誘導(dǎo)多能干細(xì)胞重編程方法的優(yōu)化及其在航天醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用展望

徐洪杰，戴鐘銓，吳 峰，商 澎，李瑩輝

（1.西北工業(yè)大學(xué)生命學(xué)院 空間生物實(shí)驗(yàn)?zāi)M技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安710072；2.中國(guó)航天員科研訓(xùn)練中心 航天醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)與應(yīng)用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100094）

空間飛行的微重力環(huán)境會(huì)導(dǎo)致一系列航天醫(yī)學(xué)問(wèn)題的發(fā)生，包括骨丟失、肌肉萎縮、貧血、免疫功能下降和心血管系統(tǒng)紊亂等。研究顯示，為適應(yīng)空間獨(dú)特的微重力環(huán)境，組織體細(xì)胞活性和干細(xì)胞分化能力會(huì)發(fā)生改變［1－4］，進(jìn)而導(dǎo)致相應(yīng)生理系統(tǒng)問(wèn)題的發(fā)生發(fā)展。成體干細(xì)胞是各種組織器官的祖細(xì)胞和支持細(xì)胞，具有自我更新和分化為多種功能細(xì)胞的潛能；參與多種組織器官（如骨骼和造血系統(tǒng)）的失效細(xì)胞的更替及疾病痊愈。隨著干細(xì)胞研究的不斷發(fā)展和深入，微重力效應(yīng)對(duì)成體干細(xì)胞［5］、胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESCs）的影響逐漸成為空間生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。理解微重力對(duì)干細(xì)胞的影響將有助于闡明空間飛行期間的骨丟失、肌肉萎縮和貧血等生理變化的細(xì)胞分子機(jī)理，為采取針對(duì)性的防護(hù)措施提供理論和技術(shù)支持。

干細(xì)胞是具有無(wú)限或長(zhǎng)期的自我更新能力和分化產(chǎn)生至少一種成熟特異體細(xì)胞能力的細(xì)胞［6］。成體干細(xì)胞研究最早，但分化潛能有限。ESCs由于其巨大的分化潛能一度成為干細(xì)胞研究的熱點(diǎn)，但是倫理爭(zhēng)議和免疫排斥的問(wèn)題限制了其臨床應(yīng)用。2007年體細(xì)胞重編程獲得的類似ESCs潛能的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）彌補(bǔ)了上述缺陷，該研究獲得2012年諾貝爾生理與醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。研究表明成體干細(xì)胞的多能性、增殖［5］和分化潛能［3，7－9］受重力的影響。目前，失重條件下ESCs的研究才剛剛開(kāi)始［10］，而微重力對(duì)iPSCs的作用尚無(wú)報(bào)道。作者在此綜述了iPSCs的發(fā)現(xiàn)及最新研究進(jìn)展，重點(diǎn)闡述重編程方法的優(yōu)化及其在航天醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用展望，擬為開(kāi)展微重力對(duì)iPSCs影響的研究提供參考。

1 多能干細(xì)胞研究簡(jiǎn)述

多能干細(xì)胞包括ESCs、胚胎生殖細(xì)胞（embryonic germ cells，EG）、胚胎腫瘤細(xì)胞（embryonic carcinoma cells，EC）和iPSCs。有文獻(xiàn)［11］將生殖干細(xì)胞（multipotent germline stem cells，mGSC）和骨髓的前體細(xì)胞（multipotent adult progenitor cell）也并入此列。在畸胎瘤中發(fā)現(xiàn)的EC［12］是最早研究的多能干細(xì)胞。由于致瘤性、分化潛能有限且不能形成嵌合小鼠，其研究?jī)r(jià)值逐漸被1981年分離培養(yǎng)成功的小鼠ESCs［13］所取代。1998年John等通過(guò)分離原始生殖細(xì)胞培養(yǎng)后獲得了人EG［14］，同年從動(dòng)物囊胚期內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中分離培養(yǎng)獲得了ESCs［15－16］。這3種多能干細(xì)胞中ESCs最有研究和應(yīng)用價(jià)值。

成熟的細(xì)胞由分化狀態(tài)被逆轉(zhuǎn)到未分化狀態(tài)的過(guò)程稱為細(xì)胞重編程［17］。通過(guò)重編程可由體細(xì)胞獲得多能干細(xì)胞。目前可實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞重編程的方法包括：細(xì)胞核移植［18］、體細(xì)胞與多能細(xì)胞融合［19－20］、用ESCs提取物處理體細(xì)胞［21］以及某些類型細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)自發(fā)產(chǎn)生［22－24］。然而這些方法的應(yīng)用條件復(fù)雜、重編程效率低。同時(shí)，核移植或細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)提示篩選出有效的多能性相關(guān)的特定因子可能有助于建立簡(jiǎn)便高效的重編程方法。

2 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的建立

受細(xì)胞重編程方法的啟示，2006年Takahashi等［25］選擇24種在小鼠早期胚胎、ESCs或腫瘤細(xì)胞中豐富表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)組合、篩選，發(fā)現(xiàn)用Oct4、Sox2、c－Myc和Klf4四個(gè)因子可有效地將胎鼠成纖維細(xì)胞和小鼠尾尖成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)成形態(tài)和生長(zhǎng)特性類似ESCs的克隆，即iPSCs。Thomason等使用慢病毒介導(dǎo)Oct4、Sox2、Nanog和Lin28四個(gè)因子獲得了人的iPSCs［26］，但得到的iPSCs不能形成成年的嵌合體小鼠，且沒(méi)有生殖系轉(zhuǎn)移（germline transmission）的能力，而這是鑒定多能干細(xì)胞的嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)之一。隨后發(fā)現(xiàn)其原因是使用了Fbx15啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的新霉素抗性基因來(lái)篩選iPSCs，F(xiàn)bx15在ESCs中表達(dá)量較高，但在自我更新和多潛能性的維持中不是必需的［27］。改進(jìn)的篩選系統(tǒng)［28－29］以O(shè)ct4和Nanog取代Fbx15，得到既高效嵌合成年小鼠、又參與形成生殖系細(xì)胞的iPSCs，并獲得了iPSCs衍生的后代小鼠。

猴和豬體形與人相仿，器官大小、結(jié)構(gòu)和功能最適合人體移植，因此在小鼠iPSCs的基礎(chǔ)上陸續(xù)又建立了猴［30］、大鼠［31－32］和豬［33］的iPSCs。此外，大鼠ESCs很難獲得，大鼠iPSCs在ESCs未建系的情況下建立，為大鼠的轉(zhuǎn)基因模式動(dòng)物的建立奠定了基礎(chǔ)。

3 重編程方法的優(yōu)化

根據(jù)基因?qū)敕绞降牟煌鼐幊谭椒煞譃椴《据d體和非病毒載體兩類。病毒載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和慢病毒載體，其優(yōu)點(diǎn)是誘導(dǎo)效率高（如新生兒包皮成纖維細(xì)胞重編程效率高達(dá)0.01%［26］），缺點(diǎn)是外源因子永久整合基因組，有插入突變風(fēng)險(xiǎn)。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體一般只能轉(zhuǎn)染分裂旺盛的細(xì)胞，腺病毒載體可實(shí)現(xiàn)外源基因的瞬時(shí)表達(dá)，但仍有外源基因的整合。非病毒載體的方法包括使用脂質(zhì)體或piggyBac轉(zhuǎn)座子載體、mRNA或microRNA轉(zhuǎn)染、蛋白質(zhì)直接介導(dǎo)、小分子化合物聯(lián)用等。重編程效率低和外源基因整合的風(fēng)險(xiǎn)是上述方法面臨的共同難題。

3.1 提高安全性

病毒載體介導(dǎo)的誘導(dǎo)方式由于插入突變而具有誘發(fā)腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)。非病毒載體的誘導(dǎo)方式包括2A肽非病毒轉(zhuǎn)染法［34］、誘導(dǎo)性表達(dá)載體法［35］、Cre／LoxP重組切除法［36］及PB轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)法［37］等。其中Cre不能介導(dǎo)載體完全切除，而PB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)可將外源DNA徹底清除，是一種更安全的方法。但是目前完全避免使用病毒或轉(zhuǎn)座子的方法如非整合腺病毒［38］、脂質(zhì)體［39］和非插入型的附加體（episomal）［40］等轉(zhuǎn)染效率極低，還需要尋找更有效的誘導(dǎo)方法。

某些細(xì)胞已表達(dá)特定因子，因此只需導(dǎo)入其它幾個(gè)即可完成重編程過(guò)程。研究表明Oct4和Klf4雙因子［41－42］或Oct4單因子［43］均可建立iPSCs。有研究證明小分子化合物可替代轉(zhuǎn)錄因子，如組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶G9a的抑制劑BIX－01294可替代Oct4［44］，隨后發(fā)現(xiàn)BIX－01294和BayK8644協(xié)同Oct4和Klf4［45］、組蛋白去乙酰化酶抑制劑丙戊酸（valproic acid，VPA）協(xié)同Oct4和Sox2可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞重編程［46］。

更安全的重編程方式是不涉及任何基因修飾，目前僅有蛋白介導(dǎo)的方式。2009年Zhou等［47］利用細(xì)胞穿膜肽11R引導(dǎo)四因子的重組蛋白并聯(lián)合使用VPA成功重編程鼠成纖維細(xì)胞，但重編程效率僅0.001%。

3.2 提高重編程的效率

轉(zhuǎn)染效率低及重編程本身的隨機(jī)性是誘導(dǎo)效率提高的瓶頸。重編程效率與外源因子的誘導(dǎo)水平、內(nèi)源相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平、其它因子過(guò)表達(dá)或RNAi表達(dá)能力等生物因素有關(guān)，也與化學(xué)物質(zhì)使用、物理刺激和細(xì)胞培養(yǎng)條件等非生物因素有關(guān)。最初iPSCs建系效率只有0.02%［25］，而減少轉(zhuǎn)錄因子以降低腫瘤風(fēng)險(xiǎn)的策略導(dǎo)致重編程效率更低、時(shí)程更長(zhǎng)，即使所有四因子同時(shí)使用時(shí)最多也只能達(dá)到2%［35，48］，短時(shí)間內(nèi)不能得到足量的細(xì)胞嚴(yán)重阻礙著iPSCs的臨床應(yīng)用。目前提高重編程效率的途徑主要包括篩選小分子化合物、細(xì)胞類型和探索新的誘導(dǎo)因子幾個(gè)方面。小分子化合物除了BIX－01294［44］和VPA［46］，DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5－aza－cytidine（AZA）［49］、丁酸鹽（butyrate）［50］、組蛋白脫乙?；敢种苿┒∷徕c和TGF－β信號(hào)抑制劑SB431542［51］和糖原合成酶（glycogensynthase kinase－3，GSK－3）抑制劑CHIR990213［52］都能提高重編程效率，其中VPA可提高100多倍。

細(xì)胞類型也是影響重編程效率的重要因素。除了小鼠成纖維細(xì)胞，胃和肝細(xì)胞［34］、神經(jīng)干細(xì)胞［41］、胰腺β細(xì)胞［53］、終末分化的B淋巴細(xì)胞［35］等重編程效率各不相同［41－43］。胃和肝細(xì)胞產(chǎn)生的iPSCs的成瘤性明顯低于皮膚成纖維細(xì)胞［34］。人源iPSCs的報(bào)道較少，除成纖維細(xì)胞外，已有報(bào)道的源細(xì)胞包括人的血液CD34細(xì)胞［54］和皮膚角質(zhì)細(xì)胞［55］。逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)四因子重編程青少年角化細(xì)胞的效率比成纖維細(xì)胞高100多倍，而且時(shí)程縮短近一半［55］。

蛋白介導(dǎo)重編程的效率低是因?yàn)榈鞍讓?dǎo)入細(xì)胞的效率低，因此尋找導(dǎo)入效率更高的誘導(dǎo)因子如RNA有望解決此問(wèn)題。Warren等［56］使用四因子的mRNA誘導(dǎo)時(shí)程縮短一半，效率提高了100多倍。miR－302和miR－367也有相似的效果［57］，原因可能是通過(guò)激活Oct4并抑制組蛋白脫乙酰基酶HDAC2而促進(jìn)iPSCs的形成。另外利用siRNA干擾抑癌基因p53能顯著提高重編程效率，同時(shí)下調(diào)p53和過(guò)量表達(dá)UTF1甚至可替代c－Myc并提高效率100倍［58］，p53缺失時(shí)僅需Oct4、Sox2雙因子［59］。但是缺失關(guān)鍵抑癌基因的方法將增加基因組的不穩(wěn)定性或誘導(dǎo)腫瘤的產(chǎn)生，可能帶來(lái)得不償失的風(fēng)險(xiǎn)，這提示研究者提高重編程的效率要與iPSCs的安全性兼顧。

物理微環(huán)境和機(jī)械張力影響間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）分化的證據(jù)越來(lái)越多，因此除了生物因素，細(xì)胞培養(yǎng)條件等物理因素對(duì)細(xì)胞重編程過(guò)程的調(diào)控也有必要進(jìn)行研究。航天特殊環(huán)境如微重力、低氧可能影響重編程的效率。已有研究表明低氧條件可以提高重編程效率，促進(jìn)ESCs向視網(wǎng)膜前體細(xì)胞分化［60－61］，但是ESCs或iPSCs對(duì)機(jī)械刺激的響應(yīng)幾乎未見(jiàn)報(bào)道。

4 應(yīng)用

隨著基礎(chǔ)研究的不斷深入，iPSCs在疾病模型構(gòu)建、藥物篩選、細(xì)胞治療中的應(yīng)用效果顯著。利用iPSCs獲得人體特異細(xì)胞或組織是應(yīng)用的最終目標(biāo)。

4.1 疾病模型構(gòu)建

Jaenisch博士首次用小鼠iPSCs建立人疾病模型［62］，并用于治療人性化的鐮刀型貧血癥小鼠模型和帕金森病大鼠模型，從理論和實(shí)踐上為人類單基因遺傳疾病治療奠定基礎(chǔ)，也證明了iPSCs治療復(fù)雜疾病的可能性。2009年Ebert等［63］利用患者成纖維細(xì)胞重編程的iPSCs成功再現(xiàn)脊髓性肌萎縮癥（spinal muscular atrophy，SMA）進(jìn)行性變性的過(guò)程。82歲高齡的女性肌萎縮性側(cè)索硬化癥（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）病人的成纖維細(xì)胞重編程的iPSCs可獲得疾病特異性的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元［64］，證明慢性病老年患者也可以直接從iPSCs獲得疾病特異性模型。用人iPSCs還建立了女性流行性神經(jīng)發(fā)育疾病Rett綜合癥（Rett syndrome，RTT）［65］、致命性亨廷頓病（Huntington′s disease HD）［66］、X－連鎖隱性遺傳病進(jìn)行性假肥大性肌營(yíng)養(yǎng)不良（duchenne muscular dystrophy，DMD）［67］、21三體導(dǎo)致的特瓦綜合癥（down syndrome，DS）［68］、豹皮綜合癥［69］、人I型糖尿?。?0］、骨髓增生?。╩yeloproliferative disorders，MPDs）［71］、范可尼貧血癥［71］、肝?。?2］、家族性植物神經(jīng)功能障礙癥（falilial dysautonomia，F(xiàn)D）［73］等疾病模型，為發(fā)病機(jī)制和新穎高效治療方法的研究提供了有利條件。

建立人iPSCs疾病模型首先要選擇取材安全、方便的體細(xì)胞，不同體細(xì)胞來(lái)源的iPSCs保留供體細(xì)胞的基因印跡，而且轉(zhuǎn)錄、表觀遺傳和分化能力均有所差異，因此有必要評(píng)價(jià)不同體細(xì)胞來(lái)源的iPSCs差異性對(duì)疾病模型的安全性、有效性的影響。

4.2 藥物篩選

目前已使用疾病特異性的iPSCs模型對(duì)FD候選藥物激動(dòng)素Kinetin［73］、針對(duì)SMA患者提高SMN蛋白水平的藥物VPA和tobramycin、抗血管生成藥物Azumanaid ESCs進(jìn)行了評(píng)價(jià)，可對(duì)iPSCs分化的功能細(xì)胞進(jìn)行藥物效果的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，為個(gè)性化藥物篩選和藥效研究提供了廣闊的平臺(tái)。

4.3 細(xì)胞治療

除了建立疾病模型外，患者個(gè)體化的iPSCs進(jìn)行遺傳修飾之后定向分化健康細(xì)胞來(lái)進(jìn)行細(xì)胞移植，理論上可以治療任何遺傳性疾病和退行性疾病。目前通過(guò)人iPSCs治療神經(jīng)系統(tǒng)疾?。?3－64］、I型糖尿?。?4］、肝病、腎病等的效果都已經(jīng)在動(dòng)物模型中得到驗(yàn)證，人ESCs已進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)。

5 在航天醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

航天飛行導(dǎo)致一系列生理性改變的主要原因是微重力條件，因此研究微重力效應(yīng)對(duì)細(xì)胞功能的影響，特別是對(duì)維持組織細(xì)胞更新的干細(xì)胞的活性和功能的影響，找到關(guān)鍵性靶點(diǎn)是從根本上解決航天醫(yī)學(xué)問(wèn)題的關(guān)鍵，對(duì)胚胎發(fā)育生理學(xué)也有重要意義。

研究表明，模擬微重力能抑制成體干細(xì)胞向力敏感性細(xì)胞（如成骨細(xì)胞和心肌細(xì)胞）的分化，而促進(jìn)其向力不敏感細(xì)胞（如脂肪細(xì)胞［7－8］）的分化。相對(duì)于正常的1G條件，3－D回轉(zhuǎn)器模擬微重力條件有利于維持hMSC細(xì)胞增殖和透明軟骨向分化潛能［75］、促進(jìn)肝干細(xì)胞的分化能力［3］和MSC向髓核樣細(xì)胞的分化潛能［76］，但是大梯度強(qiáng)磁場(chǎng)模擬微重力效應(yīng)抑制hMSC早期的成骨向分化［7］，回轉(zhuǎn)模擬微重力效應(yīng)也抑制hMSC成骨向分化、促進(jìn)脂肪向分化［77］。

模擬微重力條件下mESCs細(xì)胞總數(shù)減少、細(xì)胞增殖活性沒(méi)有變化、粘附減弱、DNA無(wú)損傷，但是影響輻射誘導(dǎo)損傷的修復(fù)［10］，是否對(duì)多潛能的維持和譜系分化能力產(chǎn)生影響亟待研究。局部機(jī)械力影響mESCs伸展方向，但分化后的細(xì)胞硬度增大，單個(gè)ESCs細(xì)胞中Oct4表達(dá)水平改變［78］。然而此方法或模擬微重力可否激活內(nèi)源性重編程因子、促進(jìn)重編程而成為不使用化學(xué)因子的更安全的重編程方法仍不明確。模擬微重力對(duì)干細(xì)胞干性及分化潛能的影響的研究為解決微重力性骨丟失等諸多問(wèn)題奠定了理論基礎(chǔ)，但是力學(xué)傳導(dǎo)的機(jī)制目前并不清楚。iPSCs方法的建立必將為研究胚胎發(fā)育復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制及遺傳疾病機(jī)制提供優(yōu)質(zhì)的細(xì)胞和組織模型，為解決航天醫(yī)學(xué)的基本問(wèn)題提供新的思路。

［1］Clause K C，Liu L J，Tobita K.Directed stem cell differentiation：The role of physical forces［J］.Cell Communication and Adhesion，2010，17（2）：48－54.

［2］Li J，Zhang S，Chen J，et al.Modeled microgravity causes changes in the cytoskeleton and focal adhesions，and decreases in migration in malignant human MCF－7cells［J］.Protoplasma，2009，238（1－4）：23－33.

［3］Majumder S，Siamwala J H，Srinivasan S，et al.Simulated microgravity promoted differentiation of bipotential murine oval liver stem cells by modulating BMP4／Notch1signaling［J］.J Cell Biochem，2011，112（7）：1898－1908.

［4］Huang Y，Dai Z Q，Ling S K，et al.Gravity，a regulation factor in the differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells［J］.J Biomed Sci，2009，16（1）：87－101.

［5］Gershkovich P M，Gershkovich Iu G，Buravkova L B.Expression of cytoskeleton genes in culture of human mesenchymal stromal cells in different periods of simulating the effects of microgravity［J］.Aviakosm Ekolog Med，2011，45（4）：39－41.

［6］Alison M R，Poulsom R，F(xiàn)orbes S，et al.An introduction to stem cells［J］.J Pathol，2002，197（4）：419－423.

［7］Shi D，Meng R，Deng W，et al.Effects of microgravity modeled by large gradient high magnetic field on the osteogenic initiation of human mesenchymal stem cells［J］.Stem Cell Rev，2010，6（4）：567－578.

［8］Sheyn D，Pelled G，Netanely D，et al.The effect of simulated microgravity on human mesenchymal stem cells cultured in an osteogenic differentiation system：A bioinformatics study［J］.Tissue Eng Part A，2010，16（11）：3403－3412.

［9］Dai Z Q，Wang R，Ling S K，et al.Simulated microgravity inhibits the proliferation and osteogenesis of rat bone marrow mesenchymal stem cells［J］.Cell Prolif，2007，40（5）：671－684.

［10］Wang Y，An L，Jiang Y，et al.Effects of simulated microgravity on embryonic stem cells［J］.PLoS One，2011，6（12）：e29214.

［11］Mirzapour T，Tengku A B T I，Movahedin M，et al.Stem cells research and its application：A review［J］.Jounal of Applied Science，2011，11（1）：163－173.

［12］Solter D.From teratocarcinomas to embryonic stem cells and beyond：A history of embryonic stem cell research［J］.Nat Rev Genet，2006，7（4）：319－327.

［13］Martin G R.Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1981，78（12）：7634－7638.

［14］Shamblott M J，Axelman J，Wang S P，et al.Derivation of pluripotent stem cells from cultured human primordial germ cells［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1998，95（23）：13726－13731.

［15］Rossant J.Stem cells from the mammalian blastocyst［J］.Stem Cells，2001，19（6）：477－482.

［16］Thomson J A，Itskovitz－Eldor J，Shapiro S S，et al.Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts［J］.Science，1998，282（5391）：1145－1147.

［17］Hochedlinger K，Jaenisch R.Nuclear reprogramming and pluripotency［J］.Nature，2006，441（7097）：1061－1067.

［18］Rodolfa K T，Eggan K.A transcriptional logic for nuclear reprogramming［J］.Cell，2006，126（4）：652－655.

［19］Tada M，Takahama Y，Abe K，et al.Nuclear reprogramming of somatic cells by in vitro hybridization with ES cells［J］.Curr Biol，2001，11（19）：1553－1558.

［20］Cowan C A，Atienza J，Melton D A，et al.Nuclear reprogramming of somatic cells after fusion with human embryonic stem cells［J］.Science，2005，309（5739）：1369－1373.

［21］Hansis C，Barreto G，Maltry N，et al.Nuclear reprogramming of human somatic cells by xenopus egg extract requires BRG1［J］.Curr Biol，2004，14（16）：1475－1480.

［22］Jiang Y，Jahagirdar B N，Reinhardt R L，et al.Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow［J］.Nature，2002，418（6893）：41－49.

［23］Matsui Y，Zsebo K，Hogan B L.Derivation of pluripotential embryonic stem cells from murine primordial germ cells in culture［J］.Cell，1992，70（5）：841－847.

［24］Guan K，Nayernia K，Maier L S，et al.Pluripotency of spermatogonial stem cells from adult mouse testis［J］.Nature，2006，440（7088）：1199－1203.

［25］Takahashi K，Yamanaka S.Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors［J］.Cell，2006，126（4）：663－676.

［26］Yu J，Vodyanik M A，Smuga－Otto K，et al.Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells［J］.Science，2007，318（5858）：1917－1920.

［27］Tokuzawa Y，Kaiho E，Maruyama M，et al.Fbx15is a novel target of Oct3／4but is dispensable for embryonic stem cell self－re－newal and mouse development［J］.Mol Cell Biol，2003，23（8）：2699－2708.

［28］Okita K，Ichisaka T，Yamanaka S.Generation of germline－competent induced pluripotent stem cells［J］.Nature，2007，448（7151）：313－317.

［29］Wernig M，Meissner A，F(xiàn)oreman R，et al.In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES－cell－like state［J］.Nature，2007，448（7151）：318－324.

［30］Liu H，Zhu F，Yong J，et al.Generation of induced pluripotent stem cells from adult rhesus monkey fibroblasts［J］.Cell Stem Cell，2008，3（6）：587－590.

［31］Li W，Wei W，Zhu S，et al.Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors［J］.Cell Stem Cell，2009，4（1）：16－19.

［32］Liao J，Cui C，Chen S，et al.Generation of induced pluripotent stem cell lines from adult rat cells［J］.Cell Stem Cell，2009，4（1）：11－15.

［33］Esteban M A，Xu J，Yang J，et al.Generation of induced pluripotent stem cell lines from Tibetan miniature pig［J］.J Biol Chem，2009，284（26）：17634－17640.

［34］Carey B W，Markoulaki S，Hanna J，et al.Reprogramming of murine and human somatic cells using a single polycistronic vector［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2009，106（1）：157－162.

［35］Hanna J，Markoulaki S，Schorderet P，et al.Direct reprogramming of terminally differentiated mature B lymphocytes to pluripotency［J］.Cell，2008，133（2）：250－264.

［36］Soldner F，Hockemeyer D，Beard C，et al.Parkinson′s disease patient－derived induced pluripotent stem cells free of viral reprogramming factors［J］.Cell，2009，136（5）：964－977.

［37］Kaji K，Norrby K，Paca A，et al.Virus－free induction of pluripotency and subsequent excision of reprogramming factors［J］.Nature，2009，458（7239）：771－775.

［38］Stadtfeld M，Nagaya M，Utikal J，et al.Induced pluripotent stem cells generated without viral integration［J］.Science，2008，322（5903）：945－949.

［39］Okita K，Nakagawa M，Hyenjong H，et al.Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors［J］.Science，2008，322（5903）：949－953.

［40］Yu J，Hu K，Smuga－Otto K，et al.Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences［J］.Science，2009，324（5928）：797－801.

［41］Kim J B，Zaehres H，Wu G，et al.Pluripotent stem cells induced from adult neural stem cells by reprogramming with two factors［J］.Nature，2008，454（7204）：646－650.

［42］Eminli S，Utikal J，Arnold K，et al.Reprogramming of neural progenitor cells into induced pluripotent stem cells in the absence of exogenous Sox2expression［J］.Stem Cells，2008，26（10）：2467－2474.

［43］Kim J B，Sebastiano V，Wu G，et al.Oct4－induced pluripotency in adult neural stem cells［J］.Cell，2009，136（3）：411－419.

［44］Shi Y，Do J T，Desponts C，et al.A combined chemical and genetic approach for the generation of induced pluripotent stem cells［J］.Cell Stem Cell，2008，2（6）：525－528.

［45］Shi Y，Desponts C，Do J T，et al.Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic fibroblasts by Oct4and Klf4with small－molecule compounds［J］.Cell Stem Cell，2008，3（5）：568－574.

［46］Huangfu D，Osafune K，Maehr R，et al.Induction of pluripotent stem cells from primary human fibroblasts with only Oct4and Sox2［J］.Nat Biotechnol，2008，26（11）：1269－1275.

［47］Zhou H，Wu S，Joo J Y，et al.Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins［J］.Cell Stem Cell，2009，4（5）：381－384.

［48］Maherali N，Ahfeldt T，Rigamonti A，et al.A high－efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells［J］.Cell Stem Cell，2008，3（3）：340－345.

［49］Mikkelsen T S，Hanna J，Zhang X，et al.Dissecting direct reprogramming through integrative genomic analysis［J］.Nature，2008，454（7200）：49－55.

［50］Mali P，Chou B K，Yen J，et al.Butyrate greatly enhances derivation of human induced pluripotent stem cells by promoting epigenetic remodeling and the expression of pluripotency－associated genes［J］.Stem Cells，2010，28（4）：713－720.

［51］Trokovic R，Weltner J，Manninen T，et al.Small molecule inhibitors promote efficient generation of induced pluripotent stem cells from human skeletal myoblasts［J］.Stem Cells Dev，2013，22（1）：114－123.

［52］Moraveji S F，Attari F，Shahverdi A，et al.Inhibition of glycogen synthase kinase－3promotes efficient derivation of pluripotent stem cells from neonatal mouse testis［J］.Hum Reprod，2012，27（8）：2312－2324.

［53］Stadtfeld M，Brennand K，Hochedlinger K.Reprogramming of pancreatic beta cells into induced pluripotent stem cells［J］.Curr Biol，2008，18（12）：890－894.

［54］Loh Y H，Agarwal S，Park I H，et al.Generation of induced pluripotent stem cells from human blood［J］.Blood，2009，113（22）：5476－5479.

［55］Aasen T，Raya A，Barrero M J，et al.Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes［J］.Nat Biotechnol，2008，26（11）：1276－1284.

［56］Warren L，Manos P D，Ahfeldt T，et al.Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA［J］.Cell Stem Cell，2010，7（5）：618－630.

［57］Anokye－Danso F，Trivedi C M，Juhr D，et al.Highly efficient mi－RNA－mediated reprogramming of mouse and human somatic cells to pluripotency［J］.Cell Stem Cell，2011，8（4）：376－388.

［58］Zhao Y，Yin X，Qin H，et al.Two supporting factors greatly improve the efficiency of human iPSC generation［J］.Cell Stem Cell，2008，3（5）：475－479.

［59］Kawamura T，Suzuki J，Wang Y V，et al.Linking the p53tumour suppressor pathway to somatic cell reprogramming［J］.Nature，2009，460（7259）：1140－1144.

［60］Bae D，Mondragon－Teran P，Hernandez D，et al.Hypoxia enhan－ces the generation of retinal progenitor cells from human induced pluripotent and embryonic stem cells［J］.Stem Cells Dev，2012，21（8）：1344－1355.

［61］Yoshida Y，Takahashi K，Okita K，et al.Hypoxia enhances the generation of induced pluripotent stem cells［J］.Cell Stem Cell，2009，5（3）：237－241.

［62］Hanna J，Wernig M，Markoulaki S，et al.Treatment of sickle cell anemia mouse model with iPS cells generated from autologous skin［J］.Science，2007，318（5858）：1920－1923.

［63］Ebert A D，Yu J，Rose F F，et al.Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient［J］.Nature，2009，457（7227）：277－280.

［64］Dimos J T，Rodolfa K T，Niakan K K，et al.Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons［J］.Science，2008，321（5893）：1218－1221.

［65］Kim K Y，Hysolli E，Park I H.Neuronal maturation defect in induced pluripotent stem cells from patients with Rett syndrome［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2011，108（34）：14169－14174.

［66］Juopperi T A，Kim W R，Chiang C H，et al.Astrocytes generated from patient induced pluripotent stem cells recapitulate features of Huntington′s disease patient cells［J］.Mol Brain，2012，5（1）：17.

［67］Nakahata T，Awaya T，Chang H，et al.Derivation of engraftable myogenic precursors from murine ES／iPS cells and generation of disease－specific iPS cells from patients with duchenne muscular dystrophy（DMD）and other diseases［J］.Rinsho Shinkeigaku，2010，50（11）：889.

［68］Mou X，Wu Y，Cao H，et al.Generation of disease－specific induced pluripotent stem cells from patients with different karyotypes of Down syndrome［J］.Stem Cell Res Ther，2012，3（2）：14.

［69］Carvajal－Vergara X，Sevilla A，D′Souza S L，et al.Patient－specific induced pluripotent stem－cell－derived models of LEOPARD syndrome［J］.Nature，2010，465（7299）：808－812.

［70］Maehr R，Chen S，Snitow M，et al.Generation of pluripotent stem cells from patients with type 1diabetes［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2009，106（37）：15768－15773.

［71］Ye Z，Zhan H，Mali P，et al.Human－induced pluripotent stem cells from blood cells of healthy donors and patients with acquired blood disorders［J］.Blood，2009，114（27）：5473－5480.

［72］Choi S M，Kim Y，Liu H，et al.Liver engraftment potential of hepatic cells derived from patient－specific induced pluripotent stem cells［J］.Cell Cycle，2011，10（15）：2423－2427.

［73］Lee G，Papapetrou E P，Kim H，et al.Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient－specific iPSCs［J］.Nature，2009，461（7262）：402－406.

［74］Jeon K，Lim H，Kim J H，et al.Differentiation and transplantation of functional pancreatic beta cells generated from induced pluripotent stem cells derived from a type 1diabetes mouse model［J］.Stem Cells Dev，2012，21（14）：2642－2655.

［75］Yuge L，Kajiume T，Tahara H，et al.Microgravity potentiates stem cell proliferation while sustaining the capability of differentiation［J］.Stem Cells Dev，2006，15（6）：921－929.

［76］Luo W，Xiong W，Qiu M，et al.Differentiation of mesenchymal stem cells towards a nucleus pulposus－like phenotype utilizing simulated microgravity in vitro［J］.J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2011，31（2）：199－203.

［77］Zayzafoon M，Gathings W E，McDonald J M.Modeled microgravity inhibits osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells and increases adipogenesis［J］.Endocrinology，2004，145（5）：2421－2432.

［78］Chowdhury F，Na S，Li D，et al.Material properties of the cell dictate stress－induced spreading and differentiation in embryonic stem cells［J］.Nat Mater，2010，9（1）：82－88.