免疫膠體金技術(shù)的應(yīng)用與展望

陳俊彥，肖瓊

免疫膠體金技術(shù)的應(yīng)用與展望

陳俊彥，肖瓊

(南京信息工程大學(xué)濱江學(xué)院，南京 210044)

免疫膠體金技術(shù)是一種新型固相標(biāo)記免疫檢測(cè)技術(shù)，因其獨(dú)特的性質(zhì)在許多領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用和快速發(fā)展。簡述了免疫膠體金技術(shù)在電鏡、光鏡快速檢測(cè)診斷中的發(fā)展以及在生物醫(yī)學(xué)、免疫組織化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域的研究和應(yīng)用。未來免疫膠體金技術(shù)在提高膠體金制備質(zhì)量的同時(shí)將實(shí)現(xiàn)定量和多元化檢測(cè)。

免疫膠體金技術(shù)；快速診斷；生物醫(yī)學(xué)；應(yīng)用

免疫膠體金技術(shù)(immune colloidal gold technique，ICG)是以膠體金為標(biāo)記物，利用特異性抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行的固相標(biāo)記免疫檢測(cè)技術(shù)。繼熒光素、放射性同位素和酶檢測(cè)技術(shù)之后，免疫膠體金技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)、免疫組織化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等研究領(lǐng)域。

1971年Faulk等［1］首次將膠體金與抗體結(jié)合應(yīng)用于免疫電鏡，研究沙門菌壁細(xì)菌表面抗原的分布。1977年Geoghegan等［2］應(yīng)用免疫膠體金染色技術(shù)(immuno-gold staining，IGS)，在光鏡水平檢測(cè)B淋巴細(xì)胞表面膜免疫球蛋白。1983年Holgatet等［3］在膠體金染色的基礎(chǔ)上，增加了銀顯影技術(shù)，免疫金銀染色技術(shù)(immuno-gold silver staining，IGSS)取代了傳統(tǒng)的熒光素和酶等物質(zhì)。隨著研究的不斷深入，以肉眼觀察水平的免疫膠體金快速診斷技術(shù)在快速檢測(cè)中得到了廣泛的應(yīng)用和發(fā)展［4］。

1 免疫膠體金技術(shù)的基本原理

膠體金是氯金酸(chloroaurie acid，HAuCl4)在還原劑(白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉和鞣酸等)作用下，聚合成帶負(fù)電的疏水膠溶液。膠體以金顆粒為核，表面吸附AuCl4-和H+雙層離子，與蛋白質(zhì)分子及其它非共價(jià)的生物大分子(毒素、酶、抗生素、激素、多肽等)正電荷基團(tuán)形成靜電結(jié)合，且不影響其生物特性［5］。膠體金標(biāo)記技術(shù)實(shí)質(zhì)上就是蛋白質(zhì)分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程［6］。

利用還原法從氯金酸溶液中可制備直徑1～150 nm大小不同的膠體金顆粒。溶膠的顏色與粒徑大小相對(duì)應(yīng)：5～20 nm溶膠呈葡萄酒紅色；20～40 nm液體為深紅色；60 nm以上金溶液呈紫紅色［7］。在適宜條件下，抗原和抗體與膠體金顆粒反應(yīng)產(chǎn)生聚集，達(dá)到一定的密度時(shí)，大量聚集的標(biāo)記物顯示出肉眼可見的紅色或粉紅色斑點(diǎn)。因此免疫膠體金技術(shù)在基礎(chǔ)研究和檢驗(yàn)檢疫中定性或半定量的快速檢測(cè)中得到廣泛的應(yīng)用［8］。

2 免疫膠體金在電鏡水平的應(yīng)用

免疫膠體金電鏡技術(shù)是在分子水平上對(duì)細(xì)胞抗原進(jìn)行形態(tài)學(xué)研究較為理想的方法［9］，其最大優(yōu)點(diǎn)是通過不同大小金顆?；蚪Y(jié)合酶標(biāo)進(jìn)行雙標(biāo)記或多標(biāo)記，在同一標(biāo)本上顯示兩種不同抗原，有助于細(xì)胞內(nèi)生物活性物質(zhì)的定位，同時(shí)觀察不同抗原及受體在細(xì)胞表面和細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的定位，了解細(xì)胞組織中的相互關(guān)系及代謝過程［10-11］。Jia等［12］應(yīng)用免疫膠體金電鏡技術(shù)對(duì)蠶豆葉片細(xì)胞研究，發(fā)現(xiàn)蠶豆幼嫩葉片和成熟葉片葉肉細(xì)胞中金顆粒分布的不同。陳以峰［13］等研究發(fā)現(xiàn)煙草受精前后卵細(xì)胞內(nèi)吲哚乙酸(IAA)的分布變化。

膠體金顆粒具有很高的致密性，有利于超微結(jié)構(gòu)的觀察，病毒顆粒的檢出數(shù)比直接電鏡法高100～300倍，是免疫電鏡的最佳標(biāo)記物［14］。免疫膠體金顆粒應(yīng)用于病毒抗原的檢測(cè)顯示出無可比擬的優(yōu)越性，已成為病毒形態(tài)學(xué)和抗原特性研究的有效手段。謝希賢等［15］研究對(duì)蝦白斑綜合癥病毒蛋白VP24，發(fā)現(xiàn)核衣殼未見標(biāo)記金顆粒，完整病毒粒子上標(biāo)記的金顆粒很少，在囊膜部分被損的病毒粒子上可觀察到大量的金顆粒，由此認(rèn)為病毒蛋白VP24可能存在于囊膜和核衣殼之間。吳正理等［16］在被感染微孢子蟲的家蠶絲腺組織中發(fā)現(xiàn)寄生位點(diǎn)宿主組織內(nèi)存在大量金顆粒，說明寄生位點(diǎn)的宿主組織內(nèi)存在大量的孢子蛋白質(zhì)，證實(shí)了家蠶微孢子蟲在寄生過程中將許多孢子蛋白質(zhì)分泌到宿主體內(nèi)。

3 免疫膠體金在光鏡水平的應(yīng)用

應(yīng)用膠體金顆粒呈桔紅色到紫紅色的特性，在光鏡水平檢查細(xì)胞表面抗原，具有操作步驟少、制片穩(wěn)定、染色易控制，呈色鮮明的優(yōu)點(diǎn)。免疫膠體金取代了熒光素和酶等標(biāo)記物，彌補(bǔ)了因標(biāo)記物引起的本底過高和內(nèi)部酶活性干擾。為提高膠體金標(biāo)記在光鏡檢測(cè)中的靈敏度，在膠體金染色的基礎(chǔ)上增加了銀顯影，使金屬銀在金表面聚集，聚集的銀在催化作用下，更多的銀被還原，膠體金標(biāo)記的結(jié)合位點(diǎn)將被更好地觀察［17-18］。孫修勤等［19］采用IGSS技術(shù)，對(duì)中國對(duì)蝦胰臟上皮細(xì)胞內(nèi)的細(xì)小病毒(hepatopancreatic parvovirus，HPV)包涵體進(jìn)行了免疫組織化學(xué)的診斷研究，結(jié)果證明，IGSS是可應(yīng)用于中國對(duì)蝦肝胰臟細(xì)小病毒病診斷的有效方法。張鐵漢等［20］采用IGSS檢測(cè)抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體(anti-neutrophil cytoplasmic antibody，ANCA)，克服了間接免疫熒光法(indirect immunof l uorescence，IIF)易衰減的問題，用普通光鏡鏡檢，實(shí)驗(yàn)結(jié)果易于保存，便于基層醫(yī)療單位推廣。

IGSS染色法是光鏡條件下植物組織內(nèi)抗原定位的理想方法，克服了免疫酶法因植物體內(nèi)內(nèi)酶及某些物質(zhì)對(duì)反應(yīng)產(chǎn)生干擾而出現(xiàn)反應(yīng)產(chǎn)物擴(kuò)散現(xiàn)象，導(dǎo)致定位效果不理想的缺點(diǎn)。免疫熒光法因植物組織內(nèi)有自發(fā)熒光干擾，特別是在抗原量低時(shí)，自發(fā)熒光強(qiáng)于特異性熒光，致使觀察困難。馮家望［21］應(yīng)用IGSS染色法對(duì)水稻稻種細(xì)菌性條斑病進(jìn)行了組織免疫定位，取得了良好的結(jié)果。

在病理學(xué)診斷中，IGSS染色法具有高敏感性和高特異性，可以準(zhǔn)確地對(duì)病變組織進(jìn)行定位和定性。張鐵漢等［22］應(yīng)用IGSS染色法，建立了光鏡水平檢測(cè)血清抗核抗體，使基層醫(yī)院自身免疫性疾病的診斷得到開展，將IGSS染色法的應(yīng)用從形態(tài)學(xué)診斷提高到免疫學(xué)水平。

4 免疫膠體金快速診斷技術(shù)的應(yīng)用

免疫膠體金快速診斷技術(shù)是建立在酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、乳膠凝聚試驗(yàn)、單克隆抗體技術(shù)和免疫金標(biāo)記技術(shù)基礎(chǔ)上，以膠體金為標(biāo)記物，通過肉眼直接觀察判斷結(jié)果。該法具有操作簡單快速，特異性強(qiáng)，檢出限低，結(jié)果判斷直觀、準(zhǔn)確和無污染的優(yōu)點(diǎn)。在臨床醫(yī)學(xué)檢測(cè)、動(dòng)植物檢疫、食品安全檢測(cè)、藥物殘留的快速檢測(cè)以及抗原抗體檢測(cè)等領(lǐng)域發(fā)展迅速。目前應(yīng)用最為廣泛的是斑點(diǎn)免疫金滲濾法(dot immunogold fi ltration assay，DIGFA)和膠體金免疫層析法(golloidal gold immunochromatographic assay，GIGA)。

4.1 斑點(diǎn)免疫金滲濾法

DIGFA采用膠體金為標(biāo)記物，以硝酸纖維素膜(NC膜)為固相載體，將試劑和樣本滴加在膜上，通過滲濾使抗原抗反應(yīng)，洗滌后用膠體金標(biāo)記的抗體檢測(cè)相應(yīng)的抗原或抗體，陽性結(jié)果在膜上呈紅色斑點(diǎn)。

大腸埃希菌(enterohemorrhagic eschetichia coli)是引起人類食物中毒的腸道致病菌。諶志強(qiáng)等［23］應(yīng)用大腸埃希菌O157：H7多克隆抗體包被膠體金制備探針，大腸埃希菌O157：H7菌懸液的檢測(cè)下限達(dá)到3.1×106CFU／mL，具有很強(qiáng)的特異性，適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

旋毛蟲病(trichinosis)是由旋毛蟲寄生于動(dòng)物體內(nèi)引起的一種較常見的人獸共患寄生蟲病。候小君等［24］建立Ts21重組蛋白——斑點(diǎn)免疫金滲濾法(Ts21-dot immunogoldfi ltration assay，Ts21-DIGFA)，檢測(cè)結(jié)果顯示，Ts21-DIGFA對(duì)人類旋毛蟲感染者血清抗體的敏感性為94.73%，特異性為86.96%；豬血清抗體的敏感性88.89%，特異性100%。小鼠感染旋毛蟲4～6周后，血清抗體的檢出率均為100%。整個(gè)操作過程僅需3 min，適用于人和動(dòng)物旋毛蟲病的快速血清學(xué)診斷及流行病學(xué)調(diào)查。

赤羽病(akabane disease，AKAD)又稱阿卡斑病，是由阿卡斑病毒(akabane virus，AKAV)引起家畜感染的病毒性傳染病，是我國動(dòng)物疾病防控和國際動(dòng)物貿(mào)易中重點(diǎn)檢疫的7種疫病之一。張吉紅等［25］應(yīng)用DIGFA檢測(cè)赤羽病抗體，提純AKAV抗原的最佳點(diǎn)樣質(zhì)量濃度為0.099 mg／mL，包被NCM膜，5 min判定結(jié)果，具有較好的特異性、重復(fù)性和穩(wěn)定性，該法有利于基層動(dòng)物防疫工作中AKAV病毒的發(fā)現(xiàn)和診斷。

4.2 膠體金免疫層析法

膠體金免疫層析(GICA)法是將膠體金標(biāo)記技術(shù)、層析分析技術(shù)和免疫檢測(cè)技術(shù)等多種方法結(jié)合，具有結(jié)果清晰，無污染，攜帶方便等優(yōu)點(diǎn)的快速免疫分析方法［26］。在免疫滲濾法的基礎(chǔ)上，Beggs等［27］建立了檢測(cè)人尿和血清中絨毛膜促性腺激素(HCG)的GICA法。從此GICA檢測(cè)技術(shù)在臨床檢測(cè)、毒品檢測(cè)、微生物檢測(cè)、農(nóng)獸藥殘留和食品檢測(cè)等方面得到廣泛應(yīng)用［28］。

炭疽芽孢桿菌(bacillus anthraris)是牧區(qū)食草動(dòng)物常見炭疽病的病原菌，也是人獸共患疾病的病原菌之一，在軍事上被列為頭號(hào)生物戰(zhàn)劑。李偉等［29］利用GICA技術(shù)，采用雙抗夾心法，15～20 min可觀察結(jié)果，敏感性為1×106CFU／mL，反應(yīng)體系中芽孢最低檢測(cè)出8×l04個(gè)，滋養(yǎng)體細(xì)胞檢測(cè)敏感性為1×107CFU／mL，與同屬菌株特異性評(píng)價(jià)結(jié)果均為陰性。該法具有樣品處理方法簡便，操作靈活，結(jié)果判斷直觀，適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的特點(diǎn)，尤其是對(duì)生物恐怖襲擊的含炭疽芽孢的白色粉末檢測(cè)。

腹瀉性貝毒(diarrhetic shellf i sh poisoning，DSP)是一類分布較廣的赤潮毒素，嚴(yán)重威協(xié)著人類的健康和安全。劉仁沿等［30］利用膠體金標(biāo)記細(xì)胞融合技術(shù)，建立GIGA法快速檢測(cè)腹瀉性貝毒軟海綿酸，檢出限為12 ng／mL，時(shí)間為15 min，不受其它因素干擾，完全滿足規(guī)定閾值。

磺胺類藥物(sulfonamides，SAs)在中國、歐盟和美國均為動(dòng)物飼養(yǎng)過程中限制使用的藥物，動(dòng)物源性食品中的最高殘留限量(MRL)為0.1 mg／kg。韓靜等［31］采用GICA檢測(cè)動(dòng)物源食品中磺胺異口惡唑(SIZ)、磺胺噻唑(STZ)、磺胺對(duì)甲氧嘧啶(SME)、磺胺甲二唑(SMT)、磺胺氯噠嗪(SCPA) 5種磺胺類藥物殘留。以肉眼觀察檢測(cè)線顏色變化判斷結(jié)果，視覺檢測(cè)限為0.01 mg／kg，檢測(cè)時(shí)間為10 min，具有較高的靈敏度和特異性，操作快速簡單，結(jié)果穩(wěn)定可靠，可作為現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控的有效篩檢手段。

食品中常見的致病菌有大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、霍亂弧菌等，食源性致病菌和毒素的快速檢測(cè)是食品安全監(jiān)管的有效手段。高成秀等［32］建立大腸桿菌O157和志賀毒素(shiga toxin，Stx2)的雙抗夾心膠體金免疫層析法，大腸桿菌O157敏感性為1×105CFU／mL，特異性為87.5%；Stx2檢測(cè)下限為200 μL細(xì)胞培養(yǎng)液，特異性為50.0%。王中民等［33］采用GIGA法建立了沙門菌的快速檢測(cè)，靈敏度達(dá)2.1×106CFU／mL，檢測(cè)結(jié)果無差異。

葡萄球菌C型腸毒素(staphyloccucal enterotoxin C，SEC)是金黃色葡萄球菌(staphyloccucal aureus)蛋白質(zhì)外毒素的常見血清型毒素。楊麗君等［34］研制了GICA檢測(cè)試紙用于葡萄球菌C型腸毒素的檢測(cè)，靈敏度達(dá)10.0 ng／mL，在5～10 min內(nèi)完成檢測(cè)，肉眼判斷結(jié)果，該法是現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的最佳方法。

5 免疫膠體金技術(shù)的展望

5.1 提高膠體金的制備質(zhì)量

免疫膠體金技術(shù)是以膠體金顆粒為標(biāo)記物，因此制備大小均勻、分散度好的膠體金顆粒在檢測(cè)中至關(guān)重要。金顆粒的形狀不規(guī)則或顆粒不均勻，使膠體金標(biāo)記物容易解離和沉淀，導(dǎo)致金標(biāo)記物擴(kuò)散不完全和假陽性；金顆粒直徑的變異范圍太大也會(huì)影響試驗(yàn)的穩(wěn)定性和重復(fù)性。因此除了確保試劑質(zhì)量，膠體金制備過程中的每個(gè)細(xì)節(jié)都很重要，如認(rèn)真做好操作環(huán)境和容器的清潔；根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康倪x擇膠體金的粒徑，依據(jù)粒徑確定還原劑；改善膠體金制備工藝，以獲得尺寸合適、形狀均勻的膠體金。

5.2 提高檢測(cè)靈敏度，拓寬檢測(cè)范圍

提高檢測(cè)靈敏度的關(guān)鍵是對(duì)捕獲信號(hào)進(jìn)行放大。大多數(shù)檢測(cè)樣品的檢測(cè)水平可以達(dá)到1.0 ng／mL或更小的量，而許多待分析物對(duì)金標(biāo)記無法達(dá)到肉眼視覺的敏感性。利用銀增強(qiáng)金標(biāo)記強(qiáng)度，可獲得增加100倍的檢測(cè)敏感性。小量的銀沉降量適用于電鏡觀察，大量的沉降量可以直接用肉眼觀察。

金和銀自身不產(chǎn)生熒光，在金染色和金銀染色的基礎(chǔ)上，聯(lián)合使用熒光標(biāo)記，可以使彩色影象鮮明，有效增強(qiáng)信號(hào)的響應(yīng)。采用新的標(biāo)記物或引入生物親和素系統(tǒng)(BSA)等措施，同時(shí)結(jié)合相應(yīng)的生物傳感器和電化學(xué)設(shè)備等，對(duì)靶信號(hào)染色標(biāo)記，可拓寬檢測(cè)范圍［35-37］。實(shí)現(xiàn)多重標(biāo)記，對(duì)組織化學(xué)和免疫化學(xué)進(jìn)行研究將是強(qiáng)有力的技術(shù)方法。

5.3 實(shí)現(xiàn)半定量或定量檢測(cè)

快速檢測(cè)以定性為主，主要檢測(cè)樣品中是否存在某種特定成分，結(jié)果僅顯示陽性或陰性。隨著檢測(cè)要求的不斷提高，很多檢測(cè)需要確定特定分析物含量。免疫膠體金快速診斷技術(shù)，通過檢測(cè)線結(jié)合已知定量的分析物，產(chǎn)生溫度計(jì)式的條帶梯度，達(dá)到定量或半定量的檢測(cè)目的［38］。視覺上將測(cè)試結(jié)果分為陰性、弱陽性、中陽性和強(qiáng)陽性，以提供定量或半定量的檢測(cè)結(jié)果。

5.4 實(shí)現(xiàn)多元化檢測(cè)

多元化檢測(cè)是指一次檢測(cè)可同時(shí)得到多個(gè)結(jié)果，對(duì)于聯(lián)合檢測(cè)具有較高應(yīng)用價(jià)值。采用多膜復(fù)合或單膜多元受體固定的方式，是實(shí)現(xiàn)多元檢測(cè)的有效方法。Buechler等［36］研制了在同一膜上包被多元抗體，可同時(shí)檢測(cè)7種藥物的免疫層析試紙條。

6 結(jié)語

免疫膠體金技術(shù)具有單份檢測(cè)、簡單快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高，無需輔助試劑和特殊儀器，以及肉眼觀察結(jié)果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可長期保存等優(yōu)點(diǎn)，是其它免疫學(xué)方法無可比似的。隨著該技術(shù)應(yīng)用范圍的擴(kuò)展，進(jìn)一步提高檢測(cè)靈敏度和可重復(fù)性，實(shí)現(xiàn)半定量、定量和多元檢測(cè)是免疫膠體金技術(shù)未來的發(fā)展方向。

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Application and Prospect of Immune Colloidal Gold Technique

Chen Junyan，Xiao Qiong
(Nanjing University of Information Science & Technology, Bin Jiang Institute，Nanjing 210044，China)

Immune colloidal gold technique is a new kind of solid phase marked immune detection technology，it is widely applied in many fi elds and developed rapidly owe to its unique characteristics. The research and application of the immune colloidal gold technique in the rapid diagnosis with electron microscope，light microscope，and the fi eld of biomedical，immunohistochemical and cell biology were brief l y discussed. In the future，the technique of immune colloidal gold will improve the quality of colloid gold and achieve quantitative and diversity detection at the same time.

immune colloidal gold technique; rapid diagnosis; biomedical; application

O657

A

1008-6145(2014)01-0101-04

聯(lián)系人：肖瓊；E-mail: jc3293@humboldt.edu

2013-11-12

10.3969／j.issn.1008-6145.2014.01.030