惡性胸腔積液中腫瘤細胞及其相關(guān)因子的檢測及應(yīng)用

馬雪曼綜述 張培彤審校

胸腔積液是惡性腫瘤臨床常見的并發(fā)癥之一，幾乎所有的惡性腫瘤(除原發(fā)腦腫瘤)均可以引起胸腔積液。在成人胸腔積液中，我國報告25%～30%為癌性胸腔積液，國外報告為25%～53%[1]。因此其良惡性的鑒別至關(guān)重要，而鑒別的關(guān)鍵在于胸腔積液中是否存在腫瘤細胞。腫瘤細胞的浸潤在惡性胸腔積液的產(chǎn)生中起著重要作用，同時它也是多種惡性腫瘤診斷與鑒別診斷的重要依據(jù)[2]。除此之外，胸腔積液腫瘤細胞相關(guān)的因子檢測在胸腔積液臨床診療中亦有重要的指導(dǎo)意義。由于胸腔積液的成分比較復(fù)雜，其中腫瘤細胞的數(shù)量較少，為胸腔積液良惡性的鑒別帶來了困難，同時胸腔積液中各種相關(guān)成分的臨床意義有待闡明。

1 胸腔積液腫瘤細胞的富集方法

胸腔積液腫瘤細胞的富集方法從最初的密度梯度離心法不斷改進，引入了新的技術(shù)和儀器，其特異性、敏感性、有效性都得到了提高。1983年Nagasawa等[3]首次將密度梯度離心法應(yīng)用于胸腔積液腫瘤細胞的富集，這種分離過程既簡單易行又高效，即用三密度層(1.050，1.080和1.124 g/ml)Percoll不連續(xù)密度梯度分離液對肺癌患者的胸腔積液進行細胞分離，離心后惡性細胞高度富集在1.050 g/ml的細胞層，位于1.080 g/ml的細胞層主要是白細胞和小部分腫瘤細胞，所有的紅細胞分布于1.124 g/ml層。有學(xué)者[4]在密度梯度離心法的基礎(chǔ)上進行改進，使用二次離心法對肺癌胸腔積液中的腫瘤細胞進行分離，初次分離的細胞經(jīng)過孵育后再分離能提高腫瘤細胞的純度，二次分離方法采用不同濃度的 percoll 液進行分離，在淋巴細胞幾乎被除去的同時可有效濾除凋亡及死亡細胞，提高腫瘤細胞的活力。近年來，半自動激光捕獲顯微切割技術(shù)被引入到胸腔積液轉(zhuǎn)移性肺腺癌細胞的檢測和富集，此項技術(shù)在選擇腫瘤細胞時有較高的靈敏度，因其是半自動的，所以僅需要最低限度的人工技術(shù)監(jiān)督[5]。Yang 等[6]應(yīng)用免疫磁珠法對惡性胸腔積液腫瘤細胞進行了陰性富集，將DAPI標記的A549細胞添加到20 ml心衰患者的胸腔積液中，腫瘤細胞回收率為81%，而利用密度梯度離心法的腫瘤細胞回收率僅為61%，其效率遠低于免疫磁珠法。在國內(nèi)外學(xué)者對富集方法的不斷改進下，胸腔積液腫瘤細胞的獲得率及獲得數(shù)量得到有效提高，同時達到了純化腫瘤細胞的目的，而高科技方法的引入也使得這一過程簡便易行。

2 胸腔積液腫瘤細胞及其相關(guān)因子在惡性腫瘤診斷中的應(yīng)用

2.1 細胞學(xué)診斷

在胸腔積液的良惡性鑒別中細胞學(xué)診斷是最常用的方法，為證明該方法的有效性，Segal 等[7]通過一項歷時20年的調(diào)查，面向6285名胸腔積液患者，其中815例診斷為癌性胸腔積液，在癌性胸腔積液中517例完成了胸腔積液細胞學(xué)診斷(63%)，377/517例進行了病理學(xué)明確診斷，得出胸腔積液標本細胞學(xué)診斷絕對靈敏度為73%。因此我們可以認為胸腔積液標本細胞學(xué)診斷是1種有效的、微創(chuàng)的、經(jīng)濟的癌性胸腔積液診斷方法。細胞學(xué)診斷的方法包括涂片染色法、免疫熒光法、免疫細胞化學(xué)法和基因檢測法。

2.1.1 涂片染色法 通過涂片染色法觀察細胞形態(tài)是細胞學(xué)診斷的基礎(chǔ)，因其操作簡便、重復(fù)性高、成本低廉而被普遍使用。梁家銀等[8]對病因不明的439例胸腔積液進行了細胞學(xué)檢查，用胸腔積液沉淀物涂片做HE染色和瑞氏染色，共查出惡性腫瘤118例，陽性檢出率為62.8%。在118例中，腺癌96例，占 81.63%；鱗癌4例，占3.93%；分類不明癌15例，占12.17%；其它惡性腫瘤3例，占2.45%。胸腔積液惡性腫瘤細胞中腺癌占大多數(shù)。胸腔積液中腺癌細胞陽性檢出率女性明顯高于男性。瑞氏染色和HE染色結(jié)合不僅可正確分別細胞學(xué)類型，而且可以最大限度地降低診斷的假陰性。楊茂省等[9]回顧性分析胸腔積液直接分類法和離心涂片染色分類法在臨床應(yīng)用中的不同價值，結(jié)果采用直接分類法檢測的918例胸腔積液標本，均未檢出腫瘤細胞；采用染色分類法檢測1405例胸腔積液標本，83例檢出腫瘤細胞，并得到臨床確診，由此可以認為，對于胸腔積液的常規(guī)檢查采用離心涂片染色分類法比直接分類法臨床應(yīng)用價值更高，不僅能區(qū)分結(jié)核性和化膿性胸膜炎，且能對良、惡性腫瘤早發(fā)現(xiàn)、早診斷。

2.1.2 免疫熒光法 免疫熒光法是1種通過細胞表面特異性抗原來識別腫瘤細胞的方法，用熒光染料對細胞染色后，特異性抗原能在熒光顯微鏡下發(fā)出熒光。蘇明權(quán)等[10]采用吖啶橙熒光法(AOF) 、免疫熒光法(IGF) 、血卟啉熒光法(HOF) 檢測胸腔積液腫瘤細胞，結(jié)果 11例乳腺癌中3種方法的陽性率均為100%，42例肺癌陽性率分別為95.2%、95.2%、92.8%，68例肺結(jié)核陽性檢出率分別為 4.41%、2.94%、1.47%，18 例肺部感染陽性檢出率分別為1.11%、0.55%、0，5例自發(fā)性液氣胸和5例慢性肺源性心臟病均為陰性，由此證明，3種熒光法在診斷良惡性胸腔積液及胸腔積液腫瘤細胞類型方面都有較高的臨床價值，但對良性胸腔積液類型的檢出率卻很低。

2.1.3 免疫細胞化學(xué)法 Ensani 等[11]采用免疫細胞化學(xué)的方法將3個間皮細胞抗體(D2-40，calretinin和WT-1)和2個非間皮細胞抗體(MOC-31和EMA)用于評估胸腔積液中的惡性細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)D2-40的敏感性和特異性均達到100%，被認為可以作為鑒別間皮和非間皮起源細胞的一個準確標記。Sawangpanich等[12]對胸腔積液標本采用了細胞學(xué)檢查顯示惡性有小圓藍細胞，免疫細胞化學(xué)法顯示波形蛋白陽性反應(yīng)，結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法(RT-PCR)證實存在PAX/CD56 FKHR融合轉(zhuǎn)錄本，成功為一位泰國患者確診了腺泡狀橫紋肌肉瘤。

2.1.4 基因檢測法 抑癌基因和促癌基因的激活與失活在癌癥的發(fā)展中起著重要作用，因此胸腔積液細胞的基因檢測有助于胸腔積液的良惡性診斷。Li等[13]探討了脆性組氨酸三聯(lián)體(FHIT)及p16 mRNA的缺失、K-ras基因突變在良惡性胸腔積液中的診斷價值，50例惡性胸腔積液患者和30例良性胸腔積液患者參加了這項研究，研究對所有胸腔積液標本進行平行的細胞學(xué)評價，用PCR法進行基因檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FHIT和p16 mRNA在惡性胸腔積液患者中缺失率明顯高于良性胸腔積液患者，K-ras突變比良性胸腔積液更頻繁，而這3個基因標記組合的敏感性達到74%，因此基因檢測可對惡性胸腔積液的細胞學(xué)診斷起到輔助作用。K-ras基因的突變與人類肺癌的發(fā)病機制有關(guān)，并被認為是影響預(yù)后的重要因素，其突變的位點受到國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。有學(xué)者就此問題進行了一項針對40例胸腔積液患者的研究[14]，對胸腔積液標本使用PCR技術(shù)檢測了K-ras基因密碼子的點突變，研究表明，胸腔積液可以有效地作為一個搜索癌基因點突變的臨床標本，K-ras基因的第12位密碼子突變在惡性胸腔積液中容易檢測到，對惡性胸腔積液的診斷有重要的啟示作用。抗脫落凋亡被認為是腫瘤轉(zhuǎn)移的1個重要原因，惡性胸腔積液中的腫瘤細胞被認為具有抗脫落凋亡能力，有學(xué)者[15]檢測TC-1基因在胸腔積液腫瘤細胞中表達水平明顯高于原發(fā)灶腫瘤細胞，應(yīng)用TC-1通路相關(guān)抑制劑PD176074可促使懸浮著的胸腔積液腫瘤細胞出現(xiàn)大批凋亡及壞死，而PD176074對貼壁培養(yǎng)的原發(fā)灶腫瘤細胞則無影響，由此證明了TC-1基因在胸腔積液腫瘤細胞抗脫落凋亡中扮演著重要角色。

2.2 胸腔積液相關(guān)因子檢測的輔助診斷功能

目前惡性胸腔積液的細胞學(xué)診斷雖然被普遍使用，但其陽性率僅為40%～70%，那些細胞學(xué)檢查陰性的患者尚不能被排除惡性的可能，良惡性的判斷對治療及預(yù)后起著決定性的作用，因此在鑒別良惡性胸腔積液方面僅僅依靠細胞學(xué)診斷是不夠的。許多學(xué)者提出應(yīng)在細胞學(xué)診斷的基礎(chǔ)上結(jié)合多種輔助診斷項目來提高惡性胸腔積液的檢出率，如胸腔積液腫瘤標志物、生化及血管內(nèi)皮生長因子[16]等。

2.2.1 胸腔積液腫瘤標志物 腫瘤標志物作為診斷惡性腫瘤較敏感的指標被廣泛應(yīng)用于臨床，以胸腔積液為臨床標本的腫瘤標志物檢測在鑒別良惡性胸腔積液方面具有較好的診斷價值。有學(xué)者[17]研究了腫瘤標志物在肺腺癌相關(guān)的細胞學(xué)陰性的胸腔積液中的診斷價值，選取HER-2/neu、CYFRA 21-1、和癌胚抗原(CEA)為檢查指標，以74例肺腺癌胸腔積液(細胞學(xué)陽性41例，陰性33例)和99例良性胸腔積液為研究對象，結(jié)果HER-2/neu、CYFRA 21-1、CEA平均水平在癌性胸腔積液中顯著高于良性者，在細胞學(xué)陰性的癌性胸腔積液中CEA聯(lián)合CYFRA 21-1的診斷敏感性增加66.7%，在良性胸腔積液中這些標志物的平均假陽性率僅為2.7%，此項研究有力地證明了胸腔積液腫瘤標志物的診斷價值。臨床中通常以血清為標本來測量腫瘤標志物，為驗證胸腔積液在此方面的診斷價值，有學(xué)者[18]對28例癌性胸腔積液患者和30例良性胸腔積液患者分別進行血清和胸腔積液中腫瘤標志物(CEA、CA125、CA199、CA153等)的檢測，結(jié)果顯示癌性胸腔積液患者血清和胸腔積液中腫瘤標志物均明顯高于良性胸腔積液患者，而在癌性胸腔積液患者中，胸腔積液腫瘤標志物亦顯著高于血清腫瘤標志物。分析其原因可能為在惡性胸腔積液時，腫瘤細胞已侵犯胸膜，癌細胞直接將腫瘤標志物釋放至胸腔內(nèi)，且胸膜腔內(nèi)的大分子標志物不易入血，而入血的腫瘤標志物也易被肝臟滅活，所以它在胸腔積液中的濃度顯著高于血清。如果血清內(nèi)腫瘤標志物水平明顯升高，則可推斷疾病可能已進入中晚期，因此測定胸腔積液中的腫瘤標志物對胸腔積液的早診斷、早治療更有意義。

2.2.2 胸腔積液生物標志物 胸腔積液中富含種類繁多的生物標志物，其中一些與腫瘤細胞密切相關(guān)，國內(nèi)外學(xué)者進行了大量實驗及臨床研究以探尋某些生物標志物與惡性胸腔積液的因果關(guān)系。Psallidas 等[19]研究了分泌型磷酸化蛋白1(SPP1)對惡性胸腔積液的影響，結(jié)果表明SPP1能引起巨噬細胞浸潤到腫瘤、促進腫瘤血管生成，減少癌細胞在體內(nèi)的凋亡，此外，它可以獨立于血管內(nèi)皮生長因子直接促進血管通透性增高。我們可以認為SPP1以1種協(xié)同的方式促進胸腔積液的積聚與腫瘤的播散，SPP1可能成為治療干預(yù)惡性胸腔積液的一個有吸引力的靶標。載脂蛋白E(APOE)已被證明在非小細胞肺癌患者胸腔積液中明顯升高，然而胸腔積液ApoE在NSCLC的診斷價值尚未得到很好的驗證，因此有學(xué)者通過實驗來評估其診斷價值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)APOE在診斷NSCLC時靈敏度和特異性分別為70.8%和83.30%，證明胸腔積液中APOE濃度的增加是診斷以及鑒別診斷NSCLC的一個潛在標記[20]。血清降鈣素原(S-PCT)作為全身性細菌感染的生物標志物被眾所周知，然而近期有學(xué)者發(fā)現(xiàn)胸腔積液降鈣素原(PF PCT)檢測有助于鑒別結(jié)核性胸膜炎引起的胸腔積液和惡性胸腔積液[21]。最新發(fā)現(xiàn)[22]凝集素芯片可以用于確定肺癌患者的胸腔積液細胞蛋白譜，其中SNA有最高的敏感性(92.6%)、特異性(100%)和準確性(96.3%)，SNA可以作為生物標志物來鑒別反應(yīng)性間皮細胞與腺癌細胞，從而證明凝集素芯片能夠在胸腔積液中區(qū)分間皮細胞中的癌細胞。

2.2.3 其他胸腔積液相關(guān)因子檢測 以胸腔積液為標本的檢測越來越趨于多元化，除了細胞學(xué)檢測、胸腔積液腫瘤標志物、生物標志物等檢查外，許多新的項目受到廣大學(xué)者及醫(yī)務(wù)工作者的關(guān)注，這些項目雖然尚不成熟，但有望為惡性胸腔積液的診斷提供新的工具和思路。已有學(xué)者[23]證實染色體分析技術(shù)在惡性胸腔積液鑒別中具有靈敏度高、特異性強、成本低、易在基層醫(yī)院推廣的特點，對于臨床上難以鑒別性質(zhì)的胸腔積液患者，在進行細胞學(xué)檢查的同時聯(lián)合染色體分析可以大大提高惡性胸腔積液的檢出率。有學(xué)者[24]為探究血清鐵蛋白與胸腔積液鐵蛋白檢測對良惡性胸腔積液的診斷價值進行了臨床研究，發(fā)現(xiàn)胸腔積液鐵蛋白檢測有助于良惡性胸腔積液的鑒別診斷，～ 而血清鐵蛋白檢測對良惡性胸腔積液的鑒別診斷價值不大。腫瘤血管生成在腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中起著重要的作用，研究發(fā)現(xiàn)[25]CD31、CD34、CD105 及VEGF 在非小細胞肺癌胸腔積液中的表達量明顯高于增生和炎性胸腔積液表達，檢測胸腔積液細胞中血管內(nèi)皮標記物及血管內(nèi)皮生長因子的表達水平可能對判斷患者的預(yù)后有一定價值。表皮生長因子受體(EGFR)基因突變的非小細胞肺癌患者對吉非替尼敏感，因此，EGFR突變檢測在治療決策中起著重要作用，最初這項檢測主要涉及標準的腫瘤組織樣本，近期細針穿刺所得和胸腔積液中的腫瘤細胞也可成功地為EGFR基因突變提供靈敏的檢測素材，使EGFR基因突變的檢測在臨床中更為快速和普及[26]。

胸腔積液中腫瘤細胞的相關(guān)研究為惡性胸腔積液的診斷提供了新的方法和靶點，胸腔積液相關(guān)因子檢測在臨床診斷中亦具有很大的指導(dǎo)意義。

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