TGF－β介導的上皮－間質(zhì)轉(zhuǎn)化與惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的相關性研究進展＊

于偉娜，羅軍敏，馮繼紅

上皮－間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelium－mesenchymal transition，EMT）是一個連續(xù)的生物學過程，可促進上皮細胞表型發(fā)生變化，以獲得間充質(zhì)細胞的表型特征［1］；EMT在惡性腫瘤轉(zhuǎn)移過程中起到了關鍵的作用，在此過程中，腫瘤細胞獲得了一定的遷移和侵襲能力，這也是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的前提和基礎。轉(zhuǎn)化生長因子－β（TGF－β）作為一個多功能的細胞因子，在EMT的誘導及腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移中起到關鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)TGF－β可通過多種信號通路及轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控EMT的發(fā)生，從而促進腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移。本文將綜述TGF－β誘導的上皮－間質(zhì)轉(zhuǎn)化在惡性腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用及相關調(diào)控機制，以期為腫瘤治療提供新的思路。

1 EMT轉(zhuǎn)化過程及特征

EMT主要是指上皮細胞間黏附下調(diào)，極性消失，上皮標志蛋白表達降低，獲得具有減少細胞間相互作用并增加細胞遷移能力及侵襲性的間質(zhì)細胞表型的一種轉(zhuǎn)分化過程。上皮細胞與其周圍的上皮細胞通過黏附連接、細胞橋粒、緊密連接和縫隙連接形成的細胞間連接在很大程度上是不變的。相反，間質(zhì)細胞并不會形成廣泛的細胞間連接，而是呈現(xiàn)出一種前后極化的狀態(tài)，參與細胞骨架重建和基因表達的重新編程，可作為單個個體在細胞外基質(zhì)中穿行［2］。EMT不論在腫瘤的形成（Ⅲ型EMT），還是在胚胎和器官發(fā)育（Ⅰ型EMT）以及在慢性炎癥、創(chuàng)傷修復和組織纖維化（Ⅱ型EMT）中都起著至關重要的作用［3］。

EMT的轉(zhuǎn)化過程是以細胞形態(tài)、緊密／黏附連接變化以及E－鈣黏蛋白、緊密連接蛋白－1（ZO－1）和其他分子表達下降為基礎的。細胞在經(jīng)歷EMT的過程中，通過上調(diào)和下調(diào)緊密黏附連接蛋白，使上皮細胞間的黏附連接復合物降解同時頂端－底外側(cè)細胞極性消失，蛋白酶激活使基底膜裂解，肌動蛋白細胞骨架重組，應力纖維形成從而使細胞獲得了向遠處侵襲轉(zhuǎn)移的能力。另外，有學者在轉(zhuǎn)移位點發(fā)現(xiàn)MET現(xiàn)象，認為可能是通過重建上皮細胞間的連接實現(xiàn)的，這一結(jié)果表明 EMT 是一個瞬態(tài)和可逆的過程［4，5］。

在EMT的過程中，E－鈣黏蛋白丟失是最早產(chǎn)生的步驟之一，標志著一系列信號事件和重大骨架重組的啟動［6］。EMT的一個關鍵的特征是從E－鈣黏蛋白到N－鈣黏蛋白表達的變化，細胞在經(jīng)過EMT之后，E－鈣黏蛋白的表達下調(diào)伴隨著N－鈣黏蛋白的表達增加，促進了內(nèi)皮細胞與基質(zhì)成分的相互作用，使細胞的能動性和侵襲性進一步增加，從而促進腫瘤的進展［7］。E－鈣黏蛋白介導黏附的丟失被認為是腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的一個先決條件，可促進腫瘤細胞從原發(fā)灶脫離并促使其在轉(zhuǎn)移部位定居。細胞內(nèi)E－鈣黏蛋白結(jié)合于 β－連環(huán)蛋白（β－catenin）、α－連環(huán)蛋白（α－catenin）和p120－連環(huán)蛋白，皆參與介導細胞內(nèi)信號并組成細胞之間的黏附連接，以維持上皮細胞的特性［8］。當E－鈣黏蛋白表達受抑制后，細胞黏附連接解體并釋放其結(jié)合伴侶β－catenin進入細胞質(zhì)，隨后β－catenin移位進入細胞核并與轉(zhuǎn)錄因子淋巴增強結(jié)合因子（lymphoid enhancer binding factor，LEF）結(jié)合形成β－catenin／LEF復合體，啟動其依賴的轉(zhuǎn)錄過程而發(fā)生 EMT［9］。

2 TGF－β與EMT關系

TGF－β是一個多功能的細胞因子，能夠調(diào)節(jié)各種各樣的生物學過程，包括細胞生長、分化、凋亡、免疫、細胞外基質(zhì)（ECM）的產(chǎn)生、血管生成、遷移和侵襲等。TGF－β與激活素、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMPs）共同構成TGF－β超家族的成員，TGF－β亞家族成員在脊椎動物胚胎發(fā)育EMT中發(fā)揮著重要的作用。TGF－β能介導EMT發(fā)生的現(xiàn)象首先在細胞培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)。經(jīng)TGF－β的作用，上皮細胞從立方形變?yōu)楠M長的紡錘體形，同時上皮標志物表達下降，間質(zhì)標志物如纖連蛋白和波形蛋白表達增強，細胞流動性亦隨之增加。Graauw等在對基底樣浸潤性乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，膜聯(lián)蛋白A1呈高表達狀態(tài)。膜聯(lián)蛋白A1作為TGF－β信號的陽性調(diào)節(jié)劑，促進EMT及侵襲轉(zhuǎn)移性能；而用siRNA下調(diào)膜聯(lián)蛋白A1的表達則能阻止其轉(zhuǎn)移［10］。

TGF－β誘導的EMT是一個高度復雜的過程，可通過Smad／non－Smad分子依賴信號轉(zhuǎn)導途徑發(fā)揮作用引起EMT發(fā)生。Smad信號通路是TGF－β誘導EMT形成的主要機制。TGF－β 的三個亞型（TGF－β1，TGF－β2，TGF－β3）通過結(jié)合其跨膜絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶Ⅱ型受體（TβRII）來激活信號通路，轉(zhuǎn)導TGF－β超家族成員的信號，隨后使TGF－βⅠ型受體（TβRⅠ）轉(zhuǎn)磷酸化。TGF－β誘導的受體復合體的激活使受體調(diào)節(jié)的Smad蛋白（R－Smads）、Smad2 和 Smad3發(fā)生磷酸化并使其激活，激活的R－Smads與Smad4形成復合物，并轉(zhuǎn)移到細胞核中與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用共同激活或抑制目的基因的轉(zhuǎn)錄，形成TGF－β 誘導的EMT的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑［11］。另外，R－Smads與Smad4所形成的三聚體能夠強化誘導Snail的轉(zhuǎn)錄，隨后抑制EMT的特征性標志E－鈣粘蛋白的表達［12］。

除了Smad通路外，TGF－β信號轉(zhuǎn)導還存在其他的信號通路—non－Smad通路，其主要包括GTPase信號通路、PI3K／AKT通路、RhoA 和 MAPK 通路等［13］。TGF－β 誘導癌細胞可以通過激活PI3K／AKT信號系統(tǒng)增強腫瘤細胞的幸存、轉(zhuǎn)移，介導EMT的產(chǎn)生。同時作為蛋白激酶MAPK家族成員的ERK1／2、JNKs、p38MAPKs在 TGF－β 介導的 EMT 及腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移中均具有重要的意義。JNK信號的失活將阻止TGF－β刺激誘導上皮細胞EMT所產(chǎn)生的形態(tài)學及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的變化。另外，Par6 能與 TGF－β 受體相互作用［14］，在 TGF－β信號的刺激下，TGF－βⅡ型受體使Par6發(fā)生磷酸化，導致降解RhoA的泛素連接酶Smurf1的聚集，從而使GTPase RhoA蛋白酶體的降解，促進EMT的形成。

3 TGF－β誘導EMT的分子調(diào)控機制

3．1 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)

3．1．1 Snail轉(zhuǎn)錄因子家族 現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)越來越多的分子參與EMT的過程，鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail作為它們中的一員，在靶向EMT的過程中發(fā)揮著主要的角色。Snail的異常表達抑制E－鈣黏蛋白的表達，導致產(chǎn)生一個完整的EMT表型，而沉默Snail的表達則能逆轉(zhuǎn)這一過程［15］。Saito 等［16］發(fā)現(xiàn)在 TGF－β1誘導的人鱗狀細胞癌HSC－4中，蛋白組學揭示Slug表達上調(diào)的同時整合素α3β1表達也同樣上調(diào)，而經(jīng)RNA干擾Slug的表達則能顯著抑制間質(zhì)細胞標志的表達和HSC－4腫瘤細胞的遷移；研究還發(fā)現(xiàn)抗整合素α3β1抗體能顯著抑制TGF－β1誘導的細胞遷移，這些結(jié)果顯示Slug在TGF－β1誘導的EMT及整合素α3β1介導的遷移中均占有著重要的角色。

3．1．2 轉(zhuǎn)錄因子 Twist蛋白 堿性螺旋－環(huán)－螺旋轉(zhuǎn)錄因子Twist的過表達或其啟動子的甲基化在癌腫轉(zhuǎn)移中也非常常見?；罨腡wist能上調(diào)N－鈣黏蛋白并下調(diào)E－鈣黏蛋白的表達，對EMT的發(fā)展及腫瘤的轉(zhuǎn)移均有促進作用。有學者在前列腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)沉默STAT3或HIF－1α均能有效降低TGF－β1誘導的Twist1的表達，除此之外，STAT3也能通過HIF－1α的穩(wěn)定表達增強TGF－β1誘導的Twist1的表達，為前列腺癌細胞的遷移和侵襲提供必要條件［17］。da Silva等報道在口腔鱗狀細胞癌的進展期階段，Twist1的表達明顯增高，且臨床觀察發(fā)現(xiàn)Twist1表達上調(diào)是對淋巴結(jié)和肺轉(zhuǎn)移以及不良預后評估的可靠指標［18］。因此，了解Twist在促進EMT以及腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用，可為新的抗癌藥物的研發(fā)提供新的方向。

3．1．3 核轉(zhuǎn)錄因子－κB（nuclear factor kappa B， NF－κB） NF－κB是免疫和炎癥反應的一個關鍵調(diào)節(jié)因子，同時在EMT的過程中也發(fā)揮著重要的作用。在正常上皮細胞TGF－β抑制NF－κB的活性，但在惡性腫瘤細胞中則可以激活這一轉(zhuǎn)錄因子［19］。Kumar等［20］報道 TGF－β 誘導非小細胞肺癌細胞株發(fā)生EMT后，EMT相關轉(zhuǎn)錄因子 Twist1、Snail、ZEB2表達顯著提高，且NF－κB的活性也明顯增加。進一步研究發(fā)現(xiàn)通過抑制NF－κB的活性導致轉(zhuǎn)錄因子Twist1、Snail、ZEB2的表達缺失且癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移性能降低，這一結(jié)果表明NF－κB在EMT及腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中具有重要的角色。另有研究發(fā)現(xiàn)抑制NF－κB信號的活性能阻止EMT的發(fā)展，且能夠引起EMT的逆轉(zhuǎn)，而激活這一通路則能夠促進腫瘤細胞向間質(zhì)細胞表型轉(zhuǎn)化，表明NF－κB是誘導和維持EMT所不可缺少的［21］。

3．2 信號轉(zhuǎn)導通路

3．2．1 Wnt通路 Wnt通路在腫瘤的進展及與之相關的EMT中有著重要的意義。在浸潤性乳腺癌模型中，典型的Wnt信號通路參與β－連環(huán)蛋白從胞質(zhì)到胞核的轉(zhuǎn)移，從而促進腫瘤的進展［22］。另外，TGF－β信號可誘導Snail的表達，而Wnt信號可使Snail的表達更加穩(wěn)定，且Smads能夠結(jié)合于淋巴增強因子 1（LEF1）和 Snail［23］。因此，在 Wnt和 TGF－β誘導的EMT過程中，共同的Smad－LEF－Snail復合物的形成可能促進EMT的產(chǎn)生。

除了典型的Wnt信號，TGF－β能夠誘導并與非典型的Wnt信號協(xié)作形成一個信號通路網(wǎng)絡促進乳腺癌細胞EMT的產(chǎn)生。TGF－β／活化素和Wnt配體的胞外拮抗劑的調(diào)節(jié)性分泌可以使乳腺癌細胞保持上皮細胞表型而免于受自分泌產(chǎn)生的TGF－β或Wnt信號的刺激。當EMT發(fā)生時，這些配體呈高水平表達，致使胞外拮抗劑表達下調(diào)，導致對TGF－β和Wnt的持續(xù)自分泌反應，促進腫瘤細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)換［24］。

3．2．2 Notch通路 現(xiàn)已證明Notch通路在心瓣膜等器官發(fā)育及腫瘤形成過程中促進EMT的產(chǎn)生。Luna－Zurita提出Notch和TGF－β與 BMP2協(xié)同作用共同參與心內(nèi)膜組織Endo－MT 的誘導［25］。BMP2 類似于 Wnt，抑制 GSK3β 的活性，從而使Snail處于穩(wěn)定狀態(tài)。Snail驅(qū)使的EMT不但需要TGF－β信號的轉(zhuǎn)錄誘導，還需要Wnt或BMP信號蛋白的穩(wěn)定性。Nyhan等研究表明在人腎臟上皮細胞EMT模型中，TGF－β信號通過Smads通路誘導Jagged1等一些 Notch受體配體的表達。隨后Jagged1誘導Notch通路的旁分泌信號，有效的使上皮細胞周期阻滯，并最終導致EMT的發(fā)生［26］。

此外，在經(jīng)歷了EMT的肺上皮細胞和肌成纖維細胞分化中同樣發(fā)現(xiàn)Notch信號誘導TGF－β的分泌［27］。肌成纖維細胞分化的重要標志—α－平滑肌肌動蛋白在肺上皮細胞誘導產(chǎn)生，并以TGF－β和Smad3依賴的方式對Notch信號的激活產(chǎn)生應答，與此同時Jagged1配體也被誘導產(chǎn)生，以利于形成對Notch通路的持續(xù)激活。

4 TGF－β介導的EMT與腫瘤轉(zhuǎn)移

轉(zhuǎn)移是癌細胞區(qū)別于正常細胞的最基本特征，這也是腫瘤進展過程中所必須的。腫瘤轉(zhuǎn)移包括多個步驟，其中侵襲是腫瘤轉(zhuǎn)移的前提，腫瘤細胞間粘附減弱和腫瘤細胞運動增強是侵襲的基礎。TGF－β參與各種類型癌腫轉(zhuǎn)移過程，目前證據(jù)支持EMT可提高癌細胞的侵襲性并內(nèi)滲到淋巴或血管，這可作為細胞轉(zhuǎn)移的早期表現(xiàn)之一。在癌組織中，腫瘤上皮細胞在經(jīng)歷EMT后變得更具有侵襲性，且實驗證實在一些腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移灶內(nèi)有EMT標志的存在，分述如下。

4．1 胃癌 TGF－β1通過下調(diào)E－鈣黏蛋白并上調(diào)波形蛋白的表達誘導胃癌細胞產(chǎn)生EMT，而抑制TGF－β1下游轉(zhuǎn)錄因子KLF8的表達則能有效的降低胃癌細胞的遷移、侵襲、運動能力，這可為胃癌的治療提供一定的理論基礎［28］。Liu等［29］檢測61例胃癌組織和鄰近正常組織中Twist、E－鈣黏蛋白以及波形蛋白的表達情況，結(jié)果顯示胃癌組織Twist、E－鈣黏蛋白以及波形蛋白陽性率分別為 73．9%、40．6%和 60．9%，而鄰近正常組織表達則分別為 2．9%、75．4%和 27．5%； 另外通過在細胞層面上干擾Twist的表達，發(fā)現(xiàn)Twist表達明顯減少的同時，E－鈣黏蛋白的表達卻顯著增加，且癌細胞的侵襲性能也顯著受抑，表明Twist在EMT以及胃癌的進展中發(fā)揮著重要作用。

4．2 結(jié)直腸癌 Fan等報道結(jié)腸癌細胞Snail的過表達能夠誘導EMT的產(chǎn)生并增加細胞的遷移、侵襲轉(zhuǎn)移能力和化學抗性，表明Snail的表達增加與結(jié)腸癌的進展有關［30］。另有學者應用免疫組化方法對251例結(jié)腸癌組織樣本檢測發(fā)現(xiàn)，76%的樣本中發(fā)現(xiàn)Snail1的表達，87%的樣本中E－鈣黏蛋白表達明顯丟失，且Snail1表達陽性的結(jié)腸癌組織與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移成正相關［31］。Pohl等在對結(jié)腸癌SW480細胞的研究發(fā)現(xiàn)，SMAD4通過下調(diào)內(nèi)源性 TGF－β亞型來抑制 TGF－β誘導的EMT。SMAD4＋的SW480細胞TGF－β亞型表達水平減少，導致TGF－β信號下降，從而抑制其侵襲性，實現(xiàn)EMT的逆轉(zhuǎn)［32］。

4．3 肺癌 轉(zhuǎn)移是導致肺癌患者病死的主要原因之一，研究顯示EMT在肺癌轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著關鍵作用。SPOCK1作為TGF－β的下游靶向基因，能夠增強TGF－β1誘導的肺癌細胞的 EMT 現(xiàn)象，促進肺癌的進展及轉(zhuǎn)移［33］。Chen 等［34］報道 TGF－β1通過 PI3K／Akt和 MAPK／Erk1／2信號通路誘導肺癌細胞發(fā)生EMT，增加其侵襲和轉(zhuǎn)移性。

4．4 乳腺癌 近期研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌中高水平的TGF－β1可能與不良的預后有關，且抑制TGF－β信號則能夠降低乳腺癌的轉(zhuǎn)移，因此靶向TGF－β1或TGF－β信號可以為轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者治療提供新的思路。Lv等用TGF－β1誘導乳腺癌細胞發(fā)現(xiàn)，細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化且伴隨著上皮標記的減少和間葉質(zhì)標志的增加，同時細胞侵襲能力也進一步增強，且干擾 Smad2的表達則能抑制這些現(xiàn)象的發(fā)生［35］。Karihtala等［36］通過免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織波形蛋白、EMT相關轉(zhuǎn)錄因子Zeb1和Sip1的表達明顯增加，且與腫瘤細胞的不良分化、臨床分期以及淋巴血管侵襲有關，說明它們與乳腺癌的進展密切相關，可作為臨床治療的潛在靶點。

4．5 卵巢癌 Jin等在對卵巢癌的研究中提到Snail與基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）相互作用促進卵巢癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，且免疫組化分析顯示Snail在轉(zhuǎn)移灶表達明顯增加并與癌癥的分期有關［37］。Mao 等［38］研究發(fā)現(xiàn)用 EMT 調(diào)節(jié)因子 Twist2 處理卵巢癌SKOV－3細胞，可以誘導下調(diào)E－鈣黏蛋白，上調(diào)N－鈣黏蛋白和β－連環(huán)蛋白等EMT相關表型的表達，表明Twist2可以通過抑制E－鈣黏蛋白的表達增加β－連環(huán)蛋白的釋放從而促進卵巢癌細胞的侵襲和遠處轉(zhuǎn)移。

4．6 其他 在侵襲性骨髓瘤的研究中，骨髓衍生的抑制細胞與腫瘤細胞分泌的趨化因子CXCL5作用，浸潤腫瘤細胞并分泌TGF－β、EGF、HGF等多種生長因子，最終誘導腫瘤細胞發(fā)生EMT［39］。Sun等在對97例肝細胞癌患者研究中發(fā)現(xiàn)Bcl－2／Twist1復合物的形成能加速Twist1的核轉(zhuǎn)錄，從而增加腫瘤細胞的可塑性、轉(zhuǎn)移及血管生成能力，最終與這些肝癌患者的不良預后有關［40］。Gong等指出Twist的核表達與食管鱗狀細胞癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關［41］。

另外，除了EMT對腫瘤細胞的直接作用外，歷經(jīng)EMT的腫瘤細胞分泌許多生長因子和趨化因子刺激并募集基質(zhì)細胞，加速腫瘤細胞的遷移和侵襲。有研究發(fā)現(xiàn)黑素瘤細胞衍生的IL－8通過自分泌活動促進腫瘤細胞的增值和遷移，而經(jīng)由旁分泌則可促進內(nèi)皮細胞血管生成并向腫瘤部位募集中性粒細胞，促進腫瘤的進展［42］。

總之，EMT及其誘導的關鍵因素TGF－β在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中起重要作用，可能是啟動惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關鍵所在。對EMT和TGF－β的深入研究不僅有助于更好地理解EMT的發(fā)生機制及調(diào)節(jié)因素在腫瘤生長、轉(zhuǎn)移中的作用，還可為預防及抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移提供一個新的治療策略。目前出現(xiàn)的抑制TβRⅠ激酶活性的小分子抑制劑和針對TGF－β的單克隆抗體等TGF－β拮抗劑，可通過多種機制抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。因此，通過TGF－β拮抗劑抑制EMT的產(chǎn)生可能是阻止腫瘤轉(zhuǎn)移的一個重要機制。

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