舒芬太尼后處理對缺血/再灌注大鼠心肌線粒體Cx43蛋白表達的影響

徐紅梅，褚海辰，牛澤軍，李紅梅

(青島大學附屬醫(yī)院，山東青島266003)

研究［1，2］發(fā)現(xiàn)，缺血或藥物性干預可減少心肌缺血/再灌注損傷。目前研究［3～5］證實，嗎啡、芬太尼、瑞芬太尼等阿片類藥物具有藥物后處理作用，能保護缺血/再灌注損傷的心肌。舒芬太尼是一種人工合成的阿片類鎮(zhèn)痛藥物，最近，國內(nèi)外關于舒芬太尼預處理及缺血后處理對心肌缺血/再灌注損傷的保護作用研究較多，但其保護機制仍不明確?？p隙連接蛋白43(Cx43)是細胞連接通訊中的重要物質(zhì)。研究［6，7］發(fā)現(xiàn)，心肌線粒體 Cx43對維持線粒體穩(wěn)定有重要作用，其通過調(diào)節(jié)活性氧自由基的生存觸發(fā)對心臟的保護作用，其數(shù)量和磷酸化水平與缺血處理對心臟的保護作用相關。2012年7月，我們觀察了舒芬太尼后處理對缺血/再灌注大鼠心肌線粒體Cx43蛋白表達的影響?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康成年SD雄性大鼠60只，清潔級，體質(zhì)量250～300 g，由青島大學醫(yī)學院生理教研室提供。

1.2 藥品與試劑 NaHS、氯化三苯基四氮唑(TTC，Sigma公司，美國);心肌線粒體提取試劑盒(北京寶賽生物技術有限公司);兔抗磷酸化Cx43(Ser368)抗體(#3511，Cell Signaling)，兔抗總 Cx43抗體(71-0700，Invitrogen);堿性磷酸酶標記的山羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物公司);SDS-PAGE凝膠配試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(碧云天，中國)，BCIP/NBT堿性磷酸酶顯色試劑盒(S3771，Promega)。

1.3 心肌缺血/再灌注損傷模型建立方法 以烏拉坦5 mL/kg的劑量腹腔注射于大鼠進行麻醉，將心電圖電極插入大鼠四肢皮下，并記錄正常Ⅱ?qū)?lián)心電圖。將大鼠氣管切開，連接動物呼吸機，行機械通氣，呼吸頻率60次/min，潮氣量18 mL/kg。沿大鼠左側(cè)胸壁第3、4肋間行縱向切口開胸，并逐層鈍性分離打開胸腔，然后破開胸膜及心包膜，充分暴露心臟，并于左心耳下方1～2 mm處即冠狀動脈左前降支(LAD)處穿行7-0縫線，在無創(chuàng)縫合線末端通過一塑料管，通過向下推動塑料管壓向心室壁阻斷冠狀動脈血流，放松無創(chuàng)縫合線造成再灌注。LAD結(jié)扎成功標志:結(jié)扎處以下心肌組織發(fā)紺，活動減弱，心電圖顯示ST段明顯抬高;再灌注成功標志:結(jié)扎線松開后，心肌局部反應性充血，ST段下降。

1.4 實驗分組及舒芬太尼后處理方法 將60只大鼠隨機分為4組各15只，假手術組(A組)只穿線，不結(jié)扎;缺血/再灌注組(B組)結(jié)扎LAD，缺血30 min后，再灌注120 min;缺血后處理組(C組)結(jié)扎LAD，缺血30 min末行缺血30 s，再灌注30 s，重復3次，再灌注120 min;舒芬太尼后處理組(D組)結(jié)扎LAD缺血30 min，再灌注前5 min，靜滴舒芬太尼0.1 μg/kg，再灌注120 min。再灌注末取大鼠心臟，置于-80℃冰箱冷凍保存。

1.5 心肌梗死面積測定方法 將大鼠的心臟橫切2 mm薄片4～6片，放入1%氯化三苯基四氮唑(TTC)磷酸鹽緩沖液中(pH=7.4)，37℃ 水浴箱中閉光孵育10 min，存活心肌呈磚紅色，梗死心肌呈灰白色。染色對比明顯后拍照，Adobe photoshop version7.0軟件計算心肌梗死面積百分比(MIS%)，MIS%=(心肌梗死面積之和/心肌總面積之和)×100%。

1.6 心肌線粒體總 Cx43(tCx43)和磷酸化 Cx43(pCx43)測定方法 取大鼠左心室100 mg，0～4℃下快速剪碎心肌，玻璃勻漿器中勻漿10次。采用北京寶賽公司的心肌線粒體提取試劑盒分離線粒體，將勻漿液12 000 g于4℃條件下離心10 min，取上清，12 000 g于4℃條件下離心10 min，棄上清，沉淀為粗制線粒體。以上操作均在4℃進行，1 h內(nèi)完成。取線粒體沉淀1滴涂片，滴加1%詹姆斯綠B染色20 min，覆上蓋玻片，鏡檢，線粒體呈藍綠色，小棒狀或啞鈴狀。Folin酚法測蛋白濃度，配平煮沸，取等量心肌樣本進行SDS-PAGE電泳，分離后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉 2 h，加入一抗(pCx43，1∶1 000 稀釋;tCx43，1∶500稀釋)，4℃孵育過夜，TBST室溫漂洗后加入二抗(堿性磷酸酶標記的山羊抗兔IgG，1∶500稀釋)，室溫振蕩孵育2 h，漂洗后BCIP/NBT堿性磷酸酶顯色試劑盒顯色，掃描條帶，將圖像轉(zhuǎn)換成數(shù)字圖像，用Image J圖像分析軟件對蛋白條帶進行半定量分析。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

A、B、C、D 組的 MIS%分別為 0.8% ±2.4%、44.6% ±5.3%、37.4% ±3.7%、26.5% ±4.2%，D組與B、C組相比，P均＜0.05。以B組心肌線粒體tCx43和pCx43電泳條帶灰度為基準，A、B、C、D組心肌線粒體 tCx43 灰度比分別為2.3、1.0、1.3、1.8;pCx43 灰度比分別為2.4、1.0、1.3、1.6。B 組有少量tCx43和pCx43蛋白表達;D組tCx43和pCx43蛋白表達明顯高于B、C組(P均＜0.05)。

3 討論

心肌缺血/再灌注是指在較長時間心肌缺血的基礎上，恢復血流灌注，即復灌后缺血的器官和組織損傷并不減輕，反而加重甚至發(fā)生不可逆行損傷的現(xiàn)象［8］。缺血預處理是臨床常用的心肌內(nèi)源性保護方法［9］，Schultz等［10］發(fā)現(xiàn)，給予麻醉大鼠納洛酮后缺血預處理的保護作用取消，推測阿片類受體可能參與心肌缺血/再灌注損傷保護作用。由于心肌缺血/再灌注的發(fā)生在臨床上難以預測，所以缺血后處理比缺血預處理在臨床上更為常用。而藥物后處理可以避免缺血后處理所造成的血管機械性損傷，因此，藥物預處理越來越受到重視。阿片類藥物作為一種麻醉藥物廣泛用于臨床，其對心肌的保護作用有不少報道。舒芬太尼是芬太尼N-4位取代的衍生物，作為一種新型的高選擇性μ阿片受體激動劑，具有半衰期短，清除率高，鎮(zhèn)痛強度大，輕易穿透細胞膜和血腦屏障，心血管功能穩(wěn)定，反復給藥后蓄積作用少的特點。在麻醉誘導、氣管插管和恢復期比嗎啡、芬太尼、哌替啶等有更好的應用條件［11，12］。研究［13］發(fā)現(xiàn)，舒芬太尼可通過PI3/Akt信號通路發(fā)揮對大鼠心肌缺血/再灌注心肌的保護作用。

Cx43是構(gòu)成哺乳動物心肌縫隙連接通道的主要蛋白，通過由其組成的非連接性半通道在細胞容積的調(diào)控及胞質(zhì)釋放ATP和代謝產(chǎn)物中發(fā)揮作用，在心肌缺血/再灌注時極易被降解［6］。生理條件下，心肌Cx43多處于磷酸化狀態(tài)，即使缺血前幾分鐘，Cx43仍維持其磷酸化狀態(tài)不變，但隨缺血時間延長，Cx43發(fā)生脫磷酸化和電失偶聯(lián)。研究［14］表明，在鼠類乳腺上皮細胞中可通過PI3/Akt信號通路調(diào)節(jié)Cx43表達。本研究發(fā)現(xiàn)，B組心肌梗死面積增加，線粒體Cx43總量和磷酸化量減少，D組心肌梗死面積減少，線粒體Cx43總量和磷酸化量增加，可見線粒體Cx43在舒芬太尼后處理減輕大鼠心肌缺血/再灌注損傷中起重要作用。這與Gorbe等［15］研究發(fā)現(xiàn)細胞質(zhì)和線粒體中Cx43的相應減少，去磷酸化的Cx43相應增多，能明顯增加缺血/再灌注心肌損傷的結(jié)果一致。

綜上所述，舒芬太尼可能通過增加缺血/再灌注大鼠心肌線粒體Cx43蛋白表達發(fā)揮心肌保護作用。

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