緊密連接Occludin蛋白在大鼠腦出血致腸屏障改變中表達的變化

武國艷，張繼龍，王智超，汪連珍，潘磊

緊密連接Occludin蛋白在大鼠腦出血致腸屏障改變中表達的變化

武國艷，張繼龍，王智超，汪連珍，潘磊

目的：研究緊密連接Occludin蛋白在大鼠腦出血致腸屏障改變中表達的變化。方法：健康成年雄性Wistar大鼠36只，隨機分為腦出血組和假手術(shù)組，每組18只。腦出血組建立急性腦出血模型。HE染色觀察空腸病理形態(tài)，免疫組化法觀察腸粘膜緊密連接Occludin蛋白的表達。結(jié)果：15只大鼠腦出血造模成功；腦出血組大鼠空腸出現(xiàn)明顯病理改變，緊密連接Occludin蛋白平均光密度低于假手術(shù)組（＜0.05）。結(jié)論：急性腦出血時，空腸組織出現(xiàn)病理改變，緊密連接破壞，腸粘膜緊密連接Occludin蛋白表達下降。

急性腦出血；腸屏障功能；Occludin蛋白

腸道被認為是機體應(yīng)激時的中心器官，是多器官功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）的“始動”器官[1]。研究證實早期實行腸內(nèi)營養(yǎng)，維持內(nèi)臟血流穩(wěn)定性及腸屏障完整性能明顯降低MODS發(fā)生率[2]。因此，研究腦出血時腸屏障改變對臨床腦出血的診療有極其重要的意義。研究證實，緊密連接Occludin蛋白能反映腸道緊密連接及屏障破壞的情況，其分布減少會導(dǎo)致腸屏障功能障礙從而導(dǎo)致疾病發(fā)生。本研究通過建立腦出血模型觀察腸道Occludin蛋白表達變化，探討Occludin蛋白在腦出血時腸屏障損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康成年雄性Wistar大鼠36只，體質(zhì)量（240±20）g，由華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。

1.1.2 主要試劑 兔抗大鼠Occludin多克隆抗體購于英國Abcam公司；山羊抗兔IgG試劑盒及DAB顯色試劑盒購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及造模 大鼠隨機分為腦出血組和假手術(shù)組，各18只。2組均參照Deinsberger等[3]的方法制備腦出血模型，經(jīng)胃管給予腸內(nèi)營養(yǎng)。在實驗過程中維持大鼠全身循環(huán)灌注、氧合穩(wěn)定正常。

1.2.2 指標檢測 各組大鼠清醒后，觀察其行為改變。造模24 h后處死大鼠，取腦，同時開腹取空腸1 cm，4%甲醛固定。①行腦組織切片，判斷是否腦出血造模成功。造模成功的大鼠進行空腸標本的相關(guān)檢測。②HE染色，光鏡下觀察空腸病理形態(tài)。③過氧化物酶標記的鏈霉卵白素（streptavidin peroxidase，SP）法檢測空腸Occludin蛋白表達。每張切片于200倍光鏡下隨機選取5個視野，應(yīng)用彩色圖文計算機圖像處理系統(tǒng)采集圖像，Image Pro Plus 6圖 文軟件分析系統(tǒng)測定光密度（optical density，OD）值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 18.0軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料以（x± s）表示，配對 檢驗，＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動物模型資料

腦出血組大鼠清醒后有15只出現(xiàn)拖步行走、肢體偏癱、旋轉(zhuǎn)爬行等行為改變。腦組織切片[4]，證實腦出血造模成功15只。假手術(shù)組大鼠均未出現(xiàn)上述神經(jīng)缺損癥狀，腦內(nèi)亦無血腫形成。

2.2 腸粘膜病理學(xué)改變

HE染色光鏡下觀察結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠空腸結(jié)構(gòu)正常，小腸絨毛結(jié)構(gòu)完整，呈高柱狀上皮，間質(zhì)無水腫。腦出血組大鼠空腸可見小腸部分絨毛腫脹破壞、部分脫落，固有層血管擴張充血水腫，炎性細胞浸潤，少量柱狀上皮壞死，腸腔炎性滲出[4]。

2.3 Occludin蛋白的表達變化

腦出血組Occludin蛋白分布不均，染色變淡；假手術(shù)組Occludin蛋白均勻一致分布于小腸上皮細胞連接處的頂端，呈很強的棕褐色信號，見圖1。腦出血組腸粘膜Occludin蛋白OD值為（0.1876± 0.0072），假手術(shù)組為（0.2065±0.0152），前者低于后者（＜0.05）。

3 討論

正常的腸屏障功能的維系依靠機械性屏障、菌群屏障、免疫性屏障的共同作用，其中以機械屏障最為重要。上皮細胞間緊密連接是構(gòu)成機械屏障的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，可防止細菌內(nèi)毒素等大分子滲透到周圍組織。上皮細胞的緊密連接是由Occludin蛋白、閉合小環(huán)蛋白ZO和膜相關(guān)蛋白參與組成，其中

本研究通過免疫組化方法檢測Occludin蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)腦出血組較假手術(shù)組明顯減少（＜0.05），而腦出血組腸粘膜病理損傷明顯較假手術(shù)組重，進一步說明Occludin蛋白的表達與腸粘膜損傷相關(guān)。

R741

A DOI 10.3870/sjsscj.2014.05.024

武漢市第一醫(yī)院急診科武漢430022

武漢市衛(wèi)生局課題（No.【2011】99號）

2014-05-22

張繼龍zhangjilong73@163. comOccludin蛋白是內(nèi)皮細胞間緊密連接的主要功能蛋白[5-7]。實驗證實內(nèi)皮細胞緊密連接中Occludin蛋白的表達量越高，內(nèi)皮的通透性越小[5]。也有研究表明，Occludin蛋白分布異?？蓪?dǎo)致腸上皮細胞旁路滲透性增加，緊密連接完整性遭到破壞，從而導(dǎo)致腸屏障功能障礙[8]。因而，對occludin水平的檢測能反映腸道緊密連接及屏障破壞的情況[8,9]。