莽草酸的制備及其生物學(xué)功能研究進(jìn)展

何邵平，禹琪芳，段杰林，肖定福，賀建華*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙 410128；2.中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，長沙 410125）

莽草酸又名毒八角酸，是一種具有天然生物活性的含手性碳化合物[1]。是自然界中存在的一種重要有機(jī)酸，也是植物代謝過程的中間產(chǎn)物，在木蘭科八角屬植物茴香（Illicium verum）的果實中含量較高。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，莽草酸及其衍生物具有抗菌、抗腫瘤、抗血栓及腦缺血、抗炎、抗病毒等多種生物活性。目前我國在臨床上將該化合物鑒定為合成治療H5N1亞型高致病性禽流感唯一有效藥物“達(dá)菲”的關(guān)鍵中間體，這使得莽草酸的開發(fā)價值大幅提高[2]。對于禽流感發(fā)生頻率的增多，其作為合成抗禽流感藥“達(dá)菲”的主要原料，具有廣闊的研究前景。本文結(jié)合國內(nèi)外研究進(jìn)展從莽草酸的來源、提取分離純化工藝、制備途徑、生物學(xué)功能等進(jìn)行詳細(xì)闡述。

1 莽草酸的理化性質(zhì)及主要植物性來源

莽草酸是一種白色粉末晶體，分子式C7H10O5，相對分子質(zhì)量為174.15，化學(xué)結(jié)構(gòu)為3，4，5-三羥基-1-環(huán)己烯-1-羧酸，熔點為185～187℃，難溶于氯仿、苯和石油醚等有機(jī)溶劑，易溶于水，在水中的溶解度為180 g·L-1。由于分子結(jié)構(gòu)中含3個羥基，一個羧基，一個雙鍵，因而莽草酸可以成酯，也可以成鹽。莽草酸是一種重要的生物代謝中間體，可以作為許多生物堿、芳香氨基酸以及吲哚衍生物等合成原料[3]。莽草酸是由Eykman在1885年首次從八角科植物的干燥成熟果實中提取得到，隨后Sieb和Zucc將其命名為Shikimic acid[4]。研究發(fā)現(xiàn)，莽草酸廣泛存在于各種植物組織中，如銀杏科植物銀杏葉和內(nèi)皮、桃金娘科植物檸檬桉的樹葉、使君子科植物訶子的果實和樹葉、傘形科植物茴香的莖和葉、桑科無花果的果實、八角茴香的果實。其中以八角茴香中莽草酸的含量最高（約10%）[5]。

2 莽草酸的制備方法

2.1 從植物中提取

莽草酸是高等植物經(jīng)莽草酸代謝途徑的產(chǎn)物，因而很多高等植物都能生產(chǎn)莽草酸，只是量不同而已，能提取分離莽草酸的植物有八角茴香、金絲桃、毒箭木、小飯團(tuán)、山海螺、楓香、雞蛋參、馬尾松松針等[6]。根據(jù)莽草酸的溶解性質(zhì)以及現(xiàn)代提取分離新技術(shù)大量的運用，建立了許多莽草酸的提取方法包括常規(guī)溶劑提取、超聲波輔助提取、微波輔助萃取、膜分離法提取、分子印跡技術(shù)提取等。

謝濟(jì)遠(yuǎn)等采用水蒸汽蒸餾法提取了濕地松松針中揮發(fā)油和莽草酸，用高效液相色譜儀測定提取物中莽草酸的含量，通過單因素實驗和正交實驗，確定水蒸汽蒸餾法提取莽草酸最佳工藝條件是：松針粒度為40目、料液比為1∶12、浸泡時間為6 h、提取時間為4 h，莽草酸的得率（提取液中莽草酸質(zhì)量/八角茴香質(zhì)量）為1.32%[7]。林於等通過采用水提醇沉、大孔吸附樹脂脫色、離子交換樹脂分離等方法，從馬尾松中分離純化莽草酸，所得莽草酸含量高達(dá)96%，得率為0.78%[8]。Xie等用乙醇浸提濕地松松針中的莽草酸，研究不同水平乙醇濃度、料液比、浸提溫度、提取時間及浸泡時間對莽草酸提取率的影響，通過單因素和正交實驗，確定影響莽草酸提取率的因素主次順序是：乙醇濃度＞提取溫度＞料液比＞提取時間；乙醇浸提法提取莽草酸的最佳工藝為：乙醇濃度為60%，提取溫度為75℃，料液比為1∶25，提取時間為2.5 h，在該條件下，莽草酸的得率為1.49%[9]。逯家輝等也通過采用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波提取方法，從八角茴香中提取莽草酸的得率驗證值為8.21%，與預(yù)測值的相對誤差為0.45%[10]。同樣劉潔等利用超聲波方法，通過單因素試驗采用二次回歸通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計試驗方法建立數(shù)學(xué)模型，提取率（提取液中莽草酸質(zhì)量/八角茴香中莽草酸總質(zhì)量）達(dá)99.3%，滿足生產(chǎn)需要，并得出了提取莽草酸的優(yōu)化工藝為：時間46min，溫度83℃，液料比12∶1，粒度60目，重復(fù)兩次[11]。林海祿等也利用超聲波提取法與傳統(tǒng)提取作了比較，超聲提取40min，得率為2.89%；熱回流提取180min，得率為2.38%[12]。姚菁華等為優(yōu)化八角茴香中莽草酸的微波提取工藝研究各自變量及其交互作用對莽草酸提取的影響，采用響應(yīng)面分析軟件，模擬得到二次多項式回歸方程的預(yù)測模型，在其條件下，平均得率為3.03%[13]。林海祿等與丁雷濤等也都采用微波輔助分別從八角茴香和松針中提取了預(yù)期量的莽草酸[14-15]。此外，周媛媛等利用分子印跡技術(shù)（莽草酸模板分子∶丙烯酰胺功能單體∶乙二醇二甲基丙烯酸酯交聯(lián)劑=1∶8∶8），以偶氮二異丁腈為引發(fā)劑，合成莽草酸分子印跡聚合物（MIPs）其效果最佳[16]。根據(jù)莽草酸吸附等溫線，印跡效果非常明顯，MIP吸附容量是非分子印跡（NIP）3.76倍，可用于提取莽草酸。因此，提取莽草酸時，傳統(tǒng)的分離方法具有提取效果差、收率低等缺點。而超聲波提取具有收率較高、生產(chǎn)周期短，有效成分基本不被破壞等優(yōu)點；微波輔助提取法具有設(shè)備簡單、操作時間短、適用范圍廣、重現(xiàn)性好、溶劑消耗量少，且提取率較高、速度快、污染小等一系列優(yōu)點，對提取天然產(chǎn)物有效成分具有廣闊應(yīng)用前景；MIPs由于具有顯著的選擇性吸附能力，現(xiàn)被廣泛的應(yīng)用于各種分離過程中，因此，采用分子印跡技術(shù)研制莽草酸特異性選擇性分子印跡聚合物有重要的應(yīng)用價值。

2.2 化學(xué)合成

20世紀(jì)以前，莽草酸及其衍生物的合成方法主要有：碳?xì)浠衔镛D(zhuǎn)化法、奎寧酸轉(zhuǎn)化法、Diels.Alder反應(yīng)和逆Diels.Alder反應(yīng)[17]。碳?xì)浠衔镛D(zhuǎn)化法主要以手性碳結(jié)構(gòu)單元（1R，5R，7S）-7-[（二甲基叔丁基硅氧基）甲基]-6，8-二氧二環(huán)[3.2.1]辛-3-烯-2-酮和乙烯溴化鎂經(jīng)過一系列氧化還原反應(yīng)，最后水解生成莽草酸，莽草酸總收率可達(dá)7.8%?？鼘幩徂D(zhuǎn)化法則是以奎寧酸衍生物和2，2-二甲基丙烷作為原料合成，總收率達(dá)62%[5]。而逆Diels.Alder合成法以環(huán)戊二烯和苯醌為原料，初始合成莽草酸，總收率最高可達(dá)41%（碳源為基礎(chǔ)）。之后在許多學(xué)者相繼發(fā)表有關(guān)非手性有機(jī)原料代替莽草酸來合成達(dá)菲的方法[18-19]。

2.3 微生物代謝合成

目前，利用工程菌發(fā)酵生產(chǎn)莽草酸的研究多是采用基因工程改造的大腸埃希菌。通過中止莽草酸循環(huán)中產(chǎn)生莽草酸下游途徑，從而達(dá)到莽草酸積累的目的。大腸埃希菌具有兩個莽草酸激酶，分別為aroK編碼的莽草酸激酶Ⅰ和aroL編碼的莽草酸激酶Ⅱ。試驗發(fā)現(xiàn)，aroL編碼的莽草酸激酶Ⅰ的Km比莽草酸激酶Ⅱ的大約100倍。只有當(dāng)?shù)孜锩Р菟徇_(dá)到一定濃度后，激酶Ⅰ才具有生物活性，因此，在大腸埃希菌中催化此反應(yīng)中激酶Ⅱ起主要作用[20]。Fu等通過敲除aroL基因，其突變株能夠有效積累莽草酸提高產(chǎn)量157%[21]。李明明等利用Red-Xer重組系統(tǒng)連續(xù)刪除了野生型大腸桿菌CICIM B0013的莽草酸激酶基因（aroL、aroK），葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（PTS）的關(guān)鍵組分EIICBglc的編碼基因（ptsG）以及奎寧酸/莽草酸脫氫酶基因（ydiB），發(fā)酵結(jié)果表明，4個基因缺失的大腸桿菌代謝工程菌生產(chǎn)莽草酸的能力比原始菌提高了90多倍[22]。汪華等與陳凱等也進(jìn)行了相關(guān)報道，得到了類似的結(jié)論[23-24]。

2.4 其他合成途徑

Bresnahan等研究表明，除草劑草甘膦能干擾莽草酸的正常代謝途徑，主要是由于草甘膦被小麥吸收后被轉(zhuǎn)移到植物的活性生長區(qū)內(nèi)，通過抑制5-烯醇丙酮酸-莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS）合成，而發(fā)揮作用[25]。有研究表明，EPSPS是色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等蛋白質(zhì)合成的關(guān)鍵酶，由于EPSPS的合成被抑制，因而導(dǎo)致莽草酸的大量積累。

不同途徑獲得的莽草酸各有不同的特點。從植物中提取莽草酸是目前主要來源之一，但是主要提取植物八角茴香受到地域限制，生產(chǎn)資源有限，不是今后發(fā)展主要渠道。因此，合適的化學(xué)合成途徑和生物代謝合成途徑將成為發(fā)展重點。另外，在以往的報道中只有某一途徑獲得的莽草酸具有生物學(xué)功效，對不同途徑獲得的莽草酸效價對比性研究幾乎很少，有待進(jìn)一步研究。

3 莽草酸的生物學(xué)功能

3.1 抗菌、抗腫瘤

研究表明，莽草酸衍生物具有抗菌、抗腫瘤作用。以莽草酸甲酯為底物合成的乙二醛酶Ⅰ抑制劑類似物對海拉細(xì)胞株和埃希利腹水癌具有明顯抑制作用，且能延長接種白血病細(xì)胞L1210小鼠的存活時間，而對機(jī)體自身的毒性相對較低，其抑制機(jī)理可能與硫氫化物的反應(yīng)有關(guān)。孫快麟等也得到了類似的結(jié)果，并證實莽草酸衍生物二霉素的類似物，與二霉素有著類似的體外抑制白血病細(xì)胞L1210的功能[26]。

3.2 抗血栓形成

莽草酸對心血管系統(tǒng)的保護(hù)作用主要是通過抑制血小板聚集和抗血栓的形成。馬怡等報道表明，莽草酸具有顯著抗血栓作用以及抑制動、靜脈血栓及腦血栓的形成，通過進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，莽草酸主要是通過影響花生四烯酸代謝，抑制血小板聚集和凝血系統(tǒng)，進(jìn)而發(fā)揮其抗血栓形成的作用[27]。王宏濤等也得到類似結(jié)論，研究發(fā)現(xiàn)，異亞丙基莽草酸（ISA）具有顯著抑制血栓形成功能，這可能與其抗血小板聚集作用有關(guān)[28]。陳驍熠等采用體外給藥法觀察馬尾松中的莽草酸對Collagen和ADP誘導(dǎo)的血小板聚集的影響，結(jié)果可見，馬尾松中的莽草酸有很好的抑制體外Collagen、ADP誘導(dǎo)的血小板聚集，且劑量和作用呈現(xiàn)一定的正相關(guān)性[29]。這說明馬尾松中莽草酸能抑制血小板聚集，具有抗凝血作用，可防止血栓形成。

3.3 抗腦缺血

莽草酸及其衍生物抗腦缺血的功能主要通過抑制血小板聚集和血栓形成以及抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的活化，從而發(fā)揮抗腦缺血的作用。馬怡等探討莽草酸對中腦動脈形成血栓后病灶腦缺血影響結(jié)果表明，其能夠顯著減少小鼠中腦動脈血栓的形成[27]。鐘兆忠等研究表明，三乙酰莽草酸（TSA）通過降低腦缺血后的紅細(xì)胞聚集程度以及抑制血小板聚集，從而促進(jìn)腦血液微循環(huán)，另外，TSA還可影響P-選擇素的表達(dá)，抑制腦缺血再灌注和凝血酶引起的血小板與中性粒細(xì)胞的黏附，從而發(fā)揮其抗腦缺血的功能[30]。王宏濤等在研究ISA對大腦中動脈栓塞模型大鼠腦組織自由基代謝作用時發(fā)現(xiàn)，ISA能顯著提高腦組織中SOD和GSH-px的活力，顯著降低了MAD的水平，提示ISA可能是通過減少自由基對腦組織損傷而達(dá)到保護(hù)腦組織缺血性損傷作用[28]。

3.4 抗炎鎮(zhèn)痛

邢建峰等研究發(fā)現(xiàn)，ISA不僅可以抑制炎癥早期的滲和水腫，也可抑制炎癥晚期的組織增生以及肉芽組織的形成，具有顯著的抗炎癥功能。另外ISA能夠影響細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子STAT1、STAT3、NF-kB的表達(dá)[31]。ISA通過下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子NF-kB的活性，抑制炎癥因子（IL-1β、TNF-α、INF-γ）的表達(dá)，從而起到抗炎癥的效果[32]。莽草酸具有一定的鎮(zhèn)痛作用，其主要通過影響動物的神經(jīng)中樞，從而達(dá)到抑制效果，具體檢測指標(biāo)為動物扭體的頻率。林潔等采用扭體法和溫浴法試驗發(fā)現(xiàn)，腹腔注射莽草酸溶液能顯著減少小鼠扭體次數(shù)，這表明莽草酸對小鼠具有明顯的鎮(zhèn)痛作用[36]。

3.5 抗禽流感作用

瑞士羅氏公司生產(chǎn)的神經(jīng)氨酸酶抑制劑“達(dá)菲”，對抗流感病毒具有顯著抑制作用，試驗研究表明，其對禽流感病毒H5N1和H9N2具有顯著的抑制作用，而莽草酸是合成“達(dá)菲”的重要原料[34]。其作用機(jī)理為莽草酸結(jié)構(gòu)中的親脂性基團(tuán)與流感病毒的神經(jīng)氨酸酶的疏水部分結(jié)合，使病毒的神經(jīng)氨酸酶失去分解被污染細(xì)胞表面唾液酸的能力，阻斷了病毒顆粒向周圍細(xì)胞的擴(kuò)散，從而抑制流感病毒的繼續(xù)傳播。

4 展 望

莽草酸是一種比較有前景的新型天然藥物，其來源廣泛。莽草酸作為合成抗禽流感藥“達(dá)菲”的重要原料，也受到許多學(xué)者的關(guān)注，因此尋找高產(chǎn)率、低成本的制備途徑是所有研究者努力的方向。目前，對莽草酸及其衍生物等的研究主要集中在抗血栓、抗炎、抗病毒方面，而對于其抗腫瘤作用以及機(jī)制的研究鮮為報道。因此，在莽草酸抗腫瘤及其分子水平作用機(jī)制方面可以更為深入的研究，對其進(jìn)行很好的開發(fā)利用，為社會做出更大的貢獻(xiàn)。此外，如果將莽草酸作為一種添加劑適用于家畜生產(chǎn)的有效性需進(jìn)一步研究。

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