小鼠原位肝移植操作技術(shù)改良進(jìn)展

楊超，崔子林，張雅敏（.天津醫(yī)科大學(xué)一中心臨床學(xué)院，天津 3009；.天津市第一中心醫(yī)院肝膽外科，天津 3009）

隨著移植技術(shù)的不斷進(jìn)步，肝移植已經(jīng)成為治療終末期肝病的重要手段，對肝移植方面的相關(guān)研究也日益增多，因此，肝移植動物模型的建立也變得越來越重要，本文對近年來小鼠原位肝移植（OLT）模型建立的步驟改良及手術(shù)注意事項進(jìn)行綜述。

大鼠OLT模型是在1973年最先由Lee等［1］成功建立的，1979年Kamada等［2］提出的“雙袖套管”方法使得大鼠OLT模型的建立更進(jìn)一步發(fā)展，隨著顯微外科技術(shù)水平的提高，多種移植模型的建立得到廣泛研究［3］。1991年，Qian等［4］在Kamada法的基礎(chǔ)上首次成功建立小鼠OLT模型，從此各移植中心陸續(xù)開展了對小鼠肝移植相關(guān)技術(shù)的研究。與以大鼠為實(shí)驗(yàn)對象的研究不同，小鼠肝移植模型在移植免疫方面有著其獨(dú)特的優(yōu)勢［5-6］。各種基因敲除［7］和轉(zhuǎn)基因小鼠［8］模型的成功建立及大量特異性的單克隆抗體的出現(xiàn)［9］， 給肝移植后免疫學(xué)的研究帶來了更為廣闊的發(fā)展天地，與此同時，小鼠肝移植模型的成功建立就變得尤為重要。

1 Qian等［4］報道的經(jīng)典小鼠OLT模型

Qian等［4］使用 B6AF1、C57BL/6、和 BALB/c近交系雄性小鼠，在4.0～6.4倍放大倍數(shù)的手術(shù)顯微鏡下，將小鼠固定，用甲氧氟烷麻醉，備皮消毒，取腹部正中切口，充分暴露手術(shù)視野，橫斷膽管，結(jié)扎幽門靜脈、脾靜脈、右腎上腺靜脈和右腎靜脈。由陰莖背靜脈緩慢注射0.3 ml乳酸林格液溶解稀釋的肝素（100 U）進(jìn)行肝素化。在用動脈夾夾閉胸主動脈以及已經(jīng)分離的接近膈肌的肝上下腔靜脈（SHVC）后，用1 ml冷的乳酸林格液通過腹主動脈灌注肝臟，用冷的乳酸林格液頻繁沖洗肝臟和周圍的組織來保持肝臟低溫，分離肝下下腔靜脈（IHVC）至左腎靜脈水平。

離斷血管，取肝臟并放置在一個盛有冷的乳酸林格液的容器中，結(jié)扎膽囊管并摘除膽囊，IHVC和門靜脈（PV）插入泰夫龍?zhí)坠埽↖HVC用外徑為1.7 mm的套管，PV用外徑1.2 mm的套管）。

受體手術(shù)的麻醉、消毒與供體手術(shù)相同。以IHVC、PV、SHVC的順序夾閉血管并離斷。當(dāng)移除肝臟后，將移植肝植入原位，用10-0尼龍縫線吻合SHVC。將移植肝PV套管插入已經(jīng)切開前壁的受體PV并扎緊，移除SHVC和PV血管鉗開放血管。用同樣方法插入IHVC的套管，不做肝動脈重建，用長度超過4 mm的聚乙烯導(dǎo)管支架完成膽管連續(xù)性重建，用乳酸林格液補(bǔ)充術(shù)中失血，最后分兩層連續(xù)縫合關(guān)腹。一次性肌肉注射5 mg頭孢孟多酯鈉和60 kU比西林，將小鼠放置在取暖燈下直到蘇醒，隨意進(jìn)食和飲水。

2 小鼠OLT改良方法

在Qian等［4］成功建模的基礎(chǔ)上，國內(nèi)外許多學(xué)者成功復(fù)制了小鼠肝移植模型，并在其基礎(chǔ)上進(jìn)行了改良，現(xiàn)將部分成功建模的方法步驟綜述如下。

通常使用的小鼠品系為C57BL/6、BALB/c和昆明小鼠等雄性小鼠，此外根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌?，可以使用基因工程改良后的小鼠。常用的麻醉方法為氣體持續(xù)吸入麻醉，麻醉劑可選擇乙醚、氯胺酮配合乙醚、異氟醚（又名異氟烷）等。麻醉前也可以皮下注射0.04 mg/kg的阿托品作為氣體麻醉前的引導(dǎo)用藥［10］。使用氣體麻醉可以很好地控制麻醉藥的劑量，特別是在受者手術(shù)無肝期的時候，可迅速、精確地調(diào)整劑量，維持穩(wěn)定的麻醉狀態(tài)。此外也可腹腔注射戊巴比妥鈉（60 mg/kg）［10］和氯胺酮等麻醉藥，但是受體在無肝期時候容易出現(xiàn)死亡，術(shù)后死亡率也較高。手術(shù)顯微鏡可以選用單人雙目或雙人雙目顯微鏡；IHVC套管可采用6F動脈穿刺鞘管或7F動脈穿刺鞘管牽拉制成的導(dǎo)管或16G留置針鞘管；PV套管可采用6F動脈穿刺鞘管或5F動脈穿刺鞘管牽拉制成的導(dǎo)管或28G留置針鞘管；膽管支架可采用一次性硬膜外導(dǎo)管牽拉制成的導(dǎo)管或外徑為0.61 mm聚乙烯套管加工制成的導(dǎo)管。

將小鼠固定，可使用聚維酮碘為腹部手術(shù)區(qū)域消毒［11］。為了使暴露更加充分，通常采取上腹全橫切的切口，也可使用上腹部十字切口開腹。一個血管鉗夾住劍突并向頭側(cè)牽拉固定，可根據(jù)切口不同選擇2個或4個小拉鉤，同時可以使用腰橋?qū)⑹荏w背部墊高，以充分暴露手術(shù)視野。首先橫斷膽管，插入預(yù)先準(zhǔn)備的膽管支架，結(jié)扎幽門靜脈、脾靜脈、右腎上腺靜脈和右腎靜脈，切斷右腎上腺靜脈時可采用電凝切斷以減少術(shù)中出血［12］。于陰莖背靜脈注射125 U/ml肝素生理鹽水0.5 ml或在IHVC注入含肝素鈉100 U的生理鹽水0.4 ml進(jìn)行肝素化［13］。灌注液可選擇4 ℃乳酸林格液或4 ℃威斯康星大學(xué)保存液（UW液），有些研究表明，移植肝保存在UW液中18小時，不會產(chǎn)生顯著的損傷和移植肝的衰竭［14］。灌注穿刺部位可選擇下段腹主動脈，以30～10 ml/h的速度灌注2～3 ml灌注液；或者灌注穿刺部位選擇PV，緩慢灌注4 ml灌注液；亦或選擇腹腔干，通過輸液泵以1.5 ml/min的速度緩慢灌注20 ml灌注液。肝臟和周圍的組織通過用冷的乳酸林格液頻繁沖洗來保持低溫［15］。緊貼左腎靜脈上方剪斷IHVC，在脾靜脈上方離斷PV，在膽管支架下方離斷膽總管，結(jié)扎并離斷食管與肝臟之間的交通支；緊貼膈肌剪斷SHVC，取下的肝臟放置在一個盛有冷的乳酸林格液的容器以備進(jìn)一步處理。

供肝的修整通常選用類似Kamada大鼠OLT的“雙袖套管法”修整肝臟，基本不采用“三袖套管法”。結(jié)扎膽囊管，摘除膽囊。

受體手術(shù)可通過腹部正中切口進(jìn)腹或上腹全橫切，充分暴露手術(shù)視野。結(jié)扎分離膽管、肝動脈、右腎上腺靜脈，切斷肝周韌帶并且用結(jié)扎線繞過SHVC，用這根線來把肝臟和膈肌分開便于在SHVC放置一把Santinsky鉗。在肝臟移除之前，在PV分叉處注入常溫生理鹽水0.2～0.3 ml，當(dāng)準(zhǔn)備移除肝臟時，以IHVC、PV、SHVC的順序夾閉并離斷血管。原位置入供肝，用10-0尼龍縫線吻合SHVC實(shí)現(xiàn)重建，具體可選擇的方法有“一針法”外翻縫合或端端連續(xù)外翻縫合或雙針連續(xù)水平褥式外翻縫合，前后壁均自左向右縫合。在閉合SHVC前排盡血管內(nèi)氣泡，袖套法吻合門靜脈， 松開PV及SHVC止血夾，結(jié)束無肝期，無肝期時間要小于20分鐘。同法吻合IHVC。將供體膽管支架置入受體膽總管內(nèi)結(jié)扎固定，大網(wǎng)膜覆蓋。

通常不做肝動脈重建，但也有學(xué)者進(jìn)行肝動脈重建，其方法為分別在腹腔干上方及髂總動脈處分離一段腹主動脈，供肝的肝動脈與受體腹主動脈行端側(cè)吻合，用已準(zhǔn)備好的膽管支架插管固定來完成膽管連續(xù)性重建。用38℃生理鹽水或甲硝唑沖洗腹腔，術(shù)中失血可選擇經(jīng)陰莖背靜脈注射0.2 ml乳酸林格液，分兩層連續(xù)縫合關(guān)腹。術(shù)后3小時燈照保暖，可不給予止痛、抗炎治療，或者術(shù)后3天內(nèi)腹腔注射頭孢地嗪鈉100 mg/（kg·d）或肌肉注射80 kU青霉素。單籠喂養(yǎng)，自由進(jìn)水、進(jìn)食，不給予免疫抑制劑。

3 術(shù)中及術(shù)后操作注意事項

3.1 小鼠的肝臟極為嬌嫩，反復(fù)翻動可能造成不同程度的機(jī)械損傷及微血栓形成，同時激活Kuffer細(xì)胞，增加其對缺血/再灌注（I/R）損傷的敏感性，進(jìn)而加重I/R損傷［16］，因此，分離肝周韌帶時動作要輕柔，可以嘗試沿順時針方向進(jìn)行分離以減少對肝臟的翻動。

3.2 分離供肝IHVC時，可以嘗試分離至髂靜脈分叉上方水平［17］，這樣可以增加IHVC的長度，方便套管。

3.3 供肝灌注時， 應(yīng)注意灌注壓力恰當(dāng)，一般以30～10 ml/h為宜；灌注壓力過高可引起肝細(xì)胞損傷，導(dǎo)致肝細(xì)胞水腫進(jìn)而影響供肝質(zhì)量［18］。灌注時要均勻、緩慢。研究表明，供肝膽道系統(tǒng)的充分灌注可降低膽道并發(fā)癥的發(fā)生率［19］。

3.4 小鼠SHVC管壁薄易碎，吻合難度大， 可使用10-0尼龍縫線“一針法”［20］連續(xù)外翻縫合，僅需縫合7或8針，耗時6～8分鐘，顯著縮短了縫合時間及無肝期，其次，血管內(nèi)膜外翻有利于保持吻合面平整，防止血栓形成，還可以減少吻合口漏的發(fā)生。

3.5 在冷缺血時間里，I/R損傷嚴(yán)重［21］，所以應(yīng)盡快縮短冷缺血時間。熱缺血時間小于20分鐘可以提高移植后存活率［22］。PV重建后即開放并同時開放SHVC，可縮短受體無肝期及供肝熱缺血時間。

3.6 膽道重建后，用大網(wǎng)膜覆蓋膽管支架可以減少膽瘺的發(fā)生［14］。

3.7 盡量縮短無肝期，無肝期過長可以加重I/R損傷，造成內(nèi)毒素樣綜合征以及嚴(yán)重酸中毒［23］。

3.8 肝動脈系統(tǒng)是供肝側(cè)膽管最主要的血供來源［24］。臨床研究證實(shí)：肝動脈血栓形成可引起膽道缺血狹窄、膽道壞死、膽瘺、菌血癥或膿腫形成等， 是導(dǎo)致移植物肝功能喪失和受體死亡的常見原因［25］。有些學(xué)者認(rèn)為動脈化是小鼠肝移植物存活的必要條件，重建有利于提高受體存活率［26-27］，并且有學(xué)者報道了通過支架重建的新方法［28］；也有學(xué)者認(rèn)為， 重建對受體存活率無影響［29］。

3.9 盡量減少手術(shù)時間有益于受體術(shù)后復(fù)蘇，據(jù)報道，受體和供體平均手術(shù)時間最好分別控制在22～23分鐘和45分鐘左右［30］。

4 總 結(jié)

Qian等［4］所報道的小鼠OLT方法1周存活率為83%，近年來國內(nèi)外學(xué)者對該方法不斷完善，其1周存活率有所提高。雖然小鼠OLT模型技術(shù)難度大，對實(shí)驗(yàn)室條件、實(shí)驗(yàn)者顯微外科技術(shù)要求高，但是其對免疫學(xué)研究的優(yōu)越性使得該模型的建立仍然有十分重要的意義。通過不斷的實(shí)踐與總結(jié)，相信最終該模型的成活率還會進(jìn)一步提高。