激光顯微切割/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在腎臟疾病診斷中的應(yīng)用進(jìn)展

孫穎，李明喜，文煜冰，李雪梅，孫健，孫偉

激光顯微切割/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在腎臟疾病診斷中的應(yīng)用進(jìn)展

孫穎1，李明喜1，文煜冰1，李雪梅1，孫健2，孫偉3

1 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 腎內(nèi)科，北京 100730 2 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 病理科，北京 100730 3 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 中心儀器室，北京 100730

激光顯微切割 (Laser microdissection，LMD) 質(zhì)譜 (Mass spectrometry，MS) 聯(lián)用技術(shù) (LMD/MS) 已成功應(yīng)用于腎活檢組織甲醛固定石蠟包埋切片的蛋白質(zhì)組學(xué)研究，提高了某些腎臟病的診斷水平，顯示出較好的臨床應(yīng)用前景。文中就LMD/MS蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的原理、方法及該技術(shù)在腎淀粉樣變性、膜增殖性腎小球腎炎等腎臟疾病的發(fā)病機(jī)制及診斷分型的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述。

激光顯微切割技術(shù)，甲醛固定石蠟包埋組織蛋白質(zhì)組，腎淀粉樣變性，膜增殖性腎小球腎炎

腎臟的蛋白質(zhì)組學(xué)研究主要包括尿液和腎組織蛋白質(zhì)組，尿液中含有豐富的蛋白和肽段，它們多為水溶性，比較穩(wěn)定，總數(shù)可能在100 000以上，目前在不同研究中重復(fù)鑒定到的約占40%[1]。尿液蛋白質(zhì)組受很多生理因素影響有較高的變異性，且蛋白濃度的動(dòng)態(tài)范圍較廣，低豐度蛋白鑒定困難。尿液中鑒定到的有意義的蛋白或腎臟疾病標(biāo)記物往往需要在腎組織中進(jìn)行驗(yàn)證分析。激光顯微切割(Laser microdissection, LMD)技術(shù)依賴使用集成到標(biāo)準(zhǔn)的顯微鏡中的低能量紅外激光，能夠從組織切片中回收特定的細(xì)胞種群。近年來，有學(xué)者采用LMD質(zhì)譜(Mass spectrometry, MS)聯(lián)用技術(shù) (LMD/MS) 分析腎組織切片蛋白質(zhì)組表達(dá)譜，提高了對(duì)腎淀粉樣變、膜增殖性腎小球腎炎 (Membranoproliferative glomerulonephritis, MPGN) 等腎臟疾病發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)，改進(jìn)了臨床診斷分型方法，本文對(duì)這方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 LMD/MS技術(shù)介紹

1.1 LMD簡介

LMD是上世紀(jì)90年代末發(fā)展起來的在顯微鏡下分離、純化單一類型細(xì)胞群或單個(gè)細(xì)胞的技術(shù)，其基本原理是通過低能紅外激光脈沖激活熱塑性乙烯乙酸乙酯膜，在微電腦控制的顯微鏡下選擇性地掃描目標(biāo)樣品邊緣，激光脈沖的加熱效應(yīng)使得相當(dāng)于激光焦斑大小的區(qū)域發(fā)生局部的熔化，熔化的薄膜流到組織切片上迅速冷卻，與靶細(xì)胞結(jié)合，膜移開時(shí)，切片中的組織區(qū)域被研究者獲取[2]。由于能夠基于組織細(xì)胞的表型或功能特征進(jìn)行分離從而減少了組織異質(zhì)性[3]；分離過程溫和，短促的熱變不會(huì)損害組織結(jié)構(gòu)，保持了被分離樣本的結(jié)構(gòu)完整性。

1.2 樣本處理技術(shù)

LMD分離捕獲的樣本包括石蠟包埋組織、新鮮冰凍組織、細(xì)胞涂片等。冰凍組織被認(rèn)為是顯微切割的最佳材料，冰凍切片制備程序較簡單，取材后立即固定，標(biāo)準(zhǔn)較統(tǒng)一，切片制備過程中室間誤差較小；但冰凍切片組織中的細(xì)胞有時(shí)被破壞，使得靶細(xì)胞群的識(shí)別變得困難，此外樣品儲(chǔ)存條件及費(fèi)用較高。Xu等于2005年首次在大鼠5/6腎切除模型中應(yīng)用LMD技術(shù)分離冰凍腎組織中的腎小球標(biāo)本，研究者獲取了50個(gè)腎小球，基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜(MALDI-MS)分析發(fā)現(xiàn)硬化和非硬化腎小球的蛋白質(zhì)組表達(dá)譜有顯著差異[4]。

甲醛固定石蠟包埋組織 (Formalin-fixed paraffin-embedded, FFPE) 是臨床廣泛采用的組織標(biāo)本保存方法，F(xiàn)FPE組織保留有大量提示疾病診斷和預(yù)后的生物學(xué)信息，適用于臨床回顧性研究。但組織固定液、固定前的保存方法、固定流程及組織保存條件等因素都可能影響蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。甲醛固定使組織中蛋白、RNA及DNA形成交聯(lián)，目前各個(gè)實(shí)驗(yàn)室采用不同組分的緩沖液提取FFPE交聯(lián)組織中的蛋白，也可采用商品化的FFPE組織蛋白提取劑如“Liquid tissue MS試劑” (Expressive pathology Inc)，“Qproteome試劑”(Qiagen)等，這些試劑分析FFPE組織的蛋白質(zhì)組表達(dá)譜與新鮮冰凍組織的結(jié)果相似[5]，F(xiàn)FPE組織已被廣泛用于疾病生物標(biāo)記物發(fā)現(xiàn)階段的蛋白質(zhì)組學(xué)研究[6]。

1.3 腎活檢組織質(zhì)譜分析

隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的進(jìn)展，特別是液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的改進(jìn)，質(zhì)譜儀靈敏度的不斷提高，使得LMD/MS技術(shù)高通量分析腎活檢FFPE組織中復(fù)雜蛋白成為可能，這項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用于探索某些腎臟疾病發(fā)病機(jī)制、病理生理改變及診斷標(biāo)志物的研究，已取得一定進(jìn)展[7]。目前腎活檢FFPE樣本LMD/MS分析的主要步驟包括：切取6 μm或10 μm腎組織，脫蠟后HE或其他特殊染色以確定腎小球或腎組織病變部位；分離4–6個(gè)腎小球 (相當(dāng)于10 μm切片取60 000 μm2或6 μm切片取100 000 μm2目標(biāo)腎組織)，每例取樣2–4次；將腎小球或目標(biāo)腎組織收集到含緩沖液的試管中，充分渦旋振蕩并水浴孵育60 min，40 kHz超聲波處理30 min后，二硫蘇糖醇還原及碘乙酰胺烷基化；提取的蛋白37 ℃下胰蛋白酶酶解后液相色譜 (Liquid chromatography, LC) 分離及串連質(zhì)譜分析(LC-MS/MS)[8-9]；蛋白質(zhì)搜索軟件對(duì)所選的譜圖進(jìn)行數(shù)據(jù)庫檢索，鑒定到的多肽及蛋白質(zhì)進(jìn)一步由Scaffold等軟件完成可信度驗(yàn)證[10]；并可應(yīng)用譜圖數(shù)，基于同位素等量標(biāo)簽的相對(duì)和絕對(duì)定量方法(Isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)及基于多反應(yīng)監(jiān)測技術(shù)的靶向蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)進(jìn)行定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析[11]。隨著新一代質(zhì)譜儀，如LTQ Orbitrap Velos，Triple TOF 5600等的應(yīng)用，使精確蛋白質(zhì)組學(xué)[12](即一、二級(jí)質(zhì)譜均采用高分辨方式進(jìn)行數(shù)據(jù)采集) 分析成為可能。使質(zhì)譜數(shù)據(jù)質(zhì)量明顯提高，結(jié)果的可信度明顯增加，可高通量地對(duì)每個(gè)樣品組織進(jìn)行精確差異蛋白質(zhì)組研究。

LMD/MS可對(duì)腎臟不同功能解剖區(qū)域，如腎小球、腎小管及間質(zhì)，進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析。對(duì)一些發(fā)病率低、發(fā)病機(jī)制不清的腎臟疾病，以及某些常規(guī)病理學(xué)方法診斷困難的疾病，這項(xiàng)技術(shù)可發(fā)現(xiàn)病變部位的關(guān)鍵蛋白成分，從而提高了對(duì)疾病發(fā)病機(jī)理的認(rèn)識(shí)，診斷水平有所提高。

2 LMD/MS在腎臟疾病診斷中的應(yīng)用研究進(jìn)展

2.1 淀粉樣變性分型診斷

淀粉樣變性病是一組由不同種類的淀粉樣物質(zhì)在細(xì)胞外沉積導(dǎo)致組織器官功能進(jìn)行性損害的疾病，腎臟為最常受累的器官之一[13]。淀粉樣變的腎臟病理典型表現(xiàn)為光鏡下受累區(qū)域呈無細(xì)胞性增寬，HE染色可見均一、粉染、不嗜銀的物質(zhì)沉積，剛果紅染色陽性，偏光顯微鏡下呈蘋果綠雙折光現(xiàn)象。免疫病理染色見單克隆免疫球蛋白(Ig)和/或輕鏈沉積，其中輕鏈以λ鏈更為常見。電鏡下可見直徑8–12 nm的無分支、結(jié)構(gòu)紊亂、無序排列的纖維在腎小球內(nèi)沉積。確診淀粉樣變性病必須證實(shí)組織中有淀粉樣變蛋白沉積，其中剛果紅染色陽性及電鏡見到特征性淀粉樣纖維是主要的診斷依據(jù)[14]。

以往認(rèn)為淀粉樣變分為兩種類型：Ig輕鏈型淀粉樣變 (AL型，由Ig輕鏈沉積造成) 和AA型淀粉樣變 (由急性期血清淀粉樣蛋白A沉積造成)。目前認(rèn)為淀粉樣變蛋白有25種以上，包括血漿蛋白如載脂蛋白Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ，凝溶膠蛋白(Gelsolin) 等[15]，準(zhǔn)確的診斷和分型對(duì)淀粉樣變的治療和預(yù)后分析有非常重要的作用[16]。光鏡、免疫病理方法可診斷大部分AL型和AA型，但對(duì)于其他類型的淀粉樣變則難以鑒別。LMD/MS方法可直接鑒定出淀粉樣物質(zhì)成分，而不是像傳統(tǒng)的免疫組化等檢查需要在腎活檢標(biāo)本上逐一進(jìn)行淀粉樣蛋白的檢測。

Sethi等應(yīng)用LMD/MS對(duì)2008–2010年127例腎活檢診為淀粉樣變的患者剛果紅染色陽性的FFPE腎小球組織進(jìn)行分析，結(jié)果顯示淀粉樣沉淀物中含有Ig輕鏈和重鏈、急性期血清淀粉樣蛋白A、白細(xì)胞源性趨化因子-2 (Leukocyte Cell Derived Chemotaxin-2, LECT-2)、纖維蛋白原-α鏈、轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白、載脂蛋白A-I和A-IV、凝溶膠蛋白和β-2微球蛋白。研究者認(rèn)為如質(zhì)譜結(jié)果中有一種淀粉樣蛋白與載脂蛋白E(Apolipoprotein E, ApoE) 及血清淀粉樣P成分(Serum amyloid P component, SAP) 同時(shí)存在，則可診斷淀粉樣變由此種淀粉樣物質(zhì)造成[17]。例如，兩例淀粉樣變患者的腎組織質(zhì)譜結(jié)果中分別有高譜圖數(shù)的LECT2和纖維蛋白原α與Apo E及SAP同時(shí)出現(xiàn)，則兩位患者分別為LECT2和纖維蛋白原α型淀粉樣變。研究者推薦對(duì)剛果紅染色及電鏡診斷的淀粉樣變性患者，免疫熒光輕鏈或輕鏈/重鏈均陽性則可診為AL或AL/AH型淀粉樣變；免疫熒光結(jié)果不確切或陰性的病例，則可用免疫組化或LMD/MS蛋白質(zhì)組學(xué)方法進(jìn)行分型，而蛋白質(zhì)組學(xué)方法是目前淀粉樣變性最好的分型方法，該方法用于確定淀粉樣變類型的敏感性和特異性可達(dá)到90%以上[18]。

2.2 淀粉樣變性、纖維樣腎小球病和免疫觸須樣腎小球病的鑒別診斷

纖維樣腎小球病 (Fibrillary glomerulonephritis, FGN) 和免疫觸須樣腎小球病 (Immunotactoid glomerulopathy, ITG) 指腎小球內(nèi)存在類淀粉樣纖維物質(zhì)或中空的微管狀纖維沉積，而剛果紅染色陰性的一組少見的腎小球疾病，其診斷主要依靠電鏡。FGN于電鏡下見腎小球系膜區(qū)及上皮下無分支的、無序排列的纖維狀結(jié)構(gòu)沉積，直徑16–24 nm；光鏡下常表現(xiàn)為系膜結(jié)節(jié)狀硬化或MPGN；免疫熒光約94%病例可見IgG沉積，其中以IgG4沉積為主，80%可見κ鏈沉積[19-20]。ITG確診主要依電鏡下系膜區(qū)和/或腎小球基底膜內(nèi)見無分支、成束或平行排列，直徑30–50 nm的中空微管狀物沉積[21]；光鏡也以系膜結(jié)節(jié)狀硬化或MPGN為常見；免疫熒光有IgG、IgM、IgA、C3及κ、λ鏈沉積。FGN和ITG的病因及發(fā)病機(jī)制不清，免疫電鏡證實(shí)FGN纖維絲有IgG、C3和P物質(zhì)共沉積；有研究提示ITG可能是獲得性上皮細(xì)胞功能缺陷導(dǎo)致的免疫球蛋白清除障礙，從而引發(fā)腎小球內(nèi)特殊蛋白沉積[22-23]。

有學(xué)者分別對(duì)淀粉樣變、FGN、ITG及冷球蛋白血癥患者腎活檢FFPE組織行LMD/MS分析，并用移植腎供者標(biāo)本為正常對(duì)照[24]。結(jié)果顯示，淀粉樣變中，ApoE呈高譜圖數(shù)，SAP、Ig恒定區(qū)呈中到高譜圖數(shù)，ApoE與Ig恒定區(qū)比例大于1；而FGN中缺乏SAP，ApoE呈中或低譜圖數(shù)，與Ig恒定區(qū)的比例為1∶1；在ITG組織中，ApoE呈低譜圖數(shù)，Ig恒定區(qū)呈高譜圖數(shù)，兩者之比為1∶3。作者認(rèn)為，這些特殊蛋白沉積需要ApoE的參與，ApoE的量決定了蛋白沉積的方式。ApoE與淀粉樣蛋白比值越高，越易形成細(xì)的纖維樣蛋白沉積；隨著比值的降低，F(xiàn)GN和ITG形成了較粗的纖維和管狀蛋白沉積。LMD/MS技術(shù)在這3種腎小球疾病鑒別診斷方面的結(jié)果還需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步證實(shí)。

2.3 膜增殖性腎小球腎炎

MPGN是一種治療效果不好，預(yù)后較差的腎小球疾病。病理表現(xiàn)為系膜細(xì)胞和基質(zhì)增多及腎小球毛細(xì)血管壁增厚。根據(jù)電鏡下電子致密物的沉積部位，將MPGN分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型。隨著對(duì)補(bǔ)體在MPGN發(fā)病機(jī)制中認(rèn)識(shí)的不斷深入，根據(jù)免疫熒光結(jié)果，將該病分為免疫復(fù)合物相關(guān)和非免疫復(fù)合物相關(guān)MPGN，后者又稱為C3 腎小球腎病 (C3 glomerulopathy，C3GP)。C3GP患者免疫熒光下C3陽性而Ig陰性[25]，又可分為電子致密物沉積病 (Dense Deposit Disease，DDD)和C3腎小球腎炎 (C3 glomerulonephritis，C3GN)，兩者區(qū)別在于電鏡下嗜鋨性致密物沉積部位不同[26]。由于對(duì)其致密物的成分及致病機(jī)制不清楚，因而治療棘手。

Sethi等[8-9]對(duì)C3GN和DDD患者腎活檢FFPE組織行LMD/MS分析，發(fā)現(xiàn)C3GN和DDD腎組織中均有補(bǔ)體替代途徑和終末激活產(chǎn)物，其中C3和C9的譜圖數(shù)明顯增高，而Ig及經(jīng)典補(bǔ)體激活成分如C1、C2或C4無明顯沉積，證實(shí)了C3GP中補(bǔ)體替代途徑的異常[26]。此外，LMD/MS分析還發(fā)現(xiàn)DDD和C3GN患者腎小球中有可溶性膜攻擊復(fù)合物 (Soluble membrane attack complex) 的表達(dá)，為C5a抑制劑eculizumab治療C3GP提供了依據(jù)[27]。

3 展望

LMD/MS技術(shù)在淀粉樣變及MPGN等腎臟疾病臨床研究中已有一些重要發(fā)現(xiàn)，顯示出較好的臨床應(yīng)用前景。目前LMD/MS技術(shù)還存在某些缺陷，如獲取的樣本量少、樣品處理過程中易出現(xiàn)污染，F(xiàn)FPE組織蛋白提取不完全及蛋白提取中的副產(chǎn)物會(huì)影響LC-MS/MS分析結(jié)果[11]。未來需要在更好的FFPE組織蛋白提取方法及多中心研究的基礎(chǔ)上，建立標(biāo)準(zhǔn)化的FFPE樣本處理程序。應(yīng)用更靈敏的儀器及更精確的定量方法[5]，可進(jìn)一步提高蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)質(zhì)量及檢測的可重復(fù)性。

總之，LMD/MS技術(shù)利用腎活檢FFPE組織進(jìn)行靶目標(biāo)蛋白的顯微切割，可以提供病變部位蛋白質(zhì)組學(xué)信息，從而為某些發(fā)病機(jī)制不清、診斷困難的腎臟病提供一個(gè)新的輔助檢查手段[28]。隨著質(zhì)譜分析和生物信息學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，蛋白鑒定的敏感性和準(zhǔn)確性不斷提高，LMD/MS技術(shù)與其他免疫學(xué)診斷方法 (如蛋白印跡、免疫組化等)相結(jié)合，在探索腎臟病的發(fā)病機(jī)制、尋找新的生物標(biāo)志物、輔助診斷及指導(dǎo)治療等方面將發(fā)揮越來越大的作用。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Laser microdissection and mass spectrometry based proteomics in the diagnosis of kidney diseases

Ying Sun1, Mingxi Li1, Yubing Wen1, Xuemei Li1, Jian Sun2, and Wei Sun3
1 Department of Nephrology, Peking Union Medical College Hospital, Peking Union Medical College, Chinese Academy of Me dical Sciences, Beijing 100730, China 2 Department of Pathology, Peking Union Medic al College Hospital, Peking Union Medical College, Chinese Aca demy of Medical Sciences, Beijing 100730, China 3 Department of Core Instrument Facility, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences, Peking Union Medical College, Beijing 100730, China

In recent years, laser microdissection followed by mass spectrometry (LMD/MS) has been successfully applied to the proteomic studies of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) renal tissues. This new technique improves the diagnosis of kidney diseases and has a better potential for future clinical application. The review focuses on the use of this methodology for exploring the mechanisms, diagnosis and classification of kidney diseases including renal amyloidosis and membrane proliferative glomerulonephritis.

laser microdissection, FFPE proteomics, renal amyloidosis, membrane proliferative glomerulonephritis

February 22, 2014; Accepted: June 16, 2014

Mingxi Li. Tel: +86-10-69155351; Fax: +86-10-69155056; E-mail: mingxili@hotmail.com Wei Sun. Tel/Fax: +86-10-69156943; E-mail: sunwei1018@sina.com

孫穎, 李明喜, 文煜冰, 等. 激光顯微切割/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在腎臟疾病診斷中的應(yīng)用進(jìn)展. 生物工程學(xué)報(bào), 2014, 30(7): 1134–1140.

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Supported by: Young Scientific Research Fund of PUMCH (No. 20132755), Key Projects in the National Science and Technology Pillar Program during the twelfth Five-Year Plan Period (Nos. 2011BA110B00, 2011BA110B05), Health and the Welfare Industry Research Special Funds (No. 201002010), Novo Nordisk Union Diabetes Research Talent Fund (2014).

北京協(xié)和醫(yī)院青年科研基金 (No. 20132755)，“十二五”國家科技支撐計(jì)劃 (Nos. 2011BA110B00, 2011BA110B05)，衛(wèi)生公益行業(yè)科研

專項(xiàng)基金(No. 201002010)，諾和諾德協(xié)和糖尿病英才研究基金 (2014年) 資助。