞中陽性細(xì)胞數(shù)，取其平均值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。采用t檢驗。隨機統(tǒng)計1 000個肌纖維細(xì)胞中免疫組化染色陽性細(xì)胞總數(shù)，實驗數(shù)據(jù)經(jīng)Kolmogorov-Smirnov檢驗證實呈正態(tài)分布，均以±s表示，各組樣本均數(shù)經(jīng)Levene檢驗方差齊性。以P≤0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

觀察組Elastin、MMP-9、MMP-12陽性細(xì)胞數(shù)分別為(210.12±46.76)、(345.12±58.23)、(365.54 ±30.28)個，對照組分別為(460.34±5.21)、(153.32±21.45)、(126.27±16.31)個，兩組比較P均＜0.05。

3 討論

隨著我國老齡人口的增加，老年性上瞼下垂的發(fā)病呈逐漸上升趨勢，據(jù)統(tǒng)計其發(fā)病率約占老年人口的11.5%，患者出現(xiàn)瞼裂變形、變窄，向前注視比較困難，常出現(xiàn)仰視征象，給老年人帶來許多不便［5］。關(guān)于老年性上瞼下垂的發(fā)病機理，目前觀點不一［6，7］。有人認(rèn)為，由于年齡的增長，部分老年人的提上瞼肌肌肉供血不足，肌纖維漸趨萎縮，力量降低，從而出現(xiàn)了上瞼下垂;也有人認(rèn)為，老年性上瞼下垂是由于皮膚松馳、彈性減退及Muller肌漸趨萎縮乏力綜合因素所致。劉瑞華等［8］觀察了20例老年性上瞼下垂患者眼瞼皮膚，發(fā)現(xiàn)皮膚角質(zhì)層變薄、扁平，基底細(xì)胞排列散亂、大小不一，眼瞼皮膚膠原纖維數(shù)量和質(zhì)量均下降。

Elastin是一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，主要由成纖維細(xì)胞產(chǎn)生，在體內(nèi)與微原纖維結(jié)合形成彈性纖維。彈性蛋白的下降代表彈性纖維的減少，而體內(nèi)有多種物質(zhì)能夠分解彈性蛋白，如MMP和絲氨酸蛋白酶。MMP-9、MMP-12均是基質(zhì)金屬蛋白酶家族中的新成員，其能有效降解彈性蛋白和細(xì)胞外基質(zhì)，而且是對抗彈力纖維的最活躍的MMP［9，10］。這三種因子均可在眼瞼皮膚及眼輪匝肌組織表達(dá)，根據(jù)它們之間的不平衡表達(dá)可推測出眼瞼松弛的發(fā)病機理［11］。本研究顯示，與對照組比較，觀察組Elastin陽性細(xì)胞數(shù)減少，MMP-9、MMP-12陽性細(xì)胞數(shù)增加，推測老年性上瞼下垂肌肉松弛的發(fā)病機理與彈性蛋白含量下降有關(guān)，彈性蛋白的下降導(dǎo)致彈性纖維含量的減少，而彈性蛋白降解酶的增加又進(jìn)一步促進(jìn)彈性蛋白的降解。這與以往對皮膚松弛的研究結(jié)果是一致的，皮膚彈性蛋白的含量隨著年齡的增長、紫外線的照射，成纖維細(xì)胞逐漸減少，膠原纖維和彈力纖維逐漸排列紊亂、變性、扭曲，引起皺紋、松弛及下垂等皮膚衰老表現(xiàn)［12，13］。從我們的實驗研究可以看出，這些改變不僅是皮膚衰老的結(jié)果，也將進(jìn)一步促進(jìn)眼輪匝肌的松弛，甚至提上瞼肌的松弛。

近十余年不斷有細(xì)胞抗皮膚衰老報道，如注射成纖維細(xì)胞或移植表皮干細(xì)胞等［14，15］;但因其維持時間短或取材困難等而受限。金屬蛋白酶組織抑制物(TIMP)是MMP的抑制劑，可以抑制其對膠原的降解作用，若能在此環(huán)節(jié)加以干預(yù)調(diào)節(jié)，抑制MMP的過度表達(dá)，或者利用MMP-TIMP之間的動態(tài)平衡解決衰老的問題，可在一定程度上抑制或者延緩眼瞼皮膚及眼輪匝肌的松弛進(jìn)程。盡管老年性上瞼下垂的手術(shù)方法已經(jīng)成熟，但因各個地方的醫(yī)生水平良莠不一，相當(dāng)一部分老年人對手術(shù)有恐懼的心理，根據(jù)我們的研究結(jié)果，如果能研制出對抗彈性蛋白下降或提高M(jìn)MP水平的藥物進(jìn)行皮膚層及眼輪匝肌層的注射治療，從基礎(chǔ)學(xué)方面延緩皮膚及肌肉的老年性改變，相信會給廣大的老年患者帶來福音。

總之，老年性上瞼下垂眼輪匝肌組織Elastin表達(dá)下降，MMP-9、MMP-12表達(dá)上升，其發(fā)病機理可能與上述指標(biāo)變化有關(guān)。

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