小反芻獸疫的診斷與免疫研究

黃文峰 楊惠超 （遼寧職業(yè)學(xué)院 遼寧 鐵嶺 112099）

小反芻獸疫(Petse des petis ruminants,PPR)是由小反芻獸疫病毒(Petse des petis ruminants virus,PPRV)引起綿羊、山羊等小反芻動(dòng)物急性、熱性、高度接觸性的傳染病。本病于1942年在西非的科特迪瓦地區(qū)首次爆發(fā)，2007年7月我國(guó)首次報(bào)道在西藏自治區(qū)日土縣熱幫鄉(xiāng)龍門卡村發(fā)生PPR疫情。本病以發(fā)熱、結(jié)膜炎、糜爛性口腔炎、肺炎為特征。嚴(yán)重暴發(fā)時(shí)，本病的發(fā)病率高達(dá)100%，羔羊感染時(shí)病死率可達(dá)100%。因此PPR被國(guó)際獸疫局(OIE)列為A類病，在我國(guó)列為一類動(dòng)物疫病。本文重點(diǎn)闡述了小反芻獸疫的診斷方法及免疫學(xué)研究。

1 生物學(xué)特性

（1）PPRV屬副黏病毒科的麻疹病毒屬成員，與牛瘟病毒具有血清學(xué)相關(guān)性，能產(chǎn)生交叉保護(hù)反應(yīng)。病毒無(wú)血凝性，不能凝集綿羊、山羊、猴、牛、馬、豬、犬、豚鼠和雞等動(dòng)物的紅細(xì)胞，但其抗體可以抑制麻疹病毒凝集猴的紅細(xì)胞[1]。（2）PPR病毒粒子呈多形性，多為圓形或橢圓形，直徑約為150～700nm之間，平均為500nm。病毒顆粒外層被有85～145 nm厚的囊膜，囊膜上有8～15nm長(zhǎng)的纖突，纖突上有血凝素H蛋白，無(wú)神經(jīng)氨酸酶。病毒的核衣殼總為1 000 nm，呈螺旋對(duì)稱[2]，由核蛋白(N)、磷蛋白(P)和聚合酶( L)3種病毒蛋白構(gòu)成。（3）PRRV對(duì)溫度敏感，有研究表明：本病毒56℃環(huán)境下感染的半衰期2.2min，37℃環(huán)境下感染的半衰期為3.3h；病毒在pH4.0以下或pH11.0以上很快就失活；對(duì)乙醇、乙醚、甘油和一些去垢劑敏感；大多數(shù)化學(xué)消毒劑(如酚類、2%NaOH等)24h可將其滅活。

2 流行病學(xué)特點(diǎn)

（1）山羊和綿羊是PPRV的自然宿主，通常山羊的易感性高于綿羊，尤其是3～8月齡的山羊易感性更高[3]。豬和牛也可感染，但不表現(xiàn)臨床癥狀，也不具有傳染性。一些野生動(dòng)物如野山羊、努比亞北山羊、長(zhǎng)角大羚羊、東方盤羊、美洲白尾鹿等都可感染。（2）患病動(dòng)物是主要的傳染源，尤其是發(fā)熱期的動(dòng)物排毒量更大?？凇⒈?、眼的分泌物，尿液，糞便，乳汁，精液，胚胎等都存在病毒。主要的傳播方式是直接接觸傳播，通過(guò)打噴嚏和咳嗽產(chǎn)生的氣霧以及呼出的氣體短距離傳播感染，感染途徑以呼吸道為主。易感動(dòng)物接觸被污染的飼料、墊料、水槽等也可感染，但不是主要的傳播途徑。本病一年四季都可發(fā)生，但多雨季節(jié)以及寒冷的冬季多發(fā)。

3 臨床癥狀

本病的潛伏期一般為4～6d，最長(zhǎng)潛伏期21d?；夹篌w溫升高至41～42℃，精神沉郁、感覺(jué)遲鈍、食飲欲減退或廢絕、鼻鏡干燥、被毛逆立，眼結(jié)膜潮紅，齒齦、上腭、嘴唇、舌面、頰部黏膜彌散分布有針尖大小的灰色壞死點(diǎn)，眼、口和鼻分泌大量黏膿性的分泌物，嚴(yán)重時(shí)因鼻孔堵塞而致呼吸困難、眼瞼粘連甚至失明?？谇火つこ溲?、壞死，后期口腔黏膜上被覆較厚一層干酪樣物質(zhì)，患畜大量流涎。患畜咳嗽、胸部啰音，有時(shí)表現(xiàn)為腹式呼吸。發(fā)病后期常出現(xiàn)出血性腹瀉，開(kāi)始時(shí)糞便變軟，然后水便，有時(shí)內(nèi)含有壞死組織碎片，動(dòng)物脫水、衰弱、體溫下降、眼球凹陷，常在發(fā)病后5～10d脫水而死。

4 病理變化

主要表現(xiàn)為消化道和呼吸道黏膜糜爛性損傷。嘴唇充血、口腔黏膜不同程度地破損，嚴(yán)重的出現(xiàn)廣泛性潰瘍性和壞死性口炎，有的病變可延伸至咽部，甚至瘤胃和網(wǎng)胃的交界處。皺胃黏膜出現(xiàn)嚴(yán)重的充血和潰爛，常見(jiàn)回盲腸瓣膜出血，大腸縱向折疊頂部偶爾出現(xiàn)嚴(yán)重的出血形成斑馬樣條紋。鼻腔、喉、氣管黏膜潰瘍、出血，支氣管和肺出現(xiàn)干酪樣病灶，肺臟表面有出血點(diǎn)，肺門淋巴結(jié)腫脹。腸系膜淋巴結(jié)腫脹，脾腫脹、壞死。

5 診斷

5.1 初步診斷 根據(jù)疫病的流行特點(diǎn)、患病動(dòng)物的典型臨床癥狀以及病理變化可對(duì)此病進(jìn)行初步診斷。本病傳播迅速、發(fā)病率高，患羊出現(xiàn)急性發(fā)熱，眼、鼻、嘴出現(xiàn)分泌物并在嘴唇周圍出現(xiàn)潰瘍或結(jié)節(jié)性病變，出現(xiàn)肺炎、腹瀉等癥狀，且出現(xiàn)肺尖肺炎病理變化時(shí)，可判定為疑似小反芻獸疫。但應(yīng)與牛瘟、羊傳染性胸膜肺炎、巴氏桿菌病、口蹄疫、羊口瘡以及藍(lán)舌病等進(jìn)行鑒別診斷，準(zhǔn)確診斷還需實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)。

5.2 瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)(AGID) AGID是一種相對(duì)操作簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求較低的檢測(cè)方法。采取腸系膜或支氣管淋巴結(jié)、脾或肺組織材料加緩沖鹽水研磨制成抗原，以104TCID50/ml的PPRV5ml免疫綿羊制備標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)。但該方法敏感性較低，故不適合檢測(cè)溫合型PPR或早期感染病例。

5.3 對(duì)流免疫電泳(CIEP) Obi TU等[4]采用CIEP和AGID兩種方法同時(shí)檢測(cè)感染PPRV的材料，所檢測(cè)的樣品陽(yáng)性率分別為80.3%和42.6%，表明CIEP的敏感性高于AGID。Osman[5]等用CIEP和競(jìng)爭(zhēng)ELISA(c-ELISA)兩種方法同時(shí)檢測(cè)519個(gè)血清樣本，陽(yáng)性率分別是59.15 %和50.67%，說(shuō)明CIEP的敏感性高于c-ELISA，但是CIEP試驗(yàn)不能區(qū)別PPRVT和RPV兩者的感染。

5.4 病毒的分離培養(yǎng) 病毒分離培養(yǎng)操作復(fù)雜、耗時(shí)較長(zhǎng)，但其具有較好的特異性和較高的敏感性。可采病料除菌處理后，將其接種在原代羔羊腎細(xì)胞或非洲綠猴腎細(xì)胞上，培養(yǎng)5～6d后出現(xiàn)CPE(致細(xì)胞病變效應(yīng))。具體表現(xiàn)為細(xì)胞變圓、收縮，形成多核巨細(xì)胞體，有的出現(xiàn)核內(nèi)包涵體，部分細(xì)胞形成空泡。

5.5 間接熒光抗體試驗(yàn)(IFAT) 有報(bào)道表明，應(yīng)用特異性PPRV單克隆抗體建立了IFAT方法，能夠檢測(cè)出PPR發(fā)病初期和后期病料中的PPRV抗原，并且能夠快速地與牛瘟病毒做鑒別診斷。

5.6 病毒中和試驗(yàn)(VNT) VNT靈敏并具有較強(qiáng)的特異性，在國(guó)際貿(mào)易中被指定為PPR的診斷方法。但VNT對(duì)試驗(yàn)要求高，需要細(xì)胞培養(yǎng)病毒，且耗時(shí)較長(zhǎng)，需10～12d才能得出結(jié)果，故不適合大規(guī)模的樣品檢測(cè)。

5.7 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA) 目前已有多種ELISA方法用于PPR的診斷。Zhang等[6]應(yīng)用間接ELISA方法對(duì)中國(guó)西藏爆發(fā)的PPR疫情進(jìn)行檢測(cè)，分析了697份血清，其敏感性和特異性分別是96.7%及96.1%。Singh等[7]應(yīng)用夾心ELISA方法進(jìn)行PPR的檢測(cè)，其敏感性和特異性分別是88.9%和92.8%，夾心ELISA操作方法簡(jiǎn)單、迅速，適合臨床樣品的檢測(cè)。競(jìng)爭(zhēng)ELISA是OIE PPR的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法之一，此方法快速、簡(jiǎn)便，可用于大批量的檢測(cè)。邱文英等[8]用抗PPRV N蛋白單克隆抗體ID5作為競(jìng)爭(zhēng)抗體，純化后的原核表達(dá)產(chǎn)物rpET-PPRN蛋白作為包被抗原，建立了靈敏度、特異性較高的單抗競(jìng)爭(zhēng)性ELISA方法?，F(xiàn)已開(kāi)發(fā)出標(biāo)準(zhǔn)競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)試劑盒，用于檢測(cè)血清或者血漿中的PPRV N蛋白抗體。

5.8 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測(cè) Forsyh等[9]1995年首先建立了PPR和RP的反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)鑒別診斷方法，即在各自病毒的P基因和F基因內(nèi)的保守區(qū)域設(shè)計(jì)數(shù)對(duì)引物，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增后電泳檢測(cè)。毛立等[10]2010年通過(guò)對(duì)PPRV不同分離株同源性分析比較，選擇PPRV不同毒株的保守但與RPV有較大差異的區(qū)段設(shè)計(jì)引物，通過(guò)對(duì)PCR各種條件的優(yōu)化，建立了PPRV特異、敏感的RT-PCR診斷方法。基于PPRV N蛋白基因，建立起的一步法實(shí)時(shí)定量RT-PCR法，能夠檢測(cè)血液樣本，與常規(guī)RT-PCR相比，具有更高的敏感性且減少PCR的污染[11]。基于PPRV N基因，Saravana[12]等2004年建立了PCR-ELISA檢測(cè)方法，其靈敏度比傳統(tǒng)RT-PCR高10倍，此方法更適用于早期感染及感染后期檢測(cè)，同時(shí)能進(jìn)行PPRV與RPV的鑒別診斷。

6 免疫研究

6.1 弱毒疫苗 由于PPRV和RPV具有較高的抗原相關(guān)性，因此，可使用RP弱毒疫苗來(lái)預(yù)防綿羊和山羊PPR的發(fā)生，且免疫效果好、免疫期長(zhǎng)。但有研究結(jié)果表明，含有RP抗體的羊，當(dāng)受到PPRV的攻擊時(shí)，PPRV可在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行短暫的繁殖并在此期間可能會(huì)傳播病毒。目前常用的PPR弱毒疫苗是Vigeria75/1弱毒疫苗。Vigeria 75/1弱毒疫苗能交叉保護(hù)各個(gè)群毒株的攻擊感染，安全、有效、保護(hù)期長(zhǎng)、且無(wú)任何副作用，被廣泛應(yīng)用于世界不同區(qū)域的PPR防控。但Vigeria 75/1弱毒疫苗熱穩(wěn)定性差。Sarkar[13]等人研究發(fā)現(xiàn)，使用水解乳白蛋白酶_蔗糖或二氫海藻糖作為疫苗的穩(wěn)定劑，大大提高疫苗的穩(wěn)定性，可使疫苗在45℃可穩(wěn)定保存14d。另外，印度根據(jù)當(dāng)?shù)氐亩局晁兄频腟ungri/96、Arasur/87和Coimbatore/97也已被批準(zhǔn)使用。

6.2 PPR滅活疫苗 Ndulaka等[14]用感染山羊的病理組織制備同源的PPR滅活疫苗，再用氯仿滅活制備的疫苗，免疫山羊后血清抗體可以持續(xù)8個(gè)月。

6.3 嵌合體疫苗 利用PPRV的F和H，m蛋白基因代替RPV疫苗表面相對(duì)應(yīng)的糖蛋白基因，可以是單獨(dú)代替也可以是同時(shí)代替，以此構(gòu)建嵌合體疫苗。研究表明，F(xiàn)和H，m三種蛋白基因同時(shí)代替構(gòu)建的嵌合體疫苗RPVPPRmFH對(duì)PPRV具有良好的免疫原性，能產(chǎn)生較高的中和抗體，以抵抗PPRV強(qiáng)毒的攻擊。

6.4 重組亞單位疫苗 麻疹病毒屬的表面糖蛋白具有良好的免疫原性。無(wú)論是使用H蛋白或N蛋白都作為亞單位疫苗，均能刺激機(jī)體產(chǎn)生體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，產(chǎn)生的抗體能中和PPRV和RPV[15]。

6.5 基因重組疫苗 麻疹病毒屬病毒表面的糖蛋白具有良好的免疫原性，已有很多該屬病毒的F和H蛋白在活病毒載體上表達(dá)用作有效的疫苗進(jìn)行免疫。已有研究報(bào)道，將PPRV的F基因插入弱毒痘病毒的TK基因編碼區(qū)重組羊痘疫苗，該疫苗能夠同時(shí)預(yù)防PPRV和羊痘病毒的感染。也有報(bào)道表明，將PPRV的H基因在腺病毒載體上表達(dá)，成功構(gòu)建了表達(dá)PPRV H基因的復(fù)制缺陷性重組人腺病毒載體疫苗候選株。

6.6 轉(zhuǎn)基因植物疫苗 Prasad[16]等報(bào)道，將PPRV的H基因在植物木豆中表達(dá)制備成了轉(zhuǎn)基因植物疫苗，但這種疫苗的免疫原性和保護(hù)力還有待臨床檢驗(yàn)。隨著研究的深入，軒基因植物疫苗可能會(huì)在PPR的防疫中發(fā)揮作用。

6.7 RNA干涉技術(shù) 當(dāng)前，RNA干擾技術(shù)應(yīng)用于PPR的防制還處于起步階段，其原理是合成的小干擾RNA分子作用于PPRV N蛋白基因的2個(gè)區(qū)，可減少80%以上的病毒復(fù)制[17]。

[1]信愛(ài)國(guó), 楊仁標(biāo), 向文彬.小反當(dāng)獸疫研究進(jìn)展[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2003, 25: 152-155.

[2]Barrett T, Banyard A C and Diallo A.molecular biology of Lbe morbilliviruses.In: Rinderpest and Peste des Petits Rumminants,Virus Plagues of large and Small Ruminants[J].Academic Press Elsevier, 2006: 31-67.

[3]中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部辦公廳文件(2003年8月28日).

[4]Obi TU, Patrick D.The detection of peste des petits ruminants (PPR ) virus antigen by agar gel precipitation test and counter immunoeleb trophoresis[J].J Hyg (Lond), 1984, 93(3): 579-586.

[5]Osman N A, Ali A S, Rahman m E,et al.Antibody seroprovalences against Peste des Petits Ruminants (PPR) virus in sheep and goats in Sudan[J].Tropical animal Health and Production, 2009,41(7):1 449-1 453.

[6]Zhana G R, Zeng J Y, Zhu Y m, et al.Development of an indirect ELISA with artificially synthesized N protein of PPR virus[J].Intervirerlogy.2012, 55(1): 81-84.

[7]Singh R P, Bandyopadhyay S K, Sreenivasa BP,et al. Production and characterization of monoclonal antibodies to peste des petits ruminants (PPR) virus[J].Veterinary research communications 2004 Oct; 28(7): 623-39.

[8]邱文英, 李偉, 李剛等.小反芻獸疫N蛋自單克隆抗體的制備及競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法的建立[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào).2011, 19(5): 967-972.

[9]Forsyth m A.Barrett T Evaluation of Polym erase Chain Reaction for the Detection and Characterization of Rinderpest and Peste des Petits Rum inants Virues for Epide miological Studies[J].Virus Res 1995,39(2/3):151-163.

[10]毛立, 竇水喜, 翟軍軍等.小反芻獸疫病毒RT-PCR檢測(cè)方法的建立[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué).2010, 40(6): 593-597.

[11]Batten C A, Banyard A C, King D P, et al.A real time RT-PCR assay for the specific detection of Peste des petits ruminants virus[J].J Virol methods, 2011, 17(2): 401-404.

[12]Saravanan P, Singh R P, Balamuruqan V, et al.Development of a N gene-based PCR-ELISA for detection of Peste-des-petits-ruminants virus in clinical samples[J].Acta Virol, 2004, 48(4): 249-255.

[13]Sarkar J,SreeniVasa B P,Singh R P, et al.Comparative effic efficacy of various chemical stabilizers on the thermostability of a live-attenuated peste des petits ruminants(PPR) vaccine[J].Vaccine, 2003, 21(32): 4728-4735.

[14]Nduaka O,Ihemelandu E,C.The control of pneumonia_enteritis complex in dwarf goats of Eastern Nigeria by the use of chloroform_inactivated tissue Vaccine[J].Bull.Anim.Health Prod.Afr, 23: 341-348.

[15]mitra-Kaushik S, Naya K R, Shaila m S.Identification of a cytotoxic T-cell epitope on the recombinant nucleocapsid proteins of rinderpest and peste des petits ruminants viruses prerented assembled nucleocapsids[J].Virology, 2001, 279(1): 210-220.

[16]Prasad V,Satyavathi V V, Sanjaya, et al.Expression of biologically active hemagglutinin neuraminidase protein of peste des petits ruminants virus in transgenic pigeonpea[Cajnus caian(L) mill,sp][J].plant Sci, 2004, 166: 199-205.

[17]Servan De Almeida R, Keita D,Libeau G, et al.Control of ruminant morbillivirus replication by small interfering RNA[J].J Gen Virol, 2007, 88(8): 2307-2311.