人神經(jīng)生長因子重組慢病毒載體構(gòu)建及檢測

張飛，吳建紅，杜義恒，劉海濤，夏術(shù)階

·論著·

人神經(jīng)生長因子重組慢病毒載體構(gòu)建及檢測

張飛，吳建紅，杜義恒，劉海濤，夏術(shù)階

目的：構(gòu)建含神經(jīng)生長因子（NGF）基因的重組慢病毒載體，并在293T細(xì)胞中驗(yàn)證NGF是否可以過表達(dá)。方法：將NGF基因克隆至慢病毒穿梭質(zhì)粒Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP，然后利用酶切鑒定、PCR鑒定及測序驗(yàn)證后，同兩個輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，構(gòu)建重組慢病毒載體。重組慢病毒感染293T細(xì)胞，通過熒光檢測慢病毒的轉(zhuǎn)染效果，用Western Blot檢測NGF基因的表達(dá)。結(jié)果：酶切鑒定、PCR擴(kuò)增鑒定和對重組慢病毒進(jìn)行測序，提示重組慢病毒構(gòu)建正確。熒光顯微鏡觀察重組慢病毒感染的293T細(xì)胞，可見強(qiáng)熒光。Western Blot結(jié)果提示目的基因可正常表達(dá)。RT-PCR測得病毒滴度達(dá)到可利用標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)論：人NGF重組慢病毒載體構(gòu)建成功。

神經(jīng)生長因子；慢病毒載體；糖尿病神經(jīng)源性膀胱

神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）是目前發(fā)現(xiàn)最早、研究最為透徹、應(yīng)用最廣泛的神經(jīng)營養(yǎng)因子。NGF對神經(jīng)元的存活、生長發(fā)育、分化、再生和功能維持起著調(diào)控作用[1]。最近研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病神經(jīng)源性膀胱（diabetic neurogenic bladder，DNB）動物模型中，交感神經(jīng)支配的靶器官NGF含量明顯減少，這提示NGF減少可能跟DNB的發(fā)生發(fā)展存在一定的關(guān)系[2,3]。筆者的前期研究亦發(fā)現(xiàn)NGF在糖尿病大鼠膀胱和骶髓背根神經(jīng)節(jié)中低表達(dá)，在糖尿病膀胱病變中發(fā)揮重要作用[4]。本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建NGF重組慢病毒，其表達(dá)也在293T細(xì)胞中得到驗(yàn)證，為進(jìn)一步研究NGF與DNB發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系以及采用外源NGF治療DNB奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.2 試劑與器械 1 kb DNA ladder Marker（購于立陶宛Fermentas公司)；250 bp DNA ladder Marker（購于上海捷瑞公司）；In-FusionTMPCR Cloning Kit（購于美國Clontech公司)；聚合酶（購于上海欣百諾公司）；限制性內(nèi)切酶（購于美國NEB公司）；質(zhì)粒抽提盒（購于美國Promega公司）；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（購于北京天根生化公司）；胎牛血清、DMEM（購于美國Gibco公司）；Opti-MEM、Lipofectamine 2000（購于美國Invitrogen公司）；蛋白檢測試劑盒（購于美國HyClone-Pierce公司）；Prestained protein marker（購于上海中晶公司）；ECL-PLUS/Kit（購于英國Amersham公司）；PCR儀 （購于美國Applied Biosystems公司）；生物安全柜（購于新加坡ESCO公司）；空載體病毒（購于上海吉凱生物科技公司）。

1.2 方法

1.2.1 NGF重組慢病毒質(zhì)粒的構(gòu)建和檢驗(yàn) 慢病毒載體GV287原件順序?yàn)椋篣bi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP，克隆位點(diǎn)為AgeⅠ。設(shè)計(jì)合成PCR引物：上游引物 5'-G AG G A T C C C G G G TA C C G G T CGCCACCATGTCCATGTTGTTCTACAC-3'和下游引物 5'-T CC T T G T A G TC C A T ACCGGCTCTTCTCACAGCCTTC-3'，利用PCR方法釣取NGF基因。將GV287慢病毒質(zhì)粒進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物電泳后回收。PCR產(chǎn)物NGF基因交換入線性化GV287慢病毒質(zhì)粒，定向克隆連接成為NGF重組慢病毒質(zhì)粒。用氯化鈣制備新鮮的大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。NGF重組慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。對轉(zhuǎn)化后長出的陽性克隆進(jìn)行PCR及測序鑒定。

1.2.2 NGF重組滿病毒的包裝 將處于對數(shù)生長期的293T細(xì)胞懸液接種于24孔板中，接種密度為6×105細(xì)胞/mL，37℃、5%培養(yǎng)箱培養(yǎng)至細(xì)胞融合80%，制備編碼慢病毒顆粒的重組病毒質(zhì)粒GV287及兩種輔助包裝原件載體質(zhì)粒pHelper1.0、pHelper2.0，三種質(zhì)粒載體分別進(jìn)行高純度無內(nèi)毒素提取，按Lipofectamine 2000使用說明進(jìn)行共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后8 h更換為完全培養(yǎng)基。

1.2.3 NGF重組慢病毒的功能檢測 待共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞24 h后，在熒光顯微鏡下觀察熒光標(biāo)記基因的表達(dá)情況，判斷感染效率（圖1），熒光拍照后補(bǔ)加500 μL完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染36 h后，收集細(xì)胞進(jìn)行Western Bolt，檢測NGF的表達(dá)情況。

1.2.4 NGF重組慢病毒質(zhì)粒的收獲、濃縮、滴度測定 培養(yǎng)48 h后，收集富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液，對其濃縮得到高滴度的慢病毒濃縮液。將病毒濃縮液移出，分裝后保存在病毒管中，于－80℃長期保存。取出一支用實(shí)時定量PCR法測定并標(biāo)定病毒滴度。

1.2.5 介導(dǎo)NGF慢病毒轉(zhuǎn)染臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞 將處于對數(shù)生長期的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）懸液接種于的24孔板中，接種密度為4× 105細(xì)胞/mL，37℃、5%培養(yǎng)箱培養(yǎng)至細(xì)胞融合50%，分別以感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）5、50、100的慢病毒轉(zhuǎn)染臍帶MSCs，24 h后更換新鮮培養(yǎng)基，72 h后熒光拍照，找到轉(zhuǎn)染最佳MOI。按照最佳MOI，依完全空白對照、空載體對照、重組慢病毒轉(zhuǎn)染臍帶MSCs，然后大規(guī)模培養(yǎng)擴(kuò)增。

2017年中國最好大學(xué)排名評價的61所醫(yī)藥類院校分布于中國的25個省(市、區(qū))，其中遼寧的評價高校數(shù)量最多，有6所；廣東和山東的評價高校數(shù)量位居第二，各有5所；黑龍江、江蘇和四川各有4所評價高校；安徽、北京和廣西各有3所評價高校；福建、貴州、河北、河南、江西、山西、天津和浙江等8個省份各有2所評價高校；海南、吉林、內(nèi)蒙古、寧夏、上海、新疆、云南和重慶等8個省份各有1所評價高校。

2 結(jié)果

2.1 目的載體酶切結(jié)果

慢病毒載體經(jīng)酶切、電泳，獲得大小均為10 kb的載體片段（圖2）。

2.2 重組慢病毒測序及PCR擴(kuò)增鑒定

對NGF重組慢病毒質(zhì)粒進(jìn)行基因測序，序列正確（圖3A）。以重組慢病毒質(zhì)粒為模板，特異的NGF引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，獲得大小為767 bp的目的基因（圖3B）。

2.3 目的質(zhì)粒感染293T效果及Western Blot檢測NGF基因表達(dá)

用NGF重組慢病毒質(zhì)粒感染24孔板中的293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞進(jìn)行熒光觀察（圖1），熒光表達(dá)強(qiáng)。這表明目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染正常、目的質(zhì)粒熒光標(biāo)記基因表達(dá)正常。Western Blot檢測NGF基因表達(dá)（圖4），目的基因融合蛋白大小為29 kD，可觀察到29 kD附近處有特征條帶，其大小和目的基因融合蛋白相吻合，該質(zhì)粒用FLAG抗體檢測到目的條帶，表明質(zhì)粒中的NGF可正常表達(dá)。

2.4 病毒滴定測試

實(shí)時定量PCR測量病毒滴度，繪制出Real time PCR曲線圖（圖5）。樣本滴度計(jì)算：1/(1.00E-04)×20＝ 2.00E+5 TU/μL=2.00E+8 TU/mL，滴度值＞2.00E+7 TU/mL。

2.5 慢病毒轉(zhuǎn)染臍帶MSCs

在MOI為100時，轉(zhuǎn)染效率達(dá)到80%以上，認(rèn)為是一個最佳轉(zhuǎn)染MOI（圖6）。

3 討論

DNB是糖尿病的泌尿系統(tǒng)常見并發(fā)癥，發(fā)病率約為25%~85%[5]。DNB早期癥狀隱匿，隨病情發(fā)展出現(xiàn)多種泌尿系癥狀：尿動力學(xué)改變、腎盂積水、腎盂腎炎、敗血癥等，最終發(fā)展為尿毒癥[6]。目前臨床常用的治療DNB的方法包括控制血糖水平、抗感染治療、滴注酚妥拉明、肌注B族維生素、營養(yǎng)支持等，傳統(tǒng)的中醫(yī)包括中藥內(nèi)服、針灸亦有一定的療效。癥狀過重或?qū)λ幬镏委煵幻舾械幕颊?，考慮行外科手術(shù)治療，其中腸道膀胱擴(kuò)大術(shù)療效尚可[7]。以上治療方法大都缺乏針對性，無法對糖尿病引起的外周神經(jīng)損傷進(jìn)行修復(fù)，只能暫緩癥狀，不能中止DNB的進(jìn)展，亟待尋求治療效果更好的方法。

目前，DNB的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，Hellweg等[8]發(fā)現(xiàn)在糖尿病大鼠交感神經(jīng)支配的靶器官中NGF含量較正常大鼠減少50%以上，而神經(jīng)末梢分泌的NGF能逆向軸突轉(zhuǎn)運(yùn)至神經(jīng)元和細(xì)胞體中發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，由此推測內(nèi)生NGF分泌減少是誘發(fā)DNB的主要致病因素。Goins等[9]利用單純皰疹病毒介導(dǎo)外源性NGF增加周圍神經(jīng)元內(nèi)NGF的表達(dá)，取得了良好效果，通過增加神經(jīng)支配靶器官中NGF含量修復(fù)受損神經(jīng)達(dá)到治療目的，為臨床治療DNB提供了新思路。

MSCs是一類具有自我更新能力和多向分化潛能的干細(xì)胞，在1966年首先由Friedenstein等[10]從骨髓中發(fā)現(xiàn)。MSCs免疫原性低且下調(diào)免疫應(yīng)答，是理想的組織工程細(xì)胞和基因治療的載體細(xì)胞[11]。其中臍帶MSCs取材簡便、來源豐富、擴(kuò)增和分化能力強(qiáng)，具有良好的利用前景。國內(nèi)外學(xué)者采用重組慢病毒載體介導(dǎo)不同外源基因轉(zhuǎn)染至MSCs中，并獲得持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)[12]。MSCs在體外可定向誘導(dǎo)分化為神經(jīng)上皮祖細(xì)胞，而后進(jìn)一步分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，可作為神經(jīng)組織損傷修復(fù)的工程細(xì)胞[13]。利用介導(dǎo)NGF的慢病毒轉(zhuǎn)染臍帶MSCs，然后將過表達(dá)NGF的臍帶MSCs誘導(dǎo)成神經(jīng)上皮祖細(xì)胞，聯(lián)合NGF和神經(jīng)上皮祖細(xì)胞的基因治療、細(xì)胞治療作用，以期待對神經(jīng)損傷更高效的修復(fù)。本研究成功構(gòu)建NGF重組慢病毒質(zhì)粒，確定慢病毒轉(zhuǎn)染臍帶MSCs的最佳MOI，為后續(xù)獲得過表達(dá)NGF神經(jīng)上皮祖細(xì)胞穩(wěn)定株并進(jìn)一步研究NGF和DNB關(guān)系、論證過表達(dá)NGF的神經(jīng)上皮祖細(xì)胞治療DNB的可行性奠定基礎(chǔ)。

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（本文編輯：王晶）

Construction and Identification of Lentiviral Vector Carrying Nerve Growth Factor Gene

Objective:To construct the recombinant lentiviral vector containing nerve growth factor(NGF)gene and test the overexpression of NGF gene in 293T cells.Methods:The NGF gene was cloned into lentiviral shuttle plasmid(Ubi-MCS-3FLAG and-SV40-EGFP),and identified by the enzyme cut assay,PCR and gene sequencing.It was then transfected into 293T cells to construct the recombinant lentiviral vector plasmid.The infection efficiency of lentivrius transfection was detected by fluorescence microscope and the protein expression of NGF was tested by Western blot.Results:The construction of lentiviral vector carrying NGF gene was correct which was verified by the enzyme cut assay,PCR and gene sequencing.Strong fluorescence was observed in 293T cells after lentiviral vectors transfection.Western Blot analysis showed a characteristic band of NGF.Conclusion: Recombinant lentiviral vector carrying NGF gene was constructed successfully.

nerve growth factor;lentiviral vector;diabetic neurogenic bladder

R741；R694+.5

A DOI 10.3870/sjsscj.2014.05.001

上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院泌尿外科上海200080

國家自然科學(xué)基金（No.81170701）

2013-11-01

劉海濤doctorlht69@163. com