普羅布考對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化兔主動(dòng)脈白三烯C4的影響

吳樂(lè)，黎紅華，武強(qiáng)，劉子建

普羅布考對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化兔主動(dòng)脈白三烯C4的影響

吳樂(lè)1，黎紅華1，武強(qiáng)1，劉子建2

目的：觀察普羅布考對(duì)高同型半胱氨酸（Hcy）血癥誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化（AS）兔主動(dòng)脈白三烯C（4LTC4）的影響。方法：將24只雄性新西蘭大耳白兔隨機(jī)分成3組各8只：對(duì)照組給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)；模型組和普羅布考組在基礎(chǔ)飼料中加入1%的蛋氨酸；普羅布考組從第12周起用普羅布考（1 g/d）灌胃；飲食量200 g/d，均喂養(yǎng)20周。第20周末用RT-PCR檢測(cè)動(dòng)脈血管中白三烯C4合成酶（LTC4S）的mRNA表達(dá)，用ELISA檢測(cè)動(dòng)脈血管中LTC4的含量。結(jié)果：模型組腹主動(dòng)脈LTC4S的mRNA表達(dá)及LTC4的含量較對(duì)照組增高（< 0.05），普羅布考組腹主動(dòng)脈LTC4S的mRNA表達(dá)水平及LTC4含量低于模型組（<0.05）。結(jié)論：普羅布考能抑制主動(dòng)脈LTC4S的mRNA表達(dá)，降低主動(dòng)脈LTC4的含量，該作用可能為其抗AS的機(jī)制之一。

普羅布考；同型半胱氨酸；動(dòng)脈粥樣硬化；白三烯C4；白三烯C4合成酶

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）的發(fā)病機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，目前認(rèn)為炎癥反應(yīng)是AS的一個(gè)關(guān)鍵性致病機(jī)制。白三烯（leukotrienes，LTs）是花生四烯酸經(jīng)5-脂氧酶代謝的促炎癥介質(zhì)，最近的研究顯示LTs在AS的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用。白三烯C4（leukotriene C4，LTC4）是一種重要的LTs，LTC4合成酶（leukotriene C4synthase，LTC4S）是合成LTC4的關(guān)鍵酶。筆者在以往的研究中觀察到給予高蛋氨酸飲食導(dǎo)致兔高同型半胱氨酸（homocysterine，Hcy）血癥，并誘導(dǎo)兔主動(dòng)脈粥樣硬化，普羅布考能減輕兔主動(dòng)脈內(nèi)膜增生程度，但相關(guān)機(jī)制仍需進(jìn)一步探討[1]。本研究以高蛋氨酸飲食誘導(dǎo)兔高Hcy血癥及AS模型，觀察普羅布考對(duì)高Hcy誘導(dǎo)AS兔主動(dòng)脈LTC4的影響，探討普羅布考抗AS的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性純種新西蘭大耳白兔24只，體質(zhì)量2.0~2.5 kg，購(gòu)自湖北省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.1.2 主要試劑 普羅布考粉劑購(gòu)自山東齊魯制藥有限公司。LTC4S引物由大連寶生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成。兔LTC4ELISA試劑盒購(gòu)自武漢俊泰生物科技有限公司（美國(guó)R&D公司生產(chǎn)，中國(guó)分裝）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及給藥 動(dòng)物隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和普羅布考組3組各8只：對(duì)照組給予基礎(chǔ)飼料200 g/d，模型組和普羅布考組給予高蛋氨酸飼料200 g/d（基礎(chǔ)飼料中加入1%蛋氨酸），普羅布考組從第12周開(kāi)始給予普羅布考1 g/d灌胃，均喂養(yǎng)20周。

1.2.2 RT-PCR檢測(cè)腹主動(dòng)脈中LTC4S的mRNA表達(dá)水平 按照Trizol說(shuō)明書(shū)方法提取組織總RNA，測(cè)定總RNA濃度及純度。RT-PCR反應(yīng)：在25 μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中，以4 μg總RNA為模板，用Mix逆轉(zhuǎn)錄酶將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。引物序列：LTC4S：5'-CCA GGT AAA TGC AGC GAG TA-3'（上游），5'-TGT GCC AGG GAG GAA GTG-3'（下游），擴(kuò)增片段為247 bp；GAPDH：5'-GGA AAT CGT GCG TGA CAT T-3'（上游），5'-TAG GAG CCA GGG CAG TAA TC-3'（下游），擴(kuò)增片段為350 bp。反應(yīng)參數(shù)：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，57℃退火 45 s，72℃延伸30 s×33個(gè)循環(huán)，72℃終末延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物以1.6%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組重復(fù)6次。

1.2.3 ELISA檢測(cè)腹主動(dòng)脈中LTC4的水平 制備腹主動(dòng)脈勻漿，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，應(yīng)用酶標(biāo)儀，在450 nm下讀取吸光度（optical density，OD）值，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度由低到高自左至右為橫坐標(biāo)（X）軸，450 nm下讀取的各檢測(cè)孔OD值為縱坐標(biāo)（Y）軸。在Logit-Log直線回歸計(jì)算模式下繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，在標(biāo)準(zhǔn)曲線圖上根據(jù)每個(gè)待測(cè)樣本的OD值查找出其相對(duì)應(yīng)的濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS17.0軟件分析數(shù)據(jù)，正態(tài)性檢驗(yàn)，正態(tài)分布的結(jié)果以（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）（±s）表示，單因素方差分析，組間的兩兩比較采用Student-Newman-Keuls檢驗(yàn)，<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腹主動(dòng)脈LTC4S的mRNA表達(dá)比較

模型組和對(duì)照組腹主動(dòng)脈LTC4S的mRNA表達(dá)分別為 （0.127±0.010）、（0.059±0.005），前者水平較后者增高（<0.05）；普羅布考組腹主動(dòng)脈LTC4S的mRNA表達(dá)為（0.061±0.006），與模型組相比明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（< 0.05），見(jiàn)圖1。

2.2 腹主動(dòng)脈LTC4的水平變化

ELISA結(jié)果提示，對(duì)照組、模型組和普羅布考組的腹主動(dòng)脈LTC4水平分別為（32.3±5.7）ng/mL、（52.6±8.6）ng/mL、（35.8±6.1）ng/mL，模型組的腹主動(dòng)脈LTC4水平較對(duì)照組明顯增高（<0.05）；普羅布考組腹主動(dòng)脈LTC4的水平降低，與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（< 0.05），見(jiàn)圖2。

3 討論

LTs是花生四烯酸經(jīng)5-脂氧酶代謝的促炎癥介質(zhì)。花生四烯酸被5-脂氧酶代謝為不穩(wěn)定的中間產(chǎn)物白三烯A4（leukotriene A4，LTA4），在LTA4水解酶的作用下，LTA4轉(zhuǎn)換成為白三烯 B4（leukotriene B4，LTB4），或在LTC4S的作用下，LTA4與谷胱甘肽結(jié)合，生成LTC4。釋放到細(xì)胞外微環(huán)境的LTC4，經(jīng)過(guò)連續(xù)的氨基酸裂解，產(chǎn)生白三烯D4（leukotriene D4，LTD4） 和 白 三 烯 E4（leukotriene E4，LTE4）[2]。因此，LTC4S是LTA4和谷胱甘肽轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)TC4、LTD4和LTE4過(guò)程中的重要酶。LTC4、LTD4和LTE4統(tǒng)稱為半胱氨酰白三烯（cysteinyl leukotrienes，cys-LTs），cys-LTs與其受體結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，cys-LTs受體包括cys-LT1和cys-LT2受體。最近的研究表明LTs與AS之間存在密切的關(guān)系。B?ck等[3]對(duì)人冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)加入LTB4后能促進(jìn)人冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的遷移和增殖，提示LTB4在血管內(nèi)膜增生以及AS中的作用。Allen等[4]將LTC4和LTD4分別作用AS患者及非AS患者的冠狀動(dòng)脈，結(jié)果顯示LTC4和LTD4能明顯誘導(dǎo)AS患者的冠狀動(dòng)脈收縮，而非AS患者的冠狀動(dòng)脈對(duì)LTC4和LTD4無(wú)反應(yīng)，結(jié)合冠心病患者血清的LTs水平升高，作者認(rèn)為L(zhǎng)Ts參與AS的發(fā)病機(jī)制。人AS的好發(fā)部位主動(dòng)脈、頸動(dòng)脈和冠狀動(dòng)脈中均可檢測(cè)到LTC4S、cys-LT1和cys-LT2受體[5]。Cys-LTs可通過(guò)與cys-LT2受體結(jié)合，強(qiáng)烈激活內(nèi)皮細(xì)胞上AS相關(guān)的即刻早基因[6]。Cys-LTs在血管平滑肌的增殖和遷移中也起重要作用，血管內(nèi)膜受損后，新生內(nèi)膜形成，免疫組化結(jié)果表明cys-LT1和cys-LT2受體在損傷動(dòng)脈壁上均有表達(dá)。LTC4、LTD4和LTE4刺激平滑肌細(xì)胞的遷移，該效應(yīng)可被cys-LT受體拮抗劑孟魯司特抑制[7]?？傊?，以上研究提示LTs與AS的形成及發(fā)展密切相關(guān)。

普羅布考是FDA唯一認(rèn)證的抗氧化藥物，最初以降脂藥應(yīng)用于臨床，近年發(fā)現(xiàn)其具有抗氧化的作用，如改善血管內(nèi)皮功能、抑制平滑肌細(xì)胞增殖等。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究均顯示普羅布考具有抗AS作用[8,9]。普羅布考分子內(nèi)所含的酚羥基很容易被氧化而發(fā)生斷鏈，捕捉氧離子并與之結(jié)合形成穩(wěn)定的酚氧基，有效降低氧自由基濃度，從而預(yù)防或延遲AS的發(fā)生和發(fā)展，可通過(guò)其較強(qiáng)的抗氧化作用抑制炎癥的發(fā)展[10]。而且，普羅布考為脂溶性分子，易于穿過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞到達(dá)血管壁及脂質(zhì)斑塊之間發(fā)生抗氧化作用，從而有效抑制斑塊的形成，發(fā)揮強(qiáng)大的抗AS作用。

本研究觀察到模型組兔主動(dòng)脈LTC4S的mRNA表達(dá)及LTC4含量較對(duì)照組明顯增高，進(jìn)一步證實(shí)LTC4S及LTC4與AS之間存在密切的關(guān)系。同時(shí)，普羅布考能顯著降低兔主動(dòng)脈LTC4S的mRNA表達(dá)水平及LTC4的含量，提示該作用可能是普羅布考抗AS的機(jī)制之一。

[1] 吳樂(lè),黎紅華,武強(qiáng),等.普羅布考對(duì)高同型半胱氨酸血癥致兔動(dòng)脈粥樣硬化的作用[J].神經(jīng)損傷與功能重建,2011,6:24-27.

[2] Lam BK.Leukotriene C(4)synthase[J]. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids,2003, 69:111-116.

[3] B?ck M,Bu DX,Br?nstr?m R,et al. Leukotriene B4 signaling through NF-kappaB-dependentBLT1 receptorson vascular smooth muscle cells in atherosclerosis and intimal hyperplasia[J].Proc Natl Acad Sci USA, 2005,102:17501-17506.

[4] Allen S,Dashwood M,Morrison K,et al. Differential leukotriene constrictor responses in human atherosclerotic coronary arteries[J]. Circulation,1998,97:2406-2413.

[5] Sampson AP.FLAP inhibitors for the treatment of inflammatory diseases[J].Curr Opin Investig Drugs,2009,10:1163-1172.

[6] Uzonyi B,L?tzer K,Jahn S,et al.Cysteinyl leukotriene 2 receptor and protease-activated receptor 1 activate strongly correlated early genes in human endothelial cells[J].Proc Natl Acad Sci USA,2006,103:6326-6331.

[7] Seo KW,Lee SJ,Kim CE,et al.Participation of 5-lipoxygenase-derived LTB(4)in 4-hydroxynonenal-enhanced MMP-2 production in vascular smooth muscle cells[J].Atherosclerosis, 2010,208:56-61.

[8] Braun A,Zhang S,Miettinen HE,et al. Probucol prevents early coronary heart disease an d death in the high density lipoprotein receptor SR-BI/apolipoprotein E double knockout mouse [J].Proc Natl Acad Sci USA,2003,100: 7283-7288.

[9] Sawayama Y,Shimizu C,Maeda N,et al. Effects of probucol and pravastatin on common carotid atherosclerosis in patients with asymptomatic hypercholesterolemia. Fukuoka Atherosclerosis Trial (FAST)[J].J Am Coil Cardol,2002,39:610-616.

[10]Adameova A,Xu YJ,Duhamel TA,et al. Anti-atherosclerotic molecules targeting oxidative stress and inflammation[J].Curr Pharm Des, 2009,15:3094-3107.

（本文編輯：王晶）

Effect of Probucol on Leukotriene C4in Aorta of Atherosclerotic Rabbits

Objective:To investigate the effect of Probucol on the expression of leukotriene C4(LTC4)in the aorta of atherosclerotic rabbits induced by hyperhomocysteinemia.Methods:Twenty-four male rabbits were randomly divided into three groups.The control group was fed on common food,the model group was fed on high-methionine food containing 1%methionine,and the Probucol group received high-methionine food and Probucol 1 g/d perfused into stomach from the 12th week.The food was 200g/d for 20 weeks.The aorta was removed to investigate the leukotriene C4synthase(LTC4S)mRNA expression by RT-PCR and the protein level of LTC4by ELISA at 20th week.Results:Compared with those in the control group,the mRNA expression of LTC4S and the level of LTC4were increased in the model group (<0.05).And compared with those in the model group,the mRNA expression of LTC4S and the level of LTC4were down-regulated in the Probucol group(<0.05).Conclusion:Probucol could reverse the aortic lesion induced by hyperhomocysteinemia which may be mediated by the suppressive effect on LTC4S mRNA expression and the level of LTC4.

Probucol;homocysterine;atherosclerosis;leukotriene C4;leukotriene C4synthase

R741;R741.05

A DOI 10.3870/sjsscj.2014.05.006

1.廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科武漢430070；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)系武漢430030

2013-12-04

黎紅華whzyylhh@163.com